周后统计植株无菌存活率。
[0050] 不同灭菌处理的灭菌效果见表1。各处理中，15%次氯酸钠处理lOmin嫩枝无菌 存活率最高，达到91. 7%，灭菌效果最好；其次是0. 1 %氯化汞处理8min，嫩枝无菌存活率 84.6% ;70%酒精处理6min，嫩枝无菌存活率达到82. 8%。氯化汞属于重金属有害物质， 残留的重金属会对植物造成伤害，同时氯化汞废液也需要特别处理，70%的酒精灭菌处理 后嫩枝叶子明显变黄（这与处理过程中植物的叶绿素溶解于酒精有关），而次氯酸钠相对 温和。因此，采用15%的次氯酸钠处理8分钟，灭菌效果最好。无菌嫩枝生长如图3和图4 所示。
[0051] 表1.不同灭菌剂不同处理时间对外植体的灭菌效果
[0052]
[0053] 注：列中不同字母表示在0. 05水平上差异显著。
[0054] 2、两步生根法不同氨基酸和蔗糖的浓度、pH及诱导期对不定根形成的影响
[0055] 将经灭菌处理的嫩枝材料接种于不同浓度的谷氨酸（5mg·L1、25mg·L1、 50mg.L3、半胱氨酸（5mg.L\25mg.L\50mg.L3、甘氨酸（5mg.L\25mg.L\50mg.L3、 鹿糖（2. 5g·L\5rng·L^7. 5mg·L3、不同pH(5. 7、6. 2、6. 7)、不同生根诱导期（8d、lid、 14d)组合的含1/3大量元素及2mg*L- 1NAA的L9培养基进行生根诱导处理。经生根诱导 后的材料转接入无生长调节剂、含与诱导培养基相同浓度的谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、蔗 糖、pH及1/3大量元素的L9培养基进行生根培养。试验按照L18 (37)的正交试验设计，各 因素的1-3水平按照各因素括号内的水平从前到后依次设定，详见表2。每个处理接种20 个萌发的隐芽，重复3次。处理8周后，统计不同处理材料的生根率、平均生根数、植株存活 率。
[0056] 极差结果如表2所示，影响生根率因素的主次顺序为：pH>谷氨酸〉甘氨酸〉蔗糖 >诱导期〉半胱氨酸。因素的最优水平为pH6. 7,谷氨酸50mg*L\甘氨酸25mg*L\鹿糖 7. 5g*L\诱导期14d，半胱氨酸5mg*L^按照极差结果分析，影响嫩枝存活因素的主次顺 序为：谷氨酸〉甘氨酸〉pH>蔗糖〉半胱氨酸〉诱导期。因素的最优水平为谷氨酸5mg*L\ 甘氨酸25mg·L\pH6. 7,鹿糖7. 5g·L\半胱氨酸5mg·L\诱导期14d。按照极差结果 分析影响生根数因素的主次顺序为：pH>谷氨酸〉诱导期〉蔗糖〉半胱氨酸〉甘氨酸。因 素的最优水平为ρΗ6· 2、谷氨酸50mg·L\诱导期8d、鹿糖7. 5g·L\半胱氨酸50mg·L\ 甘氨酸25mg·L^不同处理组合的方差分析和多重比较结果如表3所示，谷氨酸的不同水 平对于存活率的影响显著。5π^·?/谷氨酸的存活率显著高于25mg*L1谷氨酸的存活率。
[0057] 由此可见，谷氨酸显著影响嫩枝生根过程的存活率。综合考虑，谷氨酸5mg*L\ 半胱氨酸5mg·L\甘氨酸25mg·L\pH6. 7,鹿糖7. 5g·L\诱导期14d的组合生根效果 好。
[0058] 表2.氨基酸和蔗糖的浓度、pH及诱导期的变化影响不定根形成的极差分析
[0059]
[0060]
[0061] 表3.氨基酸和蔗糖的浓度、pH及诱导期的变化影响不定根形成的方差分析及多 重比较
[0062]
[0063] 注：列中不同字母表示在0. 05水平上差异显著。*代表P〈0. 1 代表P〈0. 05。
[0064] 3、两步生根法中吲哚丁酸和蔗糖浓度、pH及生根诱导期的变化对不定根形成的影 响
