一种新油茶林高产栽培的分子设计方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及通过分子识别设计油茶的高产栽培配置格局，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 油茶与油橄榄、油棕、椰子并称为世界四大木本油料植物，在我国已有2300多年 的栽培历史。油茶籽榨取的茶油是优质的绿色保健食用油，营养价值高，联合国粮农组织已 将其列为重点推广的健康型高级食用油。油茶经济价值高、生态功能强，是我国特有的经济 效益和生态效益倶佳的优良乡土树种之一，在南方经济林产业中占有十分重要的地位。至 2014年底我国油茶面积达5095万亩，而现有加工能力是原料供应量的4倍，为保障国家食 用油安全，国家林业局的《全国油茶产业发展规划（2009-2020)》，到2020年油茶林基地达 到7018. 1万亩。但我国现有大面积油茶林单产低，2008年亩产茶油5. 79公斤，同时缺乏科 学可靠的丰产林营造技术体系，难以达到规划要求。
[0003] 我国学者对影响油茶坐果和产量的内因和外因进行了一系列研究，如开花习性 (曾燕如等，浙江林学院学报，2009, 26 (6) : 802-809)、开花授粉特征（王湘南等，中南林业 科技大学学报，2013,33(12):1-5)、花期气候对花后坐果影响（曾燕如和黎章矩，浙江林学 院学报，2010, 27 (3) : 323-328)、授粉授精过程（廖婷等，林业科学，2014, 50 (2) : 51-55)、 利用生长调节剂保花保果、地块选择、良种壮苗、合理栽植、抚育管理、修剪和施肥（陈彦 镜，农业和技术，2014,（1) :81-83)、病虫害防治和林分结构优化（李雁鸣等，安徽农业科 学，2013,41 (33) : 12898-12899)及嫁接和截干更新等（邓荫伟等，中国林副特产，2013， (6) : 19-22)。结果表明，自花和同株异花传粉、树龄过小或过老、品种的优劣、病虫害和机械 损伤等均是造成油茶落花落果的主要原因。
[0004] 另外，油茶自花授粉成果率低于同株异花授粉成果率、同株异花授粉成果率又低 于异株异花授粉成果率。油茶冠大、花多，传粉者常在同株不同花间访问，易造成同株异花 传粉和自花传粉，因此常发生自交不亲和的现象，造成落果。但到目前为止，没有形成建设 油茶异交林的技术标准，从而无法从根本上提高油茶产量、实现油茶的高产高效。
[0005] 现有技术主要采用芽砧嫁接苗营造新油茶林，按此方法营造的新油茶林如果相邻 植株为自亲不亲和（SI)的同一基因型，自交败育更易发生，从而形成低产林。目前还没有 从根本上解决如何避免油茶林自交败育的问题的方法。因此，明晰油茶种质间的亲缘关系 和可配性，建立异交丰产林营造模式对提高油茶产量具有重要意义。
【发明内容】
[0006] 针对上述问题，本发明以优良无性系油茶为材料，根据不同种质间的Nei氏遗传 距离设计不同的授粉组合，并根据不同授粉组合的着果率和成果率优选出最适种质组合， 再以高异交传粉配置格局设计高产栽培模式，实现油茶产量提高。本发明的技术方案如下： 一种新油茶林高产栽培的分子设计方法，由以下顺序的步骤组成：
[0007] (1)选择不同油茶种质，分别提取其DNA;
[0008] (2)筛选适用于油茶的SSR标记引物；
[0009](3)利用筛选出的SSR标记引物，计算不同油茶种质间的Nei氏遗传距离；
[0010] (4)将Nei氏遗传距离划分为11个级别，在每个级别内，设计不同的授粉组合，分 别进行人工授粉；
[0011] (5)在人工授粉后的第30天统计并计算着果率，第180天统计并计算成果率；得 到配合力最佳的油茶Nei氏遗传距离范围；
[0012] (6)以步骤（5)得到Nei氏遗传距离范围内的油茶种质为种苗，设计油茶林高产栽 培模式。
