鲜植物叶片，按照材料与提取剂质量体积比1:3的比例加入预冷丙酮和少许石英砂研磨成匀浆后，转入离心管于12000g、4°C下离心20min，弃去残渣，上清即为样品提取液。分别用ddH20配制试剂A(内含3.3 mmol/L FeSO4,
3.3 mmol/L (NH4 ) 2S04，412.5 mmol/L H2SO4)和试剂 B (内含 165 μ mol/L 二甲酚橙，165mmol/L山梨醇)，使用前试剂A和试剂B按照体积比1:10的比例混合构成工作试剂。此工作试剂与H2O2待测液按照体积比2:1的比例混合，30°C水浴显色30min，于560nm处测定OD值，计算H2O2含量(图1)。
[0012]2、质膜蛋白提取和浓度测定:不同抗坏血酸浓度喷施的蚕豆叶片质膜提取使用贝博试剂有限公司的试剂盒进行。提取后的质膜蛋白用Bradford法测定质膜蛋白浓度，在800 μ L的CldH2O中加入5 μ L的质膜蛋白，混匀，然后加入200 μ L的Bradford溶液，室温静置10分钟，测定OD595,计算50 μ g质膜蛋白对应的体积。
[0013]3、H+ -泵活性测定步骤如下:
(1)1.5ml 反应体系中含有 5 mmol/L BTP/MES (pH 6.0) ,12 μ mol/L Α0、300 mmol/LKCl>250 mmol/L 鹿糖、0.5 mmol/L EGTA (使用 BTP 调 pH 至 6.0)、I mmol/L NaN3> I mmol /L Na2MoO4>50 mmol/L KNO3,0.05%十二烧基聚乙二醇醚(w/v)和100 Ug质膜蛋白，添加去垢剂十二烧基聚乙二醇醚使原位膜翻转，反应混合液在室温下放置20 min后,加入5 mmol/L ATP - BTP (pH=6.0)混合液以启动反应；
(2)以反应液调零对照，每分钟记录一次OD值，测定吖啶橙在492nm处8分钟内吸光度猝灭速率，通过猝灭速率反映不同抗坏血酸喷施浓度的蚕豆叶片细胞膜囊体泵出H+的能力，即H+-泵活性(图2)。
[0014]从图1可以看出，喷施不同浓度的抗坏血酸后，蚕豆叶片的H2O2含量和未喷施抗坏血酸的柜内植株相比均有不同程度的减少；2 mmol/L抗坏血酸处理组H2O2含量减少最多，甚至低于未喷施抗坏血酸的柜外植株；抗坏血酸浓度再升高，H2O2含量不再有明显变化。从图2可知，喷施不同浓度的抗坏血酸后，蚕豆叶片的H+ -泵和未喷施抗坏血酸的柜内植株相比有不同程度的恢复，2 mmol/L ASA处理组H+-泵活性恢复最强。H2O2和H + -泵是植物气孔开放活动中的重要调节因子，H2O2含量减少和H + -泵活性增强都有助于气孔开度或导度的增加，从而促进气孔开放。
[0015]实施例3:叶片气孔开度测定
取实施例1第3步中处理了 I小时的叶片，撕取下表皮，置于盖玻片上，滴加一滴生理盐水，盖上盖玻片，于中倍镜下观察并测量气孔开度，每个浓度随机测量40个，取平均值(图 3)。
[0016]从图3看，不同浓度抗坏血酸喷施后蚕豆叶片气孔开度有不同程度的恢复，但2mmol/L ASA对蚕豆叶片气孔开度的恢复程度最大。
[0017]实施例4:在实施例1第3步中处理I小时后，开始记录密封仓空气中剩余甲醛浓度，10分钟记录一次,连续记录100分钟(图4)。并对密封仓中喷施了不同浓度抗坏血酸的蚕豆叶片细胞中游离甲醛含量进行了测定。测定方法如下:
取1.0g蚕豆叶片加ImL Tris提取液液氮研磨勻楽；,转入离心管于12000g、4°C下离心20min，弃去残渣，上清液加入I mL Nash试剂(乙酰丙酮:0.2%，冰醋酸:0.3%，醋酸铵:15%)，30°C保温30分钟之后测定0D.，根据标准曲线计算出叶片中游离甲醛的浓度。
