一种蒙药香青兰组织培养再生体系建立的方法
【专利说明】
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技术领域： 本发明属于生物技术领域植物组织培养方法，具体涉及蒙药香青兰组织培养再生体系 的建立方法。
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【背景技术】： 香青兰ffiWaKicaL.)，别名摩眼子，山薄荷，蓝秋花、玉米草、香花 子，等。其质量标准分别收载于内蒙古蒙药材标准、卫生部药品标准维药分册，还曾收载于 1977年版中国药典，唇型科青兰属一年生草本植物，药用部位为地上全草，主要分布于我 国华北、东北、西北大部分地区，特别是内蒙古和新疆。蒙古名为毕日阳古，是极具开发潜力 和民族特色的天然药用植物，具有缓解心绞痛、改善心肌缺血、降低血粘度和血小板聚集率 等功效作用。除作为中草药外，香青兰因含有大量的挥发油，是制备柠檬香系香料的重要原 料。此外，香青兰幼嫩的茎叶可作为特菜食用，干的茎叶和种子可制作茶、调味料或制作香 料。香青兰以其蕴藏的多功能医疗保健作用和独具特色的香味成为一种极具开发潜力的天 然药用植物资源和芳香植物资源。
[0003] 近年来，随着国家"中药现代化与产业化开发"行动的推进，对香青兰的开发利用 得到了迅猛发展，而原材料的获取主要靠野外采挖，野生香青兰的资源保护与抚育、引种与 驯化正在全面展开。香青兰主要靠种子繁殖，但它的种子非常小，且不宜保存易丧失活力。 植物组织培养与再生体系的建立是快速繁殖植物优良品种脱毒苗的重要途径，而对香青兰 进行组织培养获得再生植株的研究至今未见报道。为及时有效的保护与开发蒙药香青兰， 保证其可持续利用，本发明以香青兰无菌苗的下胚轴为外植体，通过愈伤组织诱导、分化、 增殖、生根、炼苗、移栽等系列过程成功获得了香青兰再生植株，建立了组培快繁体系，为 香青兰无性系育种及遗传转化、工厂化生产育苗满足市场需求提供理论基础和实践依据。
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【发明内容】
： 本发明提供一种蒙药香青兰组织培养再生体系建立的方法。
[0005] 技术解决方案 所述的香青兰子叶愈伤组织再生体系的建立方法，包括以下步骤： (1)种子表面消毒及无菌苗培养： 挑选籽粒饱满、大小一致的香青兰种子，经流水冲洗4-7min去除表面尘土杂物，无菌 水冲洗4-7次后放置超净工作台上，用体积浓度70%乙醇浸泡30-40s，无菌水冲洗2-4次； 再用体积浓度〇. 1%取(：12消毒4-6min，无菌水震荡冲洗4-6次，接种在含有100mLMS。固 体培养基的三角瓶中，将三角瓶瓶身用牛皮纸包裹，28±2 °C条件下培养。每天观察种子的 污染与萌发状况。待种子萌发后去除牛皮纸光照培养，光照12-14h/d，光照强度1800-2200 lux〇
[0006] (2)愈伤组织的诱导 取步骤（1)培养的生长健壮的香青兰无菌苗，切取无菌幼苗的子叶接种于诱导培养基MSil，每瓶接种3-4块，暗培养9-12d后转入正常光照下培养。诱导培养基MSMS为基 本培养基，添加6-BA0.5mg/L、2,4_D1.0mg/L、NAA0.5mg/L、鹿糖30mg/L、琼脂 10mg/ L，pH5. 8-6. 0,13-16d后观察并统计愈伤组织诱导率。诱导光照培养条件为：光照12-14h/d，光照强度 1800-2200lux，温度 28 士 2 °C。
