一种四倍体冬枣的繁育方法
【专利摘要】本发明公开了一种四倍体冬枣的繁育方法，利用外植体接种、初代培养、继代培养、生根培养、过渡炼苗、温室盆栽、大田苗圃、诱导植株的倍性鉴定、嫁接、果实品质的测定步骤的系统化调整，从而选育出优良的四倍体冬枣苗木。使用该方法可获得优质的四倍体冬枣植株，属于无性繁殖，不受季节影响，使冬枣品种的提纯选优更加方便和快速，繁育的冬枣树普遍具有性状优良，抗病、抗逆性强，苗木健壮、节间短、根系发达，果实具有个大、无核等特点，具有较高的经济效益。
【专利说明】
一种四倍体冬枣的繁育方法
技术领域
[0001]本发明涉及植株的栽培方法，具体涉及一种四倍体冬枣的繁育方法。
【背景技术】
[0002]目前，我国的水果生产处于一个全新的竞争环境中，优良果品和优质高效生产方式是取得良好效益的关键。对于中国原产的特色水果，加大研究力度，提高果品品质，增强竞争力，已成为我国果品产业中的核心问题之一。我国是枣树的起源地和栽培中心，种植资源非常丰富。但目前的二倍体冬枣存在果实偏小、果核大、果皮薄及贮性差，易遭病虫害等缺点，而且农户片面追求产量，使用激素处理增大果实，大大降低了冬枣的优良品质。据调查，目前市场上冬枣的优质枣率不到10%，农药残留量超标95%以上，优质率低，农药残留量高，基本上没有达到出口标准的高档枣。这些问题大大限制了沾化冬枣的持续发展和市场竞争力，已成为制约沾化冬枣产业健康发展的极大障碍。
[0003]另外，多倍化是植物进化的主要方式之一，多倍体植株多表现营养器官和生殖器官的巨大性，具有高的杂和性，较强的适应性和抗逆性。果树一般具有遗传上高度杂合、优良多倍体品种存在和通常能无性繁殖等特点，更适合多倍体的诱导和培育。到目前为止，已在梨、杏、桃、树莓、栗、醋栗、苹果、香蕉、葡萄、草莓、越桔、柑桔、菠萝、猕猴桃、核桃、樱桃等果树上成功地诱导出多倍体植株，大大丰富了世界各国的果树种质资源。多倍化植株的诱导不仅涉及到诱导基因突变的过程，更需要结合特有的培植过程，因为合理的培植过程同时也是植株性状改进的重要方式之一。而目前枣树中仅有金丝小枣通过秋水仙素获得四倍体植株的报道，针对冬枣的四倍体植株诱导及培植结合的研究在本申请之前未见相关报道。
【发明内容】
[0004]为了解决以上现有技术中的问题，本发明创造性的提出一种四倍体冬枣的繁育方法，使用该方法可获得优质的四倍体冬枣植株，属于无性繁殖，不受季节影响，使冬枣品种的提纯选优更加方便和快速，繁育的冬枣树普遍具有性状优良，抗病、抗逆性强，苗木健壮、节间短、根系发达，果实具有个大、无核等特点。
[0005]本发明采取的技术方案如下:
一种四倍体冬枣的繁育方法，其特点在于栽植步骤如下:
(1)外植体接种:在生长季节剪取刚萌发的枣头枝或二次枝顶芽2cm，用无菌水冲洗干净，然后在超净台上用酒精消毒，然后用次氯酸钠和升汞分别消毒，最后用无菌水冲洗干净；
(2)初代培养:将材料放在解剖镜下用解剖针剥取0.3-0.5mm的生长点接种到MS +BA2.0mg/L+ IBA0.4的培养基上，用秋水仙素液体做诱导处理，待发出的芽长至3cm时，按节剪成段，作为继代繁殖材料;所述的秋水仙素设0.05%,0.1%,0.3%,0.5% 4个浓度，处理时间设12h，24h，48h，72h，96h 5个处理时间。
[0006](3)继代培养:将初代培养新抽出的芽梢剪成Icm的茎段，茎段保留一节以上，转接到MS+BA1.5 +IBA0.5继代培养基上，将后续培养形成的芽梢反复转接不断的分化增殖；
(4)生根培养:将继代培养基上的芽梢剪成Icm带1-2节的茎段，接到适宜的生根培养基1/2 MS+NAAlmg/L+ IBA0.5mg/L+LH200mg/L
上培养，试管苗茎段根长达到2cm以上后，脱瓶移栽；
(5)过渡炼苗:当试管苗生根培养5周后，上部长出2cm以上的健壮枝叶，将试管苗移到温室避光处进行无土基质过渡炼苗，移栽初期相对湿度保持在80%左右，温度28—30°C。
