建立可应用于人类疾病研究的雪貂模型的方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物学领域，具体设及一种雪貂促排卵技术和一种雪貂体外受精技 术，W及基于上述方面的利用CRISPR/tas9的技术建立雪貂模型的方法，所述方法可应用 于系统研究人类疾病。
【背景技术】
[0002] 大脑是人类控制认知、记忆、情感和活动的功能器官，某些与大脑发育相关基因的 缺失或突变直接导致神经疾病的发生。高等哺乳动物的大脑皮层具有沟和回的结构，运一 结构大大的增加了大脑皮层的表面积，研究表明运与高级认知等大脑功能密切相关。
[0003] 雪貂作为新型实验动物，已经被广泛的应用于呼吸道疾病等的研究，但是并没有 在神经系统发育中普遍应用。虽然雪貂不属于灵长类动物，但是它与平滑脑的小鼠相比，雪 貂的大脑具有沟和回的结构，并且是有社会性的动物，因此，应用雪貂作为模式动物，研究 直接大脑发育型疾病W及精神类疾病的发病机理和临床治疗等，具有很大的现实意义。此 夕F，雪貂还具有体形小、易饲养、繁殖周期短、一胎多盧的优点，是研究神经系统疾病发病机 理的首选模式动物。
[0004] 雪貂之所W没有被神经科学研究广泛应用，其中主要原因是转基因动物无法实 现。随着CRISPR/tas9技术的发展，转基因动物制备变得相对简便[1，2]。
[0005] CRISPR/tas9运一编辑基因的技术已经广泛应用于各种物种，包括小鼠、大鼠、 猴等。W小鼠为例，主要实验过程如图1所示，将一个或者多个sgRNA(单向导RNA)和 化s9mRNA注射到受精卵里，sgRNA介导化s9核酸酶在小鼠受精卵的特定基因组位点上进行 切割、修复，导致基因被改变。
[0006] 由于雪貂作为实验动物并没有被广泛应用，鲜有关于转基因雪貂的报道。雪貂作 为实验动物的驯化和饲养条件要求比较严苛，而且生殖周期等生理习性并没有非常详尽 的研究资料，目前已经报道的唯一一例转基因雪貂，是通过病毒结合核移植的方法获得的 巧，4]，主要方法过程如图2所示。正常的雪貂体细胞经过定向基因修饰变为改变遗传学特 性的修饰后体细胞，然后在成熟的雪貂卵母细胞中通过显微操作的方法用修饰后的体细胞 的细胞核替换卵母细胞的细胞核。核移植后的卵母细胞经过发育，胚胎的基因就可W得到 相应的改变。
[0007] 然而，一方面，CRISPR/tas9作为新兴的技术，从未应用于雪貂运种模式动物；另 一方面，病毒结合体细胞核移植的方法比较复杂，操作性不高，效率低下，只有1-3%，而 且使转基因动物有可能带上病毒的风险，此外，目前已经报道的雪貂的超排方案是针对 Marshall化rret的，用于Angora化rret超排效率非常低，卵子不成熟，且无法做到雪貂的 体外受精，无法满足高效制备转基因雪貂的要求。
【发明内容】
[0008] 本发明针对现有技术中建立可应用于人类疾病研究的雪貂模型的方法的不足，一 方面提供一种雪貂促排卵技术和一种雪貂体外受精技术，另一方面，在上述基础上，利用CRISPR/tas9的技术，W3种基因（运S个基因都与神经系统疾病相关，一个是平滑脑症、一 个是头小崎形症、一个是精神分裂症）为例，建立可应用于神经系统疾病研究的雪貂模型 的方法，并将其用于相关疾病的致病机理研究，相关药物的筛选和安全性评价，W及临床手 术治疗研究的模式动物。
[0009] 本发明首次应用PMSG，F甜和HCG联合超排卵方法结合体外受精技术，使得转基 因雪貂的制备工作可W在尽量少的耗损实验动物的基础上顺利开展。在取得的雪貂受精卵 中，本发明首次应用CRISPR/tas9技术，对受精卵的特定的与神经系统疾病直接相关的基 因，包括化X，Aspm，Disci进行编辑，从而最终导致运S个基因突变，无法正常行使该基因 的生物学功能，获得类似于人类由于运=个基因突变而导致的神经系统疾病。
[0010] 具体而言，本发明包括W下方面：
[00川 1. 一种促进雪貂排卵的方法，所述方法使用PMSG(Pre即antMareSerum Gonadotropin)、FSH(FoilitropinAlfa)和HCG化umanChorionicGonadotropin)耳关合进 行。
[001引 2.根据第1项所述的方法，所述方法包括W下步骤：
[0013] 1)给母貂腹腔注射PMSG，优选注射200-300单位，更优选300单位；
[0014] 2) 24-48小时后，肌肉注射第一针FSH，此后连续注射8-10天FSH，每次的F甜注射 量优选为5-10单位，更优选为10单位；
[0015] 3)如果外阴肿胀，颜色由红变白则腹腔注射HCG，HCG的注射量优选为200-300单 位，更优选为300单位；
[0016] 4)取卵，取卵时间优选在HCG注射后40-48小时，更优选为HCG注射后48小时。
[0017] 3.根据第2项所述的方法，第1)步和第2)步之间间隔48小时。
[001引 4.根据第2项所述的方法，F甜的注射为每天两次，间隔12小时。
[0019] 5. -种雪貂体外授精方法，所述方法包括：
[0020] 1)取卵：手术取得雪貂的输卵管，用预热的肥ZB培养液经输卵管伞口冲出卵丘卵 母细胞复合体，用透明质酸酶消化成无卵丘细胞的单个卵母细胞，放入38. 5°C，5%C〇2预平 衡3小时的IVF培养滴中备用；