[0007] (3)愈伤组织的继代培养 将经过步骤（2)诱导得到的黄绿色愈伤组织接种在继代培养基MS2中进行继代培养。 继代培养基MS2&MS为基本培养基，添加 6-BA0.5mg/L、2,4-D0.5mg/L、NAA0.5mg/ 1^、蔗糖3〇1^/1、琼脂1〇1^/1，？!15.8-6.0，继代培养条件为：光照12-14 11/(1，光照强度 1800-2200lux，温度 28 士 2 °C。
[0008] (4)不定芽的诱导分化 将经过步骤（3)连续继代培养3-4次后得到的黄绿色愈伤组织转到不定芽分化培养基MS3中进行诱导，不定芽分化培养基以MS为基本培养基，添加外源激素6-BA0. 8mg/L、NAA 0· 1mg/L、蔗糖30mg/L、琼脂10mg/L，pH5. 8-6. 0,培养条件为：光照12-14h/d，光照强 度 1800-2200lux，温度 28 士 2 °C。
[0009] (5)诱导生根 待经过步骤（4)不定芽诱导得到再生芽2-3片左右时转入诱导生根培养基MS4进行生 根诱导，生根诱导培养基以1/2MS为基本培养基，添加外源激素IBA0. 2mg/L、蔗糖30mg/ L、琼脂6mg/L，pH5. 8-6.0,培养条件为：光照12-14h/d，光照强度1800-2200lux，温度 28 士 2 °C。
[0010] (6)再生植株移栽 经过12-15d左右步骤（5)的生根诱导，再生植株长出4-6条根后，将三角瓶瓶口打开， 置于自然条件下（阴凉、空气流通处）炼苗，7-8天后将再生苗从三角瓶中取出，经流水冲洗 掉根基部的培养基残留物，再用蒸馏水冲洗几次，用体积浓度〇. 08-0. 13%多菌灵浸泡6-8 min，转至移栽基质中，基质为松树皮、泥炭土、活苔藓与陶粒(按1 :1 :1 :1混合)，外扣遮光 塑料，每天浇透水1-3次，培育温度28 士 2 °C，晚上最低温度不低于20 °C。待幼苗长出 3-4片新叶，苗高8-12cm左右移栽到正常土壤下在自然环境中继续培育。
[0011] 本发明还具有如下附加技术特征： 所述MS。固体培养基为基本MS(MurashigeandSkoog，1962)培养基，含有以下浓度的 物质：1.65g/LNH4N03、1.90g/LΚΝ03、0· 17g/LΚΗ2Ρ04、0· 1807g/LMgS04.7H20、0· 332g/ 1^〇&(：12;微量元素：22.3 11^/1]\%504*4!120、6.2 11^/1队803、8.6 11^/1211504*7!120、0.83 mg/LΚΙ、0· 25g/LNa2Mo04 · 2Η20、0· 025mg/LCuS04 · 7Η20、0· 025mg/LCoCl· 6Η20、27· 8 mg/LFeS04 ·7Η20、37· 3mg/LNa2-EDTA;维生素：肌醇 100mg/L、烟酸 0· 5mg/L、L-甘氨酸 2mg/L、VB6 0.5mg/L、VBl0.1mg/L，蔗糖 30g/L，琼脂 8-10g/L。
[0012] 所述诱导培养基MSi为以MS为基本培养基，添加6-BA0.5mg/L、2,4-D1.0mg/ L、NAA0.5mg/L、鹿糖 30mg/L、琼脂 10mg/L,pH5. 8-6.0。
[0013] 所述继代培养基MS2为以MS为基本培养基，添加6-BA0· 5mg/L、2,4-D 0· 5mg/ L、NAA0.5mg/L、鹿糖 30mg/L、琼脂 10mg/L，pH5. 8-6.0。
[0014] 所述不定芽分化培养基MS3为以MS为基本培养基，添加外源激素6-BA0.8mg/L、 NAA0· 1mg/L、鹿糖 30mg/L、琼脂 10mg/L，pH5· 8_6· 0。
