的茎尖接种到成活培养基上，先暗培养l-3d，后转入正常光照下继续培养，获得石斛脱毒苗； 所述预培养的培养基为:1/2MS+0.3-0.6mol/L蔗糖+7g/L琼脂，pH5.8; 所述加载和脱水过程都在冰上进行； 所述高糖加载液为:l/2MS+2mol/I/y^^+0.3-0.7mol/L鹿糖，pH5.8 ； 所述玻璃化液PVS2: 1/2MS+0.4mol/L蔗糖+30%w/v甘油+15%w/vDMS0 pH5.8； 所述卸载液为:1/2MS+1.2mol/L鹿糖，ρΗ5.8; 所述成活培养基为:1/2MS+0.1-0.2ml/L NAA+0.1-2.0ml/L 6_BA+50g/L马铃薯+25g/L香蕉+7g/L琼脂，pH5.8 ； 所述正常光照培养是在温度25土 1°C、光照强度1000-20001x、光照12h/d的条件下进行培养。2.根据权利要求1所述的石斛超低温保存脱毒的方法，其特征在于，步骤(2)中在体视显微镜下剥取l_3mm长的茎尖。3.根据权利要求1所述的石斛超低温保存脱毒的方法，其特征在于，将茎尖投入液氮中保存时采用小滴玻璃化法或玻璃化法。4.根据权利要求3所述的石斛超低温保存脱毒的方法，其特征在于，所述的小滴玻璃化法是将铝箔纸剪成(0.8-1)(:111*(2-2.2)(^长条形的铝箔条，将经?￥52脱水处理后的茎尖放到铝箔条光滑的一面上，向茎尖上滴加PVS2，使茎尖完全包裹于PVS2溶液小滴中，然后将铝箔条直接浸入液氮中进行冷冻，冷冻后将铝箔条装入冻存管中，拧紧盖子，最后投入液氮中保存。5.根据权利要求3所述的石斛超低温保存脱毒的方法，其特征在于，所述的玻璃化法是将将经PVS2脱水处理后的茎尖放入冷冻管中，向冷冻管加入PVS2使茎尖浸泡在PVS2中，盖紧盖子后直接将冷冻管投入液氮中保存。6.根据权利要求1所述的石斛超低温保存脱毒的方法，其特征在于，将4°C黑暗条件下预培养l-3d得到的茎尖先进行包埋，然后再加载、脱水和液氮保存； 所述的包埋的具体步骤为:向茎尖上滴加海藻酸钠包埋液，使得茎尖完全包裹于海藻酸钠包埋液中，然后将含有茎尖的海藻酸钠包埋液液滴加入至钙离子包埋液中，置于室温下，使其充分凝固成包埋珠； 所述的海藻酸钠包埋液为:1/2MS+0.4mol/L蔗糖+2-3.5%w/v海藻酸钠； 所述的钙离子包埋液为:1/2MS+0.4mol/L蔗糖+0.lmol/1氯化钙； 经过包埋后的茎尖加载时间为1.5-2h，脱水时间为4-5h，液氮保存时间为0.9-1.lh。7.根据权利要求6所述的石斛超低温保存脱毒的方法，其特征在于，所述的包埋珠的直径为4_5mm。8.根据权利要求1所述的石斛超低温保存脱毒的方法，其特征在于，包括如下步骤: 步骤(I)，取I月苗龄的带有CyMV和ORSV病毒的石斛组培苗，取带有单芽的茎段1.2cm，接种到基本培养基上，在4°C黑暗条件下炼苗4周;所述I月苗龄是继代培养I月的石斛组培苗，苗高度为2-3cm; 所述基本培养基为:l/2MS+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH5.8; 步骤(2)，在体视显微镜下，从步骤(I)所炼的苗上剥取2mm长的茎尖，然后将茎尖在4°C黑暗条件下预培养2d;接着在超净工作台上，采用高糖加载液对茎尖加载30min后，将茎尖转移到玻璃化溶液PVS2中脱水50min，再将茎尖放到0.9cm*2.1cm的铝箔条光滑的一面上，向茎尖上滴加PVS2，使茎尖完全包裹于PVS2溶液小滴中，之后将铝箔条直接浸入液氮中进行冷冻，冷冻后将铝箔条装入冻存管中，拧紧盖子后投入液氮中保存45min，之后将茎尖在室温下转入卸载液中解冻并卸载25min，卸载后的茎尖接种到成活培养基上，先暗培养2d，后转入正常光照下继续培养，获得石斛脱毒苗； 所述预培养的培养基为:1/2MS+0.5mol/L蔗糖+7g/L琼脂，pH5.8; 所述加载和脱水过程都在冰上进行； 所述高糖加载液为:l/2MS+2mol/I/y^^+0.6mol/L鹿糖，pH5.8; 所述玻璃化液PVS2: 1/2MS+0.4mol/L蔗糖+30%w/v甘油+15%w/vDMS0 pH5.8； 所述卸载液为:1/2MS+1.2mol/L鹿糖，ρΗ5.8; 所述成活培养基为:l/2MS+0.17ml/L NAA+1.5ml/L 6_BA+50g/L 马铃薯+25g/L 香蕉+7g/L 琼脂，pH5.8; 所述正常光照培养是在温度25土 1°C、光照强度1000-20001x、光照12h/d的条件下进行培养。9.