用于诱导植物对病原体例如致病疫霉的天然防御的包含至少一种酚类化合物的植物提取物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本实施方案涉及一种植物提取物及其在保护植物免受病原体攻击中的用途。特别 地，本实施方案涉及一种植物提取物，其在施用于植物或作物时帮助保护植物或作物免受 感染而对导致感染的病原体无直接毒性。
[0002] 背景 尽管全世界的植物疾病管理政策在持续发展，但现代农业仍面对破坏性的植物疾病。 最重要的疾病之一为导致每年十亿美元损失的由卵菌纲致病疫霉所导致的马铃薯晚疫病。 当前该疾病的控制策略主要为施用抗真菌剂和繁殖具有显性抗性基因的品种。该病原体因 为其克服抗性的能力而众所周知，并且这是总是需要探宄许多控制策略的原因。
[0003] 现有技术教导了各种各样的植物保护材料。已经使用了对植物病原体生长具有 作用的来自植物的天然抗微生物代谢产物。用牡丹SWiTrwiico 1Sa)和常春藤 (Zfeofera AWiz)的乙醇植物提取物达到了对马铃薯植物晚疫病发展的抑制，此二者均抑制 致病疫霉游动孢子释放和萌发（RShner等2004)。波叶大黄（TPAe腫和加拿 大一枝黄花的植物提取物通过直接抑制致病疫霉生长降低马铃薯 叶子上的致病疫霉生长（St印han等2005)。大蒜汁的抗细菌、抗真菌和抗卵菌活性已有报 道，并且发现其降低马铃薯植物中的晚疫病严重性（Slusarenko等2008)。显示抗马铃薯 致病疫霉效能的一个市售产品为Elot-Vis?，其基于乙醇植物提取物（St印han等2005)。 Elot-Vis?显示抗马铃薯作物致病疫霉的效果，但仅仅在致病疫霉接种前一天施用时减缓 疾病（Stephan等2005)。Elot-Vis?对病原体具有直接毒性（Stephan等2005)。
[0004] 施用一些植物防御诱导剂取得的有前景的结果提示在综合疾病管理程序中可利 用诱导抗性的原理。
[0005] 对致病疫霉的抗性已经与多种酚类化合物如绿原酸、对香豆酸、阿魏酸、迷迭香 酸、水杨酸、4-羟基苯甲醛和4-轻苯酸盐的作用相联系（Coquoz等1995; Widmer和 Laurent 2006)。已将文献中通常报道的酚类化合物功能归为两种主要功能。酚类化合物 可对病原体具有直接毒性（抗微生物）作用，例如可溶性酚酸，或其可通过强化细胞壁使其 更能抵抗细胞壁降解酶诱导对病原体的屏障，例如细胞壁-结合酚类。
[0006] 发明简述 一个目标为提供可诱导植物对生物胁迫的防御的天然试剂。
[0007] -个特别的目标为提供这样的试剂，其可用于对抗植物病原体，特别是导致晚疫 病的致病疫霉。
[0008] 这些和其它目标通过本文所公开的实施方案满足。
[0009] 实施方案的一个方面涉及包含至少一种酚类化合物并且可从碳酸化甜菜根汁的 固体部分获得的植物提取物。
[0010] 在一个特别的但任选的实施方案中，植物提取物通过使用溶剂从碳酸化甜菜根汁 的固体部分提取获得。
[0011] 在另一个特别的但任选的实施方案中，植物提取物包含浓度大于5 Pg/ml、优选至 少10 Kg/ml的对羟基苯甲酸。
[0012] 在一个进一步特别的但任选的实施方案中，植物提取物保护植物免受病原体感 染，但在适合施用于植物的工作浓度对病原体无毒性。
[0013] 实施方案的另一个方面涉及包含上述植物提取物和至少一种植物信号传导剂和/ 或杀真菌剂的组合物。
[0014] 实施方案进一步的方面涉及诱导植物对生物胁迫的抗性的方法和治疗、抑制或减 少植物晚疫病的方法。这些方法包括为植物施用上述植物提取物和/或组合物。
[0015] 实施方案的又一个方面涉及制造包含至少一种酚类化合物的植物提取物的方法。 所述方法包括混合溶剂与碳酸化甜菜根汁的固体部分。让混合物沉降以形成上清液和沉降 固体。从沉降固体分离上清液并用于生产植物提取物。
