快速鉴别大型溞幼溞性别的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及大型潘生态毒理测试，具体地指一种快速鉴别大型潘幼潘性别的方 法。
【背景技术】
[0002] 生态毒理测试技术已经广泛地应用于新老化学品的生态风险评价。随着欧盟 REACH法规的实施，对进入欧盟的化学品生态安全的要求越来越严格，我国的化工产品出口 面临着挑战，对化学品进行严谨的生态毒理及安全评价是我国的化工产品走向国际化的前 提，因此生态毒理及安全评价技术显得尤为重要，对其技术水平的要求也越来越高。国家环 保局化学品登记中心编写了《化学品测试方法》来规范化与标准化各生态毒理与安全评价 测试机构的生态毒理测试方法。但是实际操作中发现部分生态毒理测试技术仍然存在一定 的问题，比如测试数据及测试结果尚未得到国际互认、实验过程繁琐、测试周期长等，各生 态毒理测试技术还有待进一步的完善与改进。
[0003] 大型潘作为国际公认的标准试验生物，大型潘生态毒理测试已经开展多年，美国 环保局在1978年就将大型潘毒理测试定为水体毒性试验的必测项目。20世纪80年代， 大型潘毒理测试得到了很大的重视和发展，大型潘繁殖、生长等慢性毒理试验逐步开展起 来。到了 20世纪90年代大型潘毒理测试技术得到更广泛的应用，用于评价工业废水、农 药、化学药品和水中沉积物对水环境的污染，为制定各种水质标准提供了科学依据。欧洲 经济合作与发展组织（0E⑶）自从20世纪80年代建立了潘类毒性测试的化学品测试导 则后，仍在不断对潘类毒性测试方法进行改进与完善。到目前为止0ECD对潘类毒性测试 的化学品测试导则已作了三次修订，修改的地方主要包括测试的潘类品种、化学品的暴露 时间、测试的大型潘总数量及组数、测试培养基与喂养条件等方面。大型潘生态毒理测试 技术具有广泛的技术前景，包括大型潘急性毒性试验与大型潘繁殖试验。0ECD最新标准 规定，大型潘繁殖试验中必须对新生幼潘的雌雄进行鉴定并确定新生幼潘的性别比（0E⑶ Test Guidelines Programme. Reports of the workshop on the Daphnia magna Pilot Ring Test, Shelffield University, U.K.，20_21Marchl993·)。大型潘个体较小（体长 1. 7-4. 8mm)，雌雄无法肉眼分辨，要对试验过程中的大量新生幼潘进行雌雄鉴别并计数是 非常繁琐、耗时的工作，如何快速而准确地对大量新生幼潘进行雌雄鉴定成为大型潘生态 毒理测试技术的技术难点。
[0004] 本发明提供一种快速鉴别大型潘幼潘性别的方法，这种方法解决新生幼潘雌性与 雄性鉴别工作量大、耗时过长的问题，达到减少人工工作量和降低测试成本的目的，可应用 于快速统计雌性幼潘和雄性幼潘的数量。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种快速鉴别大型潘幼潘性别的方法，这种方法解决新生 幼潘雌性与雄性鉴别工作量大、耗时过长的问题，达到减少人工工作量和降低测试成本的 目的，可应用于快速统计雌性幼潘和雄性幼潘的数量。
[0006] 为实现上述目的，本发明提供的一种快速鉴别大型潘幼潘性别的方法，包括以下 步骤：
[0007] 1)将待鉴定的新生雌性和/或雄性幼潘放置于诱导简易装置中的试管内，向试管 内加入16. 5cm高的GFID培养基，新生雌性和/或雄性幼骚在GFID培养基中适应lh，将试 管底部以上2. 5cm部分称为B体系，试管液面以下14cm部分称为A体系，其中GFID培养基 包括浓度分别为 192mg/L NaHC03、120mg/L CaS04.2H20、120mg/L MgS04、8mg/L KC1，其pH值 和硬度分别为7· 6~8· 0、160~180mg CaC03/L ;
[0008] 2)将步骤1)中的试管放置于诱导简易装置的试管架上，把诱导简易装置在光照 强度为30 μ EAm2. s)、温度为20°C条件下放置24h ;
[0009] 3)利用诱导简易装置的黑色塑料膜将经过步骤2)处理的新生幼潘置于黑暗环境 中5min后，每隔lmin分别对进入A体系或B体系中的雄性幼潘与雌性幼潘进行统计，并累 计20min内进入A体系或B体系中的雄性幼潘与雌性幼潘数量；
[0010] 4)步骤3)的统计结果为所有雌性幼潘进入A体系，所有雄性幼潘进入B体系。
[0011] 在上述方案中，所述步骤1)中，待鉴定的新生雄性幼潘是大型潘在温度为4°C、种 群密度为10只/100mL培养液、喂食浓度为0. 2mg (V (潘·(!)、光照周期为12h、黑暗处理时 间为12h的诱导条件下进行有性生殖得到的。大型潘在这样的诱导条件下，会改变它们的 生殖方式进行有性生殖，产生大量的雄性幼潘，为幼潘性别的快速鉴别方法提供试验材料。