根据权利要求1所述的石斛超低温保存脱毒的方法，其特征在于，包括如下步骤: 步骤(I)，取I月苗龄的带有CyMV和ORSV病毒的石斛组培苗，取带有单芽的茎段1.3cm，接种到基本培养基上，在4°C黑暗条件下炼苗3.5周;所述I月苗龄是继代培养I月的石斛组培苗，苗高度为2-3cm; 所述基本培养基为:l/2MS+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH5.8; 步骤(2)，在体视显微镜下，从步骤(I)所炼的苗上剥取2mm长的茎尖，然后将茎尖在4°C黑暗条件下预培养1.8d;接着在超净工作台上，采用高糖加载液对茎尖加载25min后，将茎尖转移到玻璃化溶液PVS2中脱水52min，再将茎尖放入冷冻管中，向冷冻管加入PVS2使茎尖浸泡在PVS2中，盖紧盖子后直接将冷冻管投入液氮中保存43min后，将冷冻管在37 V水浴中解冻3.5min，之后将茎尖在室温下转入卸载液中卸载26min解冻，卸载后的茎尖接种到成活培养基上，先暗培养2.5d，后转入正常光照下继续培养，获得石斛脱毒苗； 所述预培养的培养基为:1/2MS+0.47mol/L蔗糖+7g/L琼脂，pH5.8; 所述加载和脱水过程都在冰上进行； 所述高糖加载液为:l/2MS+2mol/I/y^^+0.55mol/L鹿糖，pH5.8; 所述玻璃化液PVS2: 1/2MS+0.4mol/L蔗糖+30%w/v甘油+15%w/vDMS0 pH5.8； 所述卸载液为:1/2MS+1.2mol/L鹿糖，ρΗ5.8; 所述成活培养基为:l/2MS+0.15ml/L NAA+1.3ml/L 6_BA+50g/L 马铃薯+25g/L 香蕉+7g/L 琼脂，pH5.8; 所述正常光照培养是在温度25土 1°C、光照强度1000-20001x、光照12h/d的条件下进行培养。10.根据权利要求1所述的石斛超低温保存脱毒的方法，其特征在于，包括如下步骤:步骤(I)，取I月苗龄的带有CyMV和ORSV病毒的石斛组培苗，取带有单芽的茎段1.4cm，接种到基本培养基上，在4°C黑暗条件下炼苗4.5周;所述I月苗龄是继代培养I月的石斛组培苗，苗高度为2-3cm; 所述基本培养基为:l/2MS+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH5.8; 步骤(2)，从步骤(1)所炼的苗上剥取1.8mm长的茎尖，然后将茎尖在4 °C黑暗条件下预培养2d，之后将茎尖先进行包埋，包埋后采用高糖加载液对茎尖加载1.7h后，将茎尖转移到玻璃化溶液PVS2中脱水4.5h，再将茎尖投入液氮中保存Ih，之后将茎尖在37 °C水浴中解冻.3.6min，之后将茎尖在室温下转入卸载液中解冻，并卸载24min，卸载后的茎尖接种到成活培养基上，先暗培养2d，后转入正常光照下继续培养，获得石斛脱毒苗； 所述预培养的培养基为:1/2MS+0.5mol/L蔗糖+7g/L琼脂，pH5.8; 所述的包埋的具体步骤为:向茎尖上滴加海藻酸钠包埋液，使得茎尖完全包裹于海藻酸钠包埋液中，然后将含有茎尖的海藻酸钠包埋液液滴加入至钙离子包埋液中，置于室温下18min，形成包埋珠;所述的包埋珠的直径为4.5mm ； 所述的海藻酸钠包埋液为:1/2MS+0.4mol/L鹿糖+3%w/v海藻酸钠； 所述的钙离子包埋液为:1/2MS+0.4mol/L蔗糖+0.lmol/1氯化钙； 所述加载和脱水过程都在冰上进行，并摇床振荡； 所述高糖加载液为:l/2MS+2mol/I/y^^+0.4mol/L鹿糖，pH5.8; 所述玻璃化液PVS2: 1/2MS+0.4mol/L蔗糖+30%w/v甘油+15%w/vDMS0 pH5.8； 所述卸载液为:1/2MS+1.2mol/L鹿糖，ρΗ5.8; 所述成活培养基为:1/2MS+0.15ml/L NAA+lml/L 6_BA+50g/L马铃薯+25g/L香蕉+7g/L琼脂，PH5.8; 所述正常光照培养是在温度25土 1°C、光照强度1000-20001x、光照12h/d的条件下进行培养。
【专利摘要】本发明涉及一种石斛超低温保存脱毒的方法，属于植物病毒防治技术领域。本发明为了更有效的保护即将濒危的石斛，提高种苗质量，生产无病毒种苗，本发明提供了一种新型的石斛超低温保存脱毒方法，能有效提高种苗脱毒率。与传统的脱毒方法相比超低温脱毒具有脱毒率高，脱毒率不受茎尖大小的影响，具有取材方便，操作简单，不需要特殊的仪器、设备和昂贵的药品试剂，且周期短，可同时用于种质资源的保存与脱毒的优点，易于推广应用。
【IPC分类】A01H4/00
【公开号】CN105706922
【申请号】CN201610062743
【发明人】曹桦, 李涵, 李绅崇, 闻永慧, 赵培飞, 杨维, 李慧敏
【申请人】云南省农业科学院花卉研究所, 云南集创园艺科技有限公司
【公开日】2016年6月29日
【申请日】2016年1月29日