用于植物材料体外微繁殖的方法和用于大规模和大批量生产准备用于田间开发的植物的 ...的制作方法
【专利摘要】本发明涉及用于植物材料体外微繁殖的方法，该方法包括由植物繁殖体发育的嫩枝的增殖和伸长的步骤。本发明还包括用于通过“体外”生物工厂大规模生产准备用于田间开发的作为常规无性系花园的替代品的无性系幼苗的方法。
【专利说明】
用于植物材料体外微繁殖的方法和用于大规模和大批量生产 准备用于田间开发的植物的无性系幼苗的方法
技术领域
[0001 ]本发明涉及用于大规模和大批量生产木本树种(arboreal species)特别是桉属 的无性系植物的方法，由此发生在体外条件下体外进行的营养繁殖的步骤，从而最大化地 获得木本树种的健康的和有活力的微扦插苗(microestacas)，而使间歇浸没方案中微繁殖 阶段的玻璃质化速率最小化。
【背景技术】
[0002] 微繁殖由用作幼苗形成基础的植物组织培养技术组成，是一种在减少的空间内大 量繁殖植物的实用、安全以及快速的方法。常规地，通过半固体体系，典型地在有琼脂的胶 凝培养基中进行微繁殖。然而，这仍然是昂贵的实践，给利用设备和具有有助于大规模操作 中生产植物和降低高成本劳动力的称为生物反应器的设备的新技术留下了空间。
[0003] 生物反应器是用于在间歇或永久浸没方案中栽培幼苗以获得植物的装置。生物反 应器由用于最优管理关键生长因素以使生物反应最大化的一套具有隔室和配件的容器组 成。通过该设备，可通过使用液体营养培养基，在容器内注入和交换气体，例如富含二氧化 碳的空气，以及对种植条件和过程自动化的更好生理控制来获得较高增殖速率的培养。有 可随培养容器和培养基、浸没类型（间歇的或永久的）以及它们的功能性而变化的各种类型 的生物反应器。巴西最有名的间歇浸没系统是RITA? (间歇自动化浸没容器-例如由法国 农业发展研究中心（CIRAD-Fran?a )创建的）和BIT? (间歇浸没生物反应器-例如由巴 西农业研究公司-遗传资源与生物技术中心(Embrapa-Cenargen)创建的）。
[0004] 由于微繁殖技术的潜力，对现有技术所证明的该技术的兴趣日益增长。例如，文献 W0 2012/061950描述了用于南极植物物种的微繁殖的方法和生物反应器，其中该方法的特 点是使用了用于所述植物物种发育的营养培养基和适当条件，以及另外使用了用于提供生 产医学和化妆用途的有价值代谢物的UV辐射和温度控制的方案。
[0005] 文献W0 2012/156440描述了植物物种的微繁殖的间歇浸没系统和方法，其特点是 为繁殖体的发育提供了适当的条件，诸如照明、温度和浸没系统，依据正在发育的植物物 种，浸没系统的间隔范围为每天1次至10次，浸没时间为1分钟至2分钟或3分钟至4分钟。
[0006] Watt (参见Watt，MP "用于植物微繁殖的间歇浸没系统（TIS)技术的情况（The status of temporary immersion system(TIS)technology for plant micropropagation) ·"非洲生物技术杂志（African Journal of Biotechnology) ,Vol. 11 (76)，p. 14025-14035,09/20/2012)提供了对植物的微繁殖的回顾，特别是关于降低引用为 主要因素的玻璃质化、缩短浸没时间以及增加静止期(两次连续浸没之间的时间）的建议。
[0007] Gonzal ez (参见Gonzalez，R .等人"由间歇浸没系统进行蓝桉的体外增殖 (Multiplication in vitro of Eucalyptus globulus by temporal immersion system 体外树林(B〇SqUe)32(2) :147-154,2011)报道了影响通过间歇浸没进行蓝桉的体外增 殖的阶段的因素并得出结论，当使用1分钟至2分钟的浸泡时间和12小时的浸没频率(静止 期)时，该木本树种微扦插苗的增殖速率显著增加。这些作者还得出结论，玻璃质化(hiper-hidricidade)随营养素和蔗糖的浓度增加。