[0015] 所述生根培养基MS4为以1/2MS为基本培养基，添加外源激素IBA0. 2mg/L、蔗 糖30mg/L、琼脂6mg/L，pH5. 8-6. 0。所述1/2MS培养基组分包括大量元素：0· 825g/ LNH4N〇3、0. 95 g/L ΚΝ03、0· 085 g/L ΚΗ2Ρ04、0· 09035 g/L MgS04.7H20、0· 166 g/L CaCl2jj 量元素：22.3 11^/1^]\%304*4!120、6.2 11^/1^1^31303、8.6 11^/1^211304*7!120、0.83 11^/1^1(1、 0.25 g/L Na2Mo04*2H20、0.025 mg/L CuS04*7H20、0.025 mg/L C〇C1*6H20、27.8 mg/L FeS04 ·7Η20、37· 3 mg/L Na2-EDTA ;维生素，肌醇 100 mg/L、烟酸 0· 5 mg/L、L-甘氨酸 2 mg/ L、VB6 0.5 mg/L、VBl 0· 1 mg/L。
[0016] 所述移栽基质为松树皮、泥炭土、活苔藓与陶粒按1 :1 :1 :1混合所得。
[0017] 所述正常土壤为室外随机所取得种植土壤。
[0018] 香青兰作为一种典型的蒙、维常用民族药，对其进行的研究主要集中在化学成分 分析与临床应用上，通过组织培养建立香青兰再生体系方面至今未见报道。采用本发明的 有益效果是提供一种操作简单的蒙药香青兰组织培养再生体系建立的方法。采用香青兰无 菌苗的子叶做为外植体进行愈伤组织诱导，愈伤组织继代培养后增值较快，分化程度高，经 生根培养后得到的再生植物移栽后成活率高，利用该方法可在短期内获得大量香青兰再生 植株，为进一步扩大栽培香青兰提供良好的种苗或可作为优秀的科研材料进行该物种的遗 传转化等研究。
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【附图说明】： 图1为本发明培养的香青兰无菌苗； 图2为本发明香青兰无菌苗子叶培养培养5天的情形； 图3为本发明香青兰子叶愈伤诱导20天的情形； 图4为香青兰愈伤组织分化不定芽； 图5为香青兰不定根的分化； 图6为香青兰再生植株移栽。
[0020] 具体实施案例： 下面对本发明的实施做进一步的详细描述： 一种蒙药香青兰组织培养再生体系建立的方法，种植香青兰无菌苗的种子采自内蒙古 锡林郭勒盟草原，它采用如下步骤： 步骤一：挑选籽粒饱满、大小一致的香青兰种子，经流水冲洗4-7 min去除表面尘土杂 物，无菌水冲洗4-7次后放置超净工作台上，用体积浓度70%乙醇浸泡30-40 s，无菌水冲 洗2-4次；再用体积浓度0. 1%取(：12消毒4-6 min，无菌水震荡冲洗4-6次，接种在含有 100mLMS。固体培养基（MS基本培养基，pH5. 8)的三角瓶中，将三角瓶瓶身用牛皮纸包裹， 28±2 °C条件下培养。每天观察种子的污染与萌发状况。萌发率=(萌发种子数/接种种 子数）X100%，待种子萌发后去除牛皮纸光照培养，光照12-14 h/d，光照强度1800-2200 lux〇
[0021] 所述MS。固体培养基以基本MS(MurashigeandSkoog，1962)培养基为基础含有 以下质量体积浓度的物质：蔗糖30 g/L，琼脂8-10 g/L，灭菌前将pH调至5. 8-6. 0。
[0022] 所述基本MS培养基组分包括大量元素：1.65g/LNH4N03、1.90g/LΚΝ03、0. 17g/ LΚΗ2Ρ04、0· 1807g/LMgS04 · 7Η20、0· 332g/LCaCl2jj量元素：22. 3mg/LMgS04 · 4H20、 6.2mg/LN3B03、8.6mg/LZnS04.7H20、0.83mg/LKI、0.25g/LNa2Mo04.2H20、0.025mg/ LCuS04 · 7H20、0. 025mg/LCoCl· 6H20、27. 8mg/LFeS04 · 7H20、