[0007](6)温室盆栽:炼苗20天后，在温室内将枣苗移入营养钵或小素烧盆中，基质用专门配制的营养土(珍珠岩:蛭石:草炭:园土重量份数比为1: 1: 0.5:0.5)。
[0008](7)大田苗圃:待生长30天后，将枣苗从营养钵或小素烧盆中移入大田苗圃；
(8)诱导植株的倍性鉴定:叶形指数，节间作为指标进行形态学上的鉴定，利用常规压片法鉴定诱导植株的染色体数目，利用荧光显微镜观测保卫细胞叶绿体数目，气乳大小及密度，利用流式细胞仪检测诱导植株细胞的DNA含量。
[0009](9)嫁接:将鉴定后的四倍体小植株嫁接到成年的冬枣树上，进行多倍体植株的盆栽抗性试验、大田抗性试验，选择抗性水平高、性状优良的株系。
[0010](10)果实品质的测定:对抗性水平高、性状优良的株系进行果实品质的测定，果实硬度利用GY-1型圆盘硬度计测定，果实的可溶固形物含量利用ATAGO数字折射计PRl测定，果实维生素C含量采用差分分析分光光度计法测定，果实的大小和重量测定，果核的有无，从而选育出优良的四倍体冬枣苗木。
[0011]以上步骤(I)中消毒步骤具体为:在超净台上用70%酒精消毒5s，用5%的次氯酸钠和0.1 %的升汞分别消毒8min。
[0012]以上步骤(4)中接到生根培养基上8-10d，试管苗茎段的腋芽开始萌动，同时茎段基部产生白色突起，12天后生出3—5条小白根，30—40天后根长达到2cm以上。
[0013]以上步骤(5)中无土基质为珍珠岩、蛭石的混合物，具体为无土基质为珍珠岩与蛭石质量比为1:3混合物。
[0014]本发明的有益效果为:本申请在无菌条件下，把冬枣植物的组织或单个细胞从植物体上取下，放在由人工控制光照、温度、湿度和营养物质等因素的玻璃容器内培养，使它继续生存或发展，最后发育成一棵完整的冬枣植株，在室内人工控制的环境条件下进行，属于无性繁殖，可实现快速繁殖生产;人工控制，不受季节影响;节省土地;可筛选性强，能繁殖无病毒苗；品种提纯选优更加方便。通过这种方法生产的沾化冬枣苗木能保持其母体优良性状，并脱毒，抗病、抗逆性显著增强；苗木本身健壮、节间短、根系发达;提前进入盛果期，结果品质好。
[0015]利用秋水仙素诱导四倍体沾化冬枣，可望在保持枣果优良品质的同时，使果实变大一倍左右，个体树增产至少50%，效益有显著提高，并从根本上解决农户使用激素处理增大果实造成沾化冬枣品质严重退化的影响;诱导产生的四倍体冬枣由于遗传物质加倍，在贮藏性、抗病性等会有优良性状的变化，储藏时间更长，储藏期间水分损失更少;抗病性明显增强，可大幅减少农药的使用量，从而可以改良土壤结构，减少环境污染，保护了天敌，维护了生物的多样性和生态平衡，实现农业生产的良性循环，具有较高的生态效益。
【具体实施方式】
[0016]下面的实施例是对本发明的进一步详细描述。
[0017]实施例:
1.项目研究地点
根据本项目特点，试验在多地点开展。高效冬枣精尖培养体系的建立、适应性和抗逆性试验在沾化县冬枣研究所进行;植株的倍性鉴定、果实品质测定在山东大学生命科学学院细胞工程试验室进行;冬枣苗木田间选育在沾化县冬枣研究所下属的中国高新技术苗木繁育场进行。
[0018]2.项目研发规模
项目研究的不同阶段，规模由小到大，抗性鉴定阶段由小到大，每种材料的规模在1000平方米左右，至开发阶段规模扩大。到项目结束后，建成良种示范基地100亩，达到年产30万株四倍体冬枣新品种苗木的生产能力。
[0019]3.项目研发内容
(I)以秋水仙素离体处理沾化冬枣茎尖，建立冬枣多倍体诱导技术体系。
[0020](2)利用节间缩短、叶形指数变小等外部特征对诱导植株进行初步倍性判定，细胞学检测和染色体计数进一步鉴定植株倍性。在此基础上，利用流式细胞仪测定细胞的DNA含量，最终判定诱导植株的倍性。
[0021](3)将四倍体小苗嫁接到成年枣树上加速生长和提早结实，同时对四倍体植株进行形态特征和生长发育的研究。