[0021] 2)体外受精：将公貂经附睾尾取出精液马上放入步骤1)中获得的含有卵母细胞 的IVF培养滴中，共解育，完成体外受精。
[002引 6.根据第5项所述的方法，所述共解育时间为3-4小时。
[0023] 7.根据第5项所述的方法，所述肥ZB培养液的组成为：81. 62mM氯化钢，4. 83mM 氯化钟，1. 18mM憐酸二氨钟，1. 18mM硫酸儀，5mM碳酸氨钢，1. 7mM二水合氯化巧，31. 3mM 乳酸钢，0. 27mM丙酬酸钢，20mMH巧es,ImM谷氨酷胺，0.ImM邸TA2化，5. 5mM葡萄 糖，0. 007%PVA，1N盐酸。
[0024] 8. -种建立雪貂模型的方法，所述方法包括W下步骤：
[0025] 1)针对目的基因设计sgRNA单向导RNA序列，并体外转录CAS9mRNA和sgRNA序 列；
[0026] 2)根据1-4任一项所述的方法促雪貂排卵；
[0027] 3)根据5-7任一项所述的方法进行雪貂体外受精；
[0028] 4)将步骤1)获得的化s9mRNA和目的基因的sgRNA显微注射入受精卵；
[0029] 5)将步骤4)获得的受精卵移植入受体进行妊娠；
[0030] 6)鉴定子代转基因雪貂。
[003。 9.根据第8项所述的方法，所述目的基因选自Aspm,Dcx,Disci。
[0032] 10.根据第8或9项所述的方法用于相关人类疾病研究及针对人类疾病的药物筛 选和/或安全性评价方面的用途。
[0033] 本发明首次使用PMSG，F甜和HCG联合促排卵，排卵稳定高效，达到25-35枚/ 只。而现有技术中仅有的可参考的超排方案是使用PMSG和HCG联合超排方案，效率低，卵 不成熟。此外，本发明首次使用雪貂的体外受精而不需要体外获能。另外本发明首次应用 CRISPR/tas9技术制备的转基因雪貂，相比之前唯一一例应用病毒结合体细胞核移植的方 法，效率提高很多，可W达到80%左右，并且没有病毒危害性。本发明的模型可W例如模拟 人由于Dcx基因突变或者Aspm基因突变引起的神经疾病，成为最为合适的疾病模式动物。 而之前已有的化X突变小鼠模型，因小鼠的大脑没有沟回，故不能复制人的疾病表型。
【附图说明】
[0034] 图1.应用CRISPR/tas9技术制备转基因小鼠示意图。
[0035] 图2.通过基因编辑体细胞核结合核移植的方法改变胚胎基因组的示意图。图 3.sgRNA的设计，其中对于每个基因设计了 2个sgRNA,其中灰色带下划线的GGT/GGA/GGG/ GGC序列为Protospacer-adjacentmotif(PAM)，其余灰色不带下划线的为基因干扰革己序 列。
[0036] 图4.S个不同品系的转基因雪貂经过T7EN1酶切鉴定，可W被酶切的是基因突变 雪貂，被星号标出。
[0037] 图5.S个不同品系的转基因雪貂经过测序分析具体的基因突变位点。与野生型 比较，删除的碱基用点表示，增加的碱基用小写字母标注。同时，括号内表示缺失了或者增 加了几个碱基，W及运种类型的结果在20个检测中所占数量。
[0038] 图6.Dcx转基因雪貂的大脑结构改变。转基因雪貂大脑皮层变薄、沟回变少、脑室 变大。
[0039] 图7.Aspm转基因雪貂的大脑结构改变。转基因雪貂大脑变小、沟回变浅。
【具体实施方式】
[0040] 实施例1.CRISPR/化s9祀向修饰基因载体构建和体外转录
[0041] 1)SgRNA转录载体的构建：针对雪貂Aspm(GenBankAccession No:XM_004756200) ,Dcx(GenBankAccessionNo:XM_004769082),Disci(GenBank AccessionN〇:XM_013047589)S个基因，设计了特异的SgRNA序列（图3)，具体序列参见 表1。
[0042] 表 1
[0043]
[0044] 每2条单链核酸序列（表2)退火形成双链DNA，双链DNA连接到 px330(Addgene，42230)载体中。
[0045] 表2.sgRNA克隆引物序列
[0046]
[0047] 2)化s9和SgRNA体外转录：利用表3中的引物将T7转录子通过PCR方法加入到 化s9和SgRNA的转录起始位点，化s9序列和参考文献凹中一致，PCR产物经过回收净化， 用mMESSAGEmMACHI肥T7ULTRA试剂盒化ifeTechnologies)进行体外转录。转录产生的 Cas9mRNA和SgRNA用MEGAclear试剂盒化ifeTechnologies)纯化并测量浓度。
[004引表3.连接T7转录子引物 [0049]
[0050] 实施例2.雪貂促排卵
[0051] 选择2-3岁，体重1. 5-2KG，3周左右未发情经产母貂，腹腔注射300单位 PMSG(Pre即antMareSerumGonadotropin)(宁波S生药业），48小时后肌肉注射第一针 FSHO^ollitropinAlfa)(MerckSerono) 10单位，此后连续注射10天，每天两次，间隔12小 时，每次10单位，在注射FSH后持续观察雪貂发情情况，如果发情，则腹腔注射300单位 HCG(HumanQiorionicGonadotropin