加载和脱水过程都在冰上进行；
所述高糖加载液为:l/2MS+2mol/I/y^^+0.55mol/L鹿糖，pH5.8;
所述玻璃化液PVS2: 1/2MS+0.4mol/L蔗糖+30%w/v甘油+15%w/vDMS0 pH5.8 ；
所述卸载液为:1/2MS+1.2mol/L鹿糖，pH5.8;
所述成活培养基为:l/2MS+0.15ml/L NAA+1.3m I/L 6_BA+50g/L 马铃薯+25g/L 香蕉+7g/L 琼脂，pH5.8;
所述正常光照培养是在温度25土 1°C、光照强度1000-20001x、光照12h/d的条件下进行培养。
[0048]实施例7
一种石斛超低温保存脱毒的方法，包括如下步骤:
步骤(I)，取I月苗龄的带有CyMV和ORSV病毒的石斛组培苗，取带有单芽的茎段1.0cm，接种到基本培养基上，在4°C黑暗条件下炼苗3周;所述I月苗龄是继代培养I月的石斛组培苗，苗高度为2-3cm;
所述基本培养基为:l/2MS+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH5.8;
步骤(2)，从步骤(I)所炼的苗上剥取Imm长的茎尖，然后将茎尖在4 °C黑暗条件下预培养ld，之后将茎尖先进行包埋，包埋后采用高糖加载液对茎尖加载1.5h后，将茎尖转移到玻璃化溶液PVS2中脱水4h，再将茎尖投入液氮中保存0.9h，之后将茎尖在37 V水浴中解冻3min，之后将茎尖在室温下转入卸载液中解冻，并卸载20min，卸载后的茎尖接种到成活培养基上，先暗培养Id，后转入正常光照下继续培养，获得石斛脱毒苗;60d后RT-PCR检测CyMV和ORSV，脱毒率为89.5%。
[0049]所述预培养的培养基为:1/2MS+0.3mol/L蔗糖+7g/L琼脂，pH5.8;
所述的包埋的具体步骤为:向茎尖上滴加海藻酸钠包埋液，使得茎尖完全包裹于海藻酸钠包埋液中，然后将含有茎尖的海藻酸钠包埋液液滴加入至钙离子包埋液中，置于室温下15min，形成包埋珠;所述的包埋珠的直径为4_。
[0050]所述的海藻酸钠包埋液为:1/2MS+0.4mol/L蔗糖+2%w/v海藻酸钠；
所述的钙离子包埋液为:1/2MS+0.4mol/L蔗糖+0.lmol/1氯化钙。
[0051 ]所述加载和脱水过程都在冰上进行，摇床振荡；
所述高糖加载液为:l/2MS+2mol/I/y^^+0.3mol/L鹿糖，pH5.8;
所述玻璃化液PVS2: 1/2MS+0.4mol/L蔗糖+30%w/v甘油+15%w/vDMS0 pH5.8 ；
所述卸载液为:1/2MS+1.2mol/L鹿糖，pH5.8;
所述成活培养基为:1/2MS+0.lml/L NAA+0.lml/L 6_BA+50g/L马铃薯+25g/L香蕉+7g/L 琼脂，pH5.8;
所述正常光照培养是在温度25土 1°C、光照强度1000-20001x、光照12h/d的条件下进行培养。
[0052] 实施例8
一种石斛超低温保存脱毒的方法，包括如下步骤:
步骤(I)，取I月苗龄的带有CyMV和ORSV病毒的石斛组培苗，取带有单芽的茎段1.5cm，接种到基本培养基上，在4°C黑暗条件下炼苗5周;所述I月苗龄是继代培养I月的石斛组培苗，苗高度为2-3cm; 所述基本培养基为:l/2MS+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH5.8;
步骤(2)，从步骤(I)所炼的苗上剥取3mm长的茎尖，然后将茎尖在4 °C黑暗条件下预培养3d，之后将茎尖先进行包埋，包埋后采用高糖加载液对茎尖加载2h后，将茎尖转移到玻璃化溶液PVS2中脱水5h，再将茎尖投入液氮中保存l.lh，之后将茎尖在37°C水浴中解冻4min，之后将茎尖在室温下转入卸载液中解冻，并卸载30min，卸载后的茎尖接种到成活培养基上，先暗培养3d，后转入正常光照下继续培养，获得石斛脱毒苗；60d后RT-PCR检测CyMV和ORSV，脱毒率为89.3%。
[0053]所述预培养的培养基为:1/2MS+0.6mol/L蔗糖+7g/L琼脂，pH5.8;
所述的包埋的具体步骤为:向茎尖上滴加海藻酸钠包埋液，使得茎尖完全包裹于海藻酸钠包埋液中，然后将含有茎尖的海藻酸钠包埋液液滴加入至钙离子包埋液中，置于室温下20min，形成包埋珠;所述的包埋珠的直径为5_。