[0022](4)观测四倍体沾化冬枣的枣果性状和采收期变化，选择优良植株;对采收的枣果进行果实品质、贮藏期等方面的研究，选择果大、质优的沾化冬枣植株。
[0023](5)在对优良四倍体植株进行综合性状的分析的基础上，建立良种苗木示范田，进行苗木产品的繁殖推广，以尽快在生产上发挥作用。
[0024]4.研究方法
(I)外植体接种:在4月底5月初剪取刚萌发的枣头枝或二次枝顶芽2cm，用无菌水冲洗干净，然后在超净台上用70%酒精消毒5s，用5%的次氯酸钠和0.1%的升汞分别消毒8min，最后用无菌水冲洗干净。
[0025](2)初代培养:将材料放在解剖镜下用解剖针剥取0.3-0.5mm的生长点接种到MS +BA2.0mg/L+IBA0.4的培养基上，用秋水仙素液体做诱导处理，秋水仙素设0.05%,0.1%,
0.3%,0.5% 4个浓度，处理时间设12h，24h，48h，72h，96h 5个处理时间，待发出的芽长至3cm时，按节剪成段，作为继代繁殖材料；
(3)继代培养:将初代培养新抽出的芽梢剪成Icm的茎段，茎段保留一节以上，转接到MS+BAl.5 +IBA0.5继代培养基上，将后续培养形成的芽梢反复转接不断的分化增殖；
(4)生根培养:将继代培养基上的芽梢剪成Icm带1-2节的茎段，接到适宜的生根培养基(1/2 MS + NAAlmg/L+IBA0.5mg/L + LH200mg/L)上培养8-10d，试管苗茎段的腋芽开始萌动，同时茎段基部产生白色突起，12天后生出3—5条小白根，30—40天后根长达到2cm以上后，脱瓶移栽；
(5)过渡炼苗:当试管苗生根培养5周后，上部长出2cm以上的健壮枝叶，将试管苗移到温室避光处进行无土基质过渡炼苗，无土基质为珍珠岩与蛭石质量比为1:3混合物，移栽初期相对湿度保持在80%左右，温度28—30°C。
[0026](6)温室盆栽:炼苗20天后，枣苗枝叶生长良好，在温室内将枣苗移入营养钵或小素烧盆中，基质用珍珠岩:蛭石:草炭:园土按重量份数比为1:1:0.5:0.5配制。
[0027](7)大田苗圃:待生长30天后，且枣苗生长旺盛，将其从营养钵或小素烧盆中移入大田苗圃；
(8)诱导植株的倍性鉴定:利用常规压片法鉴定诱导植株的染色体数目，利用流式细胞仪检测诱导植株细胞的DNA含量。测得叶形指数为1.85，节间平均3.7厘米。利用常规压片法鉴定诱导植株的染色体数目，染色体数目为48条。利用流式细胞仪所测得的量是相对值，利用流式细胞仪测得为四倍体。
[0028](9)嫁接:将鉴定后的四倍体小植株嫁接到大田中成年的冬枣树上，进行多倍体植株的抗性(即抗寒、抗旱、抗涝、抗病虫、抗逆性等)观察试验，选择抗性水平高、性状优良的株系。
[0029](10)果实品质的测定:对抗性水平高、性状优良的株系进行果实品质的测定，果实硬度利用GY-1型圆盘硬度计测定，果实的可溶固形物含量利用ATAGO数字折射计PRl测定，果实维生素C含量采用差分分析分光光度计法测定，果实的大小和重量测定，果核的有无，从而选育出优良的四倍体冬枣苗木。
[0030]测得的大致指标为:测得果实平均硬度8.7kg/cm2，果实的可溶固形物含量利用ATAGO数字折射计PRl测定，可溶性固形物为33%。果实维生素C含量采用差分分析分光光度计法测定，维生素C308mg/100g，平均单果重21.09g，最大单果重57.5g，果形指数为0.918,果核小。但以上指标并非为本发明筛选的具体点值指标，在以上指标左右的也可以考虑。
[0031]5.实施效果
建立高效离体诱导沾化冬枣四倍植株的技术体系，诱导频率不低于6%，获得四倍体沾化冬枣植株400株，然后高接于成年枣树上，加快生产和果实发育。然后再获得四倍体结枣植株300株，从中选出果实增大20%以上，并保持优良品质的多倍体植株20-30株，选育出在果实耐贮藏性或抗病性增强的植株10株。