[0016] 本发明实施方案提供能够诱导植物对病原体感染的天然防御的免疫增强植物提 取物。该植物提取物能够在植物中达到此保护效果而本身在用于治疗植物的浓度下不对病 原体产生毒性。
[0017] 附图简述 实施方案，以及进一步的目标和其优点，通过参考下列描述连同附图可最好地理解，其 中： 图Ia图解了用自来水（对照）、甜菜提取物（SBE) (20 %/自来水）和ΒΑΒΑ ( β -氨 基丁酸，0.3 g/Ι/自来水）喷射、接种致病疫霉（15 000孢子囊/ml)的Desiree植物感染 后（dpi) 4-7天在温室生长植物离体叶片测定中病变大小的外观。BABA-处理叶片上的小 坏死点仅在该处理中检测到。
[0018] 图Ib-Id图解了马铃薯植物感染后6天（6 dpi)病变大小的测量结果。叶片来自 Desiree (图lb)、Bintje (图Ic)和Ovatio (图Id)。数据显示每个基因型的两个组合 实验的病变测量结果（以_计）的平均值，误差棒代表两个组合实验（每个用12个叶片 进行）的平均值的标准误差。不同字母代表根据Tukey多范围检验统计学上互不相同的数 据（P〈 〇· 05) 〇
[0019] 图2图解了 Desiree感染后10天（10 dpi)的孢子囊产生。在离体叶片测定中， 取用水、SBE和BABA (0.3 g/Ι)处理的Desiree植物的叶片并接种致病疫霉（15 000孢子 囊/ml)。数据显示两个组合实验的孢子囊浓度的平均值，误差棒代表两个组合实验（每个 用12个叶片进行）平均值的标准误差。不同字母代表根据Tukey多范围检验统计学上互 不相同的数据（P〈 0.05)。
[0020] 图3a图解了 SBE对病原体致病疫霉菌丝生长的直接作用。致病疫霉在豌豆琼脂 上生长后7天，将无菌纸盘（直径12 mm)放置在豌豆琼脂培养基上所生长的致病疫霉菌丝 集落对边外5 mm处。纸盘用80 μ 1水（A)或SBE (B)浸渍。2至3天后，检查浸渍纸盘位 点周围的菌丝生长。
[0021] 图3b图解了孢子囊溶液的显微镜检查所显示的孢子囊萌发百分比。用1 %乙醇 (EtOH)和SBE处理的样品在培养箱中于21°C在黑暗中孵育1天后在4个随机选择的显微 镜视野中估算萌发的孢子囊的百分比。实验以总体积I ml (在Eppendorf管中）使用3 个重复进行。孢子囊浓度为40 000孢子囊/ml，SBE终浓度为20%，EtOH终浓度为1 %。数 据显示两个组合实验的孢子囊萌发的平均百分比，误差棒代表两个组合实验（每个实验以 每种处理3个重复进行）平均值的标准误差。
[0022] 图4图解了马铃薯叶片中质外体蛋白的SDS-PAGE分析。分析了用水、BABA (0. 3 g/Ι)和SBE处理的三个不同马铃薯基因型叶片的质外体液的PR-I蛋白诱导。从左至右M : 分子大小标志；DC !Desiree 对照（水）；DB !Desiree BABA (0· 3 g/L) ;DE !Desiree 提取物 (SBE) ;OC :Ovatio 对照；OB :Ovatio BABA ;OE :Ovatio 提取物（SBE) ;BC :Bintje 对照；BB : Bintje BABA ;BE:Bintje提取物（SBE)。每孔上样每个样品的30 μL，等于从每个样品提取 的总质外体液的1/6。
[0023] 图5图解了 SBE在280 nm处的HPLC概况和所检测到酚类化合物的紫外光谱实例 (峰上的编号对应于在波长范围200-400 nm处扫描的紫外光谱编号）。峰1 :对羟基苯甲 酸；峰2 :香草酸；峰3 :表儿茶素没食子酸酯；峰4 :异阿魏酸；峰6 :肉桂酸。
[0024] 图6图解了对照植物（C)和使用20 %甜菜提取物（SBE)喷射3次（间隔1周）的 植物的田间试验。Bint je植物用20 % SBE再次喷射3次（间隔1周）。所给出的为Bint je 和Ovatio感染后11天感染叶片的百分比。
[0025] 图7A和7B图解了甜菜提取物（SBE)(图7A)和Speedi-Beet提