[0013] 进一步的，所述步骤（1)提取DNA的方法为改良CTAB法。
[0014] 进一步的，所述步骤（2)筛选SSR标记引物的方法包括如下步骤：
[0015] 1)利用RNA-Seq技术开发油茶的SSR标记序列；
[0016]2)采用PrimerPremier5. 0软件设计特异引物：参数为：引物长度（20~24nt)、 3'端稳定性（-6. 0~-9.Okal/mol)、引物Tm值（55~60°C)、GC含量（45~55% )、引物 rating值>90。以不同油茶种质的DNA为模板，进行PCR扩增，根据聚丙烯酰胺垂直凝胶 电泳结果，筛选出SSR标记引物。
[0017] 进一步的，步骤（6)所述油茶林高产栽培模式，油茶的株行距为2mX3m，种质组合 间的Nei氏遗传距离为0. 431-0. 480。
[0018] 进一步的，步骤（6)所述油茶林高产栽培模式，油茶的株行距为3mX2m，种质组合 间的Nei氏遗传距离为0. 431-0. 480。
[0019] 本发明根据利用SSR标记检测的不同油茶种质间的Nei氏遗传距离选配出最适的 授粉组合：Nei氏遗传距离为0. 431-0. 480的授粉组合为最佳，异交授粉的着果率和成果率 分别达80%和59%以上，以高异传粉配置格局成功设计新油茶林高产栽培的分子营林模 式，为我国大面积建设新油茶经济林，发展油茶产业提供了高产栽培的技术基础。
[0020] 本发明的有益效果如下：
[0021] (1)本发明的分子识别方法操作简单，易推广扩大使用；
[0022] (2)使用本发明提供的分子识别方法，筛选出Nei氏遗传距离范围0. 431-0. 480的 授粉组合为最佳，异交授粉的着果率和成果率分别达80%和59%以上，极大的提高了油茶 的着果率和成果率；
[0023] (3)本发明提供了新油茶林高产栽培的分子营林模式，为我国大面积建设新油茶 经济林，发展油茶产业提供了高产栽培的技术基础。
【具体实施方式】
[0024] 下面结合实施例对本发明做进一步的说明，但这不限制本发明的范围，实施例以 玉屏油茶种质基地的49个油茶优良品种（无性系）为材料，分别为：3-18, 5-35, 5-35-1， 5-35-2,5-36-1，5-36-2,5-36-2,5-37,5-37-2, 5-37-3,5-38,5-39,5-39-2,5-40,5-41， 5- 42,5-42-2, 5-42-3,5-44, 5-44-2-1，5-44-3,5-45-1，5-45-2,5-47, 6-48,6-48-2, 6-49， 6- 53, 6-53-2,6-53-3, 6-54,6-54-1，6-55, 6-57,6-58,6-62, 6-62-2,6-62-3, 6-63,Y-41， Y-44,ZB1，岑软11号，独籽1号，湘210,湘林5号，湘林5,玉屏1，长林27 ;NaAc溶液的浓 度为 3mol/L，PH为 5. 2〇
[0025] 实施例1
[0026] -、选择最佳的油茶授粉组合的Nei氏遗传距离范围
[0027] (1)以49个油茶优良无性系品种为材料，利用改良CTAB方法分别提取其DNA，步 骤如下：
[0028] 1)将油茶叶片10克放入研钵，倒入适量液氮研磨后，移入预先加有700yL 2XCTAB离心管中，置于65°C水浴处理45~60min，离心（4°C，lOOOrpm，lOmin)得上清液 I;
[0029] 2)取步骤1)离心管中上清液I600yL于新离心管中，加入总体积为600yL的 酸、氯仿和异戊醇混合液（体积比为25 :24 :1)，摇勾后离心（4°C，lOOOrpm，lOmin)得上清 液II;
[0030] 3)取上清液II550yL于离心管中，加入500yL10XCTAB，摇匀后置于65°C水浴 中溶解2~3min，再加入总体积为50y