[0032]通过培育四倍体植株，其果品体积将明显增大，个体树将增产50%，效益有显著提高，且其耐贮性和抗逆性将显著增强。
【主权项】
1.一种四倍体冬枣的繁育方法，其特征在于栽植步骤如下: (1)外植体接种:在生长季节剪取刚萌发的枣头枝或二次枝顶芽2cm，用无菌水冲洗干净，然后在超净台上用酒精消毒，然后用次氯酸钠和升汞分别消毒，最后用无菌水冲洗干净； (2)初代培养:将材料放在解剖镜下用解剖针剥取0.3-0.5mm的生长点接种到MS +BA2.0mg/L+ IBA0.4的培养基上，用秋水仙素液体做诱导处理，待发出的芽长至3cm时，按节剪成段，作为继代繁殖材料； (3)继代培养:将初代培养新抽出的芽梢剪成Icm的茎段，茎段保留一节以上，转接到MS+BAl.5 +IBA0.5继代培养基上，将后续培养形成的芽梢反复转接不断的分化增殖； (4)生根培养:将继代培养基上的芽梢剪成Icm带1-2节的茎段，接到生根培养基上培养，试管苗茎段根长达到2cm以上后，脱瓶移栽； (5)过渡炼苗:当试管苗生根培养5周后，上部长出2cm以上的健壮枝叶，将试管苗移到温室避光处进行无土基质过渡炼苗，移栽初期相对湿度保持在78%-82%，温度28—30°C ； (6)温室盆栽:炼苗20天后，在温室内将枣苗移入营养钵或小素烧盆中，基质用珍珠岩、輕石、草炭、园土配制的营养土 ； (7)大田苗圃:待生长30天后，将枣苗从营养钵或小素烧盆中移入大田苗圃； (8)诱导植株的倍性鉴定:叶形指数，节间作为指标进行形态学上的鉴定，利用常规压片法鉴定诱导植株的染色体数目，利用荧光显微镜观测保卫细胞叶绿体数目，气乳大小及密度，利用流式细胞仪检测诱导植株细胞的DNA含量； (9)嫁接:将鉴定后的四倍体小植株嫁接到成年的冬枣树上，进行多倍体植株的盆栽抗性试验、大田抗性试验，选择抗性水平高、性状优良的株系； (10)果实品质的测定:对抗性水平高、性状优良的株系进行果实品质的测定，果实硬度利用GY-1型圆盘硬度计测定，果实的可溶固形物含量利用ATAGO数字折射计PRl测定，果实维生素C含量采用差分分析分光光度计法测定，果实的大小和重量测定，果核的有无，从而选育出优良的四倍体冬枣苗木。2.如权利要求1所述的一种四倍体冬枣的繁育方法，其特征在于步骤(I)中消毒步骤具体为:在超净台上用70%酒精消毒5s，用5%的次氯酸钠和0.1%的升汞分别消毒8min。3.如权利要求1所述的一种四倍体冬枣的繁育方法，其特征在于:步骤(4)中接到生根培养基上8-10d，试管苗茎段的腋芽开始萌动，同时茎段基部产生白色突起，12天后生出3—5条小白根，30—40天后根长达到2cm以上。4.如权利要求1或3所述的一种四倍体冬枣的繁育方法，其特征在于:所述的生根培养基为I/2 MS+NAAlmg/L +IBA0.5mg/L+LH200mg/L培养基。5.如权利要求1所述的一种四倍体冬枣的繁育方法，其特征在于:步骤(6)中基质用的按珍珠岩、輕石、草炭、园土为I: 1:0.5:0.5的重量份数比配制的营养土。6.如权利要求1所述的一种四倍体冬枣的繁育方法，其特征在于:步骤(5)中无土基质为珍珠岩、蛭石的混合物。7.如权利要求6所述的一种四倍体冬枣的繁育方法，其特征在于:所述的无土基质为珍珠岩与蛭石质量比为I: 3混合物。8.如权利要求1所述的一种四倍体冬枣的繁育方法，其特征在于:所述的秋水仙素设 .0.05%，0.1%，0.3%，0.5%4个浓度，处理时间设1211，2411，4811，7211，9611 5 个处理时间。
【文档编号】A01H1/08GK105918117SQ201610367712
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年5月30日
【发明人】尹魁林, 于洪长, 许可军, 刘荣昌, 李占辉
【申请人】沾化县冬枣研究所