[0018]从图5看，甲醛胁迫Ih后，放置喷施了抗坏血酸蚕豆植株的密封仓内空气甲醛下降速度比放置没有喷施抗坏血酸蚕豆植株的密封仓内快，其中喷施了 2 mmol/L抗坏血酸的蚕豆使密封仓内空气甲醛减少更多。图5证明了密封仓中空气甲醛减少与蚕豆叶片吸收的甲醛量有关，喷施了 2 mmol/L抗坏血酸的蚕豆叶片吸收的甲醛最多，这说明该浓度的抗坏血酸对蚕豆叶片提高吸收甲醛的能力作用最大。
[0019]实施例5:根据上述蚕豆叶片细胞H2O2含量、气孔开度、细胞质膜H + -泵活性、密封仓中剩余甲醛浓度和叶片细胞中游离甲醛的含量测定结果，筛选出2 mmol/L为抗坏血酸喷施的最佳浓度。为了验证2 mmol/L抗坏血酸在植物对真实室内环境中气体甲醛污染的净化能力的促进作用，用2 mmol/L的抗坏血酸处理液喷施蚕豆叶片下表皮，以下表皮布满水珠而不滴下为每张叶片的喷施量，待抗坏血酸处理液处理时间8小时后，将蚕豆放入释放气体甲醛日平均浓度为4mg/m3的旧家具柜中，家具柜三面由压缩板材(59Λ 4(T 48cm)、一面由玻璃门构成，将长有蚕豆植株的花盆放入柜内后封闭柜门，胁迫处理48h,分别取样测定柜外、柜内(未喷施抗坏血酸)和柜内十抗坏血酸(柜内喷施抗坏血酸)的植株叶片细胞中抗坏血酸含量和H+ -泵活性。每个处理设置三个重复，以水喷施叶片下表皮并放在柜内和柜外的蚕豆植株为对照。控制柜内和柜外的光照、温度和相对湿度等条件在相近的水平，光照和黑暗处理时间设定为12h/12h，实验期间昼夜气温变化和花盆密封方法同上。
[0020]从图6、7可以看到，在甲醛污染环境中，柜内喷施了抗坏血酸的蚕豆叶片和未喷施抗坏血酸的蚕豆叶片相比，H2O2积累明显下降(图6)，H + -泵活性明显升高(图7)。这说明2 mmol/L的抗坏血酸消耗了蚕豆叶片细胞中H2O2，并使甲醛胁迫下蚕豆叶片细胞膜的H+-泵活性得到回升。
[0021]实施例6:同实施例5处理，测定48h柜内未喷施抗坏血酸和柜内喷施抗坏血酸的蚕豆叶片的气孔开度和导度(图8、9)。
[0022]从图8和图9可知，由于气体甲醛胁迫，柜内蚕豆叶片的气孔开度和导度都明显下降，但喷施抗坏血酸后，受甲醛胁迫的柜内蚕豆叶片气孔开度和导度都得到了明显的恢复。由此可知，2 mmol/L的抗坏血酸有助于真实的甲醛污染空气环境中植物叶片气孔开度和导度的提高，从而促进植物吸收甲醛，净化甲醛污染。
【主权项】
1.抗坏血酸在提高植物净化空气甲醛污染中的应用。
【专利摘要】本发明公开了抗坏血酸在提高植物净化空气甲醛污染能力中的应用；使用时，采用抗坏血酸溶液对盆栽蚕豆叶片下表皮进行喷施，8小时后将蚕豆植株分别放入含有14.8mg/m3和4mg/m3气体甲醛的空气环境中，在14.8mg/m3甲醛胁迫环境中处理1h及4mg/m3甲醛胁迫环境中处理48h后分别进行叶片生理生化指标的测定；实验结果表明，与对照植株相比，喷施抗坏血酸后，蚕豆叶片细胞中的H2O2积累减少，H＋-泵活性和气孔开度均提高，这些变化有助于提高植株气孔开放活动，提高了叶片对甲醛的吸收率，从而加强了植株净化空气甲醛污染的能力；以上结果说明适宜浓度的抗坏血酸喷施植物叶片能提高植物净化空气甲醛污染的能力。
【IPC分类】A01G7-06
【公开号】CN104584897
【申请号】CN201410839539
【发明人】陈丽梅, 孙慧群
【申请人】昆明理工大学
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2014年12月30日