[0054]所述的海藻酸钠包埋液为:1/2MS+0.4mol/L蔗糖+3.5%w/v海藻酸钠；
所述的钙离子包埋液为:1/2MS+0.4mol/L蔗糖+0.lmol/1氯化钙。
[0055]所述加载和脱水过程都在冰上进行，摇床振荡；
所述高糖加载液为:l/2MS+2mol/I/y^^+0.7mol/L鹿糖，pH5.8;
所述玻璃化液PVS2: 1/2MS+0.4mol/L蔗糖+30%w/v甘油+15%w/vDMS0 pH5.8 ；
所述卸载液为:1/2MS+1.2mol/L鹿糖，pH5.8;
所述成活培养基为:l/2MS+0.2ml/L NAA+2.0ml/L 6_BA+50g/L马铃薯+25g/L香蕉+7g/L 琼脂，pH5.8;
所述正常光照培养是在温度25土 1°C、光照强度1000-20001x、光照12h/d的条件下进行培养。
[0056]实施例9
一种石斛超低温保存脱毒的方法，包括如下步骤:
步骤(I)，取I月苗龄的带有CyMV和ORSV病毒的石斛组培苗，取带有单芽的茎段1.4cm，接种到基本培养基上，在4°C黑暗条件下炼苗4.5周;所述I月苗龄是继代培养I月的石斛组培苗，苗高度为2-3cm;
所述基本培养基为:l/2MS+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH5.8;
步骤(2)，从步骤(I)所炼的苗上剥取1.8mm长的茎尖，然后将茎尖在4°C黑暗条件下预培养2d，之后将茎尖先进行包埋，包埋后采用高糖加载液对茎尖加载1.7h后，将茎尖转移到玻璃化溶液PVS2中脱水4.5h，再将茎尖投入液氮中保存Ih，之后将茎尖在37 °C水浴中解冻
3.6min，之后将茎尖在室温下转入卸载液中解冻，并卸载24min，卸载后的茎尖接种到成活培养基上，先暗培养2d，后转入正常光照下继续培养，获得石斛脱毒苗；60d后RT-PCR检测CyMV和ORSV，脱毒率为89.4%。
[0057]所述预培养的培养基为:1/2MS+0.5mol/L蔗糖+7g/L琼脂，pH5.8;
所述的包埋的具体步骤为:向茎尖上滴加海藻酸钠包埋液，使得茎尖完全包裹于海藻酸钠包埋液中，然后将含有茎尖的海藻酸钠包埋液液滴加入至钙离子包埋液中，置于室温下18min，形成包埋珠;所述的包埋珠的直径为4.5mm。
[0058]所述的海藻酸钠包埋液为:1/2MS+0.4mol/L蔗糖+3%w/v海藻酸钠；
所述的钙离子包埋液为:1/2MS+0.4mol/L蔗糖+0.lmol/1氯化钙。
[0059]所述加载和脱水过程都在冰上进行，摇床振荡；
所述高糖加载液为:l/2MS+2mol/I/y^^+0.4mol/L鹿糖，pH5.8;
所述玻璃化液PVS2: 1/2MS+0.4mol/L蔗糖+30%w/v甘油+15%w/vDMS0 pH5.8 ；
所述卸载液为:1/2MS+1.2mol/L鹿糖，pH5.8;
所述成活培养基为:1/2MS+0.15ml/L NAA+lml/L 6_BA+50g/L马铃薯+25g/L香蕉+7g/L琼脂，PH5.8;
所述正常光照培养是在温度25土 1°C、光照强度1000-20001x、光照12h/d的条件下进行培养。
[0060]以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
【主权项】
1.一种石斛超低温保存脱毒的方法，其特征在于，包括如下步骤: 步骤(1)，选择I月苗龄的带有CyMV和ORSV病毒的石斛组培苗，取石斛组培苗带有单芽的茎段1.0-1.5cm，接种到基本培养基上，在4°C黑暗条件下炼苗3-5周;所述I月苗龄是继代培养1月的石斛组培苗，苗高度为2-3cm; 所述基本培养基为:l/2MS+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH5.8; 步骤(2)，从步骤(I)所炼的苗上剥取l-3mm长的茎尖，然后将茎尖在4 °C黑暗条件下预培养l-3d;接着在超净工作台上，采用高糖加载液对茎尖加载20-40min后，将茎尖转移到玻璃化溶液PVS2中脱水30-60min，再将茎尖投入液氮中保存30min-lh，之后将茎尖在室温下迅速转入卸载液中解冻并卸载20-30min，或是将茎尖在37°C水浴中解冻3-4min再转入卸载液中卸载20-30min，卸载后