[0012] 在上述方案中，所述培养液为M4培养液，所述M4培养液包括浓度分别为 2.8595mg/L Η3Β03、0· 3605mg/L MnCl2 · 4Η20、0· 306mg/L LiCl、0. 071mg/L RbCl、0. 152mg/ L SrCl2*6H20、0.016mg/L NaBr、0.063mg/L Na2Mo04*2H20、0.01675mg/L CuC12*2H20、 0.013mg/L CaCl2.2H20、0.01mg/L ZnCl2、0.00325mg/L CoCl2.6H20、0.00219mg/ L KI、0.000575mg/L Na2Se03、2.5mg/L NH4V03、0.9955mg/L Na2EDTA.2H20、293.8mg/L FeS04.7H20、123.3mg/L MgS04.7H20、5.8mg/L KCl、64.8mg/L NaHC03、10mg/L Na2Si03.9H20、 0.274mg/L KH2P04、0. 143mg/L NaN03、0. 184mg/L K2HP04、0.075mg/L盐酸硫胺、0.001mg/L氰 钴胺、〇.〇〇〇75mg/L钙长石。
[0013] 在上述方案中，所述诱导简易装置包括光照培养箱，所述光照培养箱内放置有试 管架，在所述试管架周围包裹有黑色塑料膜，所述试管架上放置有6支的试管，所述光照培 养箱在试管上方处设置有光照强度可以调整的光源。幼潘性别的快速鉴别方法采用上述装 置，操作简便，也利于光照强度、温度等参数的控制。
[0014] 在上述方案中，所述试管是口径为2. 5cm、长为20cm的玻璃试管。
[0015] 在上述方案中，所述光源设置在试管顶端上方15cm处。
[0016] 本发明的原理在于：M4培养液富含多种营养物质，可能会影响大型潘对环境因子 的行为反应，如光照强度和温度等，因此先将待鉴定雌雄的新生幼潘在GFID培养基先适应 lh，消除M4培养液对鉴别结果的影响；新生雌性幼潘与新生雄性幼潘对光照强度、温度等 环境因子变化的应急反应不相同，因此先将待鉴定雌雄的新生幼潘在光照强度为30 μΕ/ (m2. s)、温度为20°C条件下放置24h，接着黑暗环境中5min后，所有雌性幼潘进入Α体系， 所有雄性幼潘进入B体系。
[0017] 本发明的有益效果在于：这种方法可以快速鉴别新生幼潘的性别，解决新生幼潘 雌性与雄性鉴别工作量大、耗时过长的问题，达到减少人工工作量和降低测试成本的目的， 可应用于快速统计雌性幼潘和雄性幼潘的数量。
【附图说明】
[0018] 图1为诱导简易装置的结构示意图。
[0019] 图中：光照培养箱1 ;试管架2 ;黑色塑料膜3 ;试管4 ;光源5。
【具体实施方式】
[0020] 以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细描述，但该实施例不应该理 解为对本发明的限制。
[0021] 本发明快速鉴别大型潘幼潘性别的方法所使用的新生雄性幼潘是大型潘通过有 性繁殖得到的。我们先进行筛选大型潘有性繁殖的最佳诱导条件，以产生大量的雄性幼潘， 为幼潘性别的快速鉴别方法提供试验材料。我们设计多组如表1所示的试验，结果显示大 型潘在温度为4°C、种群密度为10只/100mL培养液、喂食浓度为0. 2mg (V (潘·(!)、光照周 期为12h、黑暗处理时间为12h的诱导条件下进行有性生殖，产生数量最多的雄性幼潘，为 幼潘性别的快速鉴别方法提供试验材料。
[0022] 本发明快速鉴别大型潘幼潘性别的方法所使用的诱导简易装置是我们自行设计 的，如图1所示，其包括光照培养箱1，光照培养箱1内放置有试管架2,在试管架2周围包 裹有黑色塑料膜3,试管架2上放置有六支口径为2. 5cm、长为20cm的玻璃试管4,光照培养 箱1在试管4顶端上方15cm处设置有光照强度可以调整的光源5。
[0023] 实施例1
[0024] 一种快速鉴别大型潘幼潘性别的方法，包括以下步骤：
[0025] 1)诱导简易装置左边三支试管4分别放置有10只24h内4°C诱导产生的新生雄 性幼潘，右边三支试管4分别放置有10只24h内4°C诱导产生的新生雌性幼潘。向试管内 加入16. 5cm高的GFID培养基，新生幼潘在GFID培养基中适应lh，将试管4底部以上2. 5cm 部分称为B体系，试管4液面以下14cm部分称为A体系，其中GFID培养基包括浓度分别为 192mg/L、120mg/L、120mg/L、8mg/L 的 NaHC03、CaS04 · 2H20、MgS04、KC1，其 pH 值和硬度分别 为 7· 6 ~8· 0、160 ~180mg CaC03/L ;
[0026] 2)将步骤1)中的试管4放置于诱导简易装置的试管架2上，把诱导简易装置在光 照强度为30 μΕΛπι2. s)、温度为20°C条件下放置24h ;
[0027] 3)利用诱导简易装置的黑色塑料膜3将经过步骤2)处理的新生幼潘置于黑暗环 境中5m