[0065] 将经灭菌处理的嫩枝材料接种于不同浓度的Π引噪丁酸（0·25mg·L\lrng·L\ 1. 75mg·L3、鹿糖（5g·L^lOg·L\l5mg·L3、不同ρΗ(6· 5、7、7· 5)、不同生根诱导期 (10d、14d、18d)组合的含1/3大量元素及2mg·!/WAA的L9培养基进行生根诱导处理。经 生根诱导后的材料转接入无生长调节剂、含与诱导培养基相同浓度的蔗糖、pH及谷氨酸、半 胱氨酸、甘氨酸、1/3大量元素的L9培养基进行生根培养（加入谷光氨肽氨基酸）。试验按 照L18 (37)的正交试验设计，各因素的1-3水平按照各因素括号内的水平从前到后依次设 定，详见表4。每个处理接种20个萌发的隐芽，重复3次。处理8周后，统计不同处理材料 的生根率、平均生根数、植株存活率、平均生根时间。
[0066] 极差结果如表4所示，影响生根率因素的主次顺序为：蔗糖>IBA>诱导期〉pH。因 素的最优水平为鹿糖l〇g·L\IBAO. 25mg·L\诱导期10d，pH7. 5。极差结果分析，影 响嫩枝存活因素的主次顺序为：蔗糖>IBA=诱导期=pH。因素的最优水平为蔗糖5和 10g·L\ΙΒΑ0. 25和1. 75mg·L\诱导期10和18d，pH7和7. 5。极差结果分析，影响平 均生根期因素的主次顺序为：诱导期〉蔗糖>IBA>pH。因素的最优水平为诱导期10d，蔗糖 5g·L\IBA1. 75mg·L\pH6. 5。极差结果分析，影响平均根数因素的主次顺序为：蔗糖 >pH>IBA>诱导期。因素的最优水平为蔗糖5g·L\pH6. 5,诱导期10d，IBAO. 25mg·L、 不同处理组合的方差分析和多重比较结果如表5所示。蔗糖和pH的不同水平对平均根数 的影响达到了显著水平。
[0067]由此可见，蔗糖和pH对于杂种落叶松不定根发生的影响显著。综合考虑，诱导期 10d，蔗糖10g·L\ΙΒΑ0. 25mg·L\pH6. 5对杂种落叶松生根处理的效果好。组培瓶内嫩 枝生根如图5和图6所不。
[0068] 表4.吲哚丁酸和蔗糖浓度、pH及生根诱导期的变化影响不定根形成的极差分析
[0069]
[0070] 表5.吲哚丁酸和蔗糖浓度、pH及生根诱导期的变化影响不定根形成的方差分析 及多重比较
[0071]
[0072] 注：列中不同字母表示在0. 05水平上差异显著。*代表P〈0. 1 代表P〈0. 05。
[0073] 实施例2、杂种落叶松微扦插育苗方法
[0074] 1、微型采穗圃的构建
[0075] 将中国林科院林业所选育出的生长性状和扦插生根能力兼优的日X长杂种无性 系日永8X长混18-10无性系两年生植株培养在气候室内，作为杂种落叶松微型采穗圃 母株。气候室是以白炽灯为光源，一天光照期为16小时，光照强度2000~30001x，温度 23±2°C，空气湿度50%。
[0076] 2、生根培养基配制
[0077] 改良1^9培养基的组分及其浓度，大量元素：KNO3633. 33mg/L、NH4N03550mg/ L、KH2P0456.67mg/L、CaCl2.2H20 110.67mg/L、MgS04.7H20 60.18mg/L;铁盐： FeNaEDTA36. 70mg/L;微量元素：Η3Β036· 20mg/L、ZnS04 ·Η20 8. 60mg/L、MnS04 ·Η20 16. 90mg/ L、Na2M〇04 · 2Η20 0· 25mg/L、ΚΙ0· 83mg/L、CuS04 · 5Η20 0· 025mg/L、CoCl2 · 6Η20 0· 025mg/ L;有机质：谷氨酸5mg/L、半胱氨酸5mg/L、甘氨酸25mg/L、鹿糖5000mg/L、琼脂5000mg/L、 pH值为6.5。
[0078] 配制和分装培养基，经高压蒸汽灭菌锅灭菌处理后冷却后备用。
[0079] 3、嫩枝灭菌处理
[0080] 剪取杂种落