[0008] Oliveira(参见Oliveira ML，"间歇浸没生物反应器中巨桉X尾叶桉的无性系的 微繁殖（MicropropagagSode clones de Eucalyptus grandis x E. urophy 1 la em biorreatores deimefsao teraporaria.) ·硕士毕业论文（Dissertaqaode Tese de Mestrado.)维索萨联邦大学(Universidade Federal deVi(；〇sa.)2011)报道了对两种桉属 物种的体外微繁殖的研究，得出结论，当使用间歇浸没技术时，繁殖体发育中的玻璃质化的 发生率很高。作者还得出结论，"需要在作物管理阶段调整增殖和伸长以获得具有较大活力 的嫩枝，能在体外条件中生根以使该技术是大规模可行的"。
[0009] 前述现有技术示出虽然植物的体外微繁殖技术已有很大进步，玻璃质化问题仍有 待解决，且同时使用适当的条件获得植物特别是木本树种、更特别地是桉属物种的无性系 幼苗使得能大规模和大批量生产所述无性系幼苗并实现健康和有活力的植物的商业生产。
【发明内容】
[0010]本发明涉及使用植物材料的体外微繁殖技术获得无性系植物幼苗，特别是木本树 种的、尤其是桉属物种的无性系植物幼苗，包括准备用于商业化的幼苗的增殖、伸长、生根、 驯化以及生长和驯化的步骤。
[0011] 在第一实施方案中，本发明涉及用于植物材料的体外微繁殖，特别是木本树种的、 尤其是来自桉属物种的植物材料的体外微繁殖的方法，包括通过间歇浸没方法增殖和伸长 由植物繁殖体发育的嫩枝的步骤，如下：（a)在嫩枝的增殖步骤中，将待繁殖材料置于第一 容器(营养繁殖容器）中的适当支持物上，并在来自第二容器(液体培养基的贮藏容器)的液 体营养培养基中进行间歇浸没管理，所述管理包括浸没和静止的交替期，浸没时间优选为 至少1分钟，优选为至多3分钟，更优选为1分钟至2分钟，静止期优选为至少2小时，优选为至 多4小时，更优选为2小时至3小时；（b)在嫩枝伸长的步骤中，优选地使用步骤(a)的相同营 养培养基对繁殖材料进行间歇浸没管理，所述管理包括浸没和静止的交替期，浸没时间优 选为至少20秒，优选为至多60秒，更优选为20秒至30秒，静止期优选为至少4小时，优选为至 多6小时，更优选为4小时至5小时;所述方法的特点在于该事实，即在所述伸长步骤中，分别 与增殖步骤中的浸没期和静止期相比，所述浸没期显著较短，且所述静止期较长。
[0012] 在第二实施方案中，本发明涉及用于生产准备用于田间开发的无性系植物幼苗的 方法，包括步骤：（i)对植物繁殖体进行体外间歇浸没的营养繁殖条件，包括以下阶段：（a) 嫩枝增殖，其中待展开在适当的支持物上的材料被置于第一容器(微繁殖容器）中，且对所 述材料在来自第二容器(液体培养基贮藏容器)的液体营养培养基中进行间歇浸没管理，所 述管理包括浸没和静止的交替期，浸没时间优选为至少1分钟，优选为至多3分钟，更优选为 1分钟至2分钟，静止期优选为至少2小时，优选为至多4小时，更优选为2小时至3小时；（b)嫩 枝伸长，其中优选地使用步骤(a)的相同营养培养基对材料进行间歇浸没管理，所述管理包 括静止和浸没的交替期，浸没时间优选为至少20秒，优选为至多60秒，更优选为20秒至30 秒，静止期优选为至少4小时，优选为至多6小时，更优选为4小时至5小时；（ii)步骤⑴中获 得的多芽在适于维持植物膨压和降低蒸发需要的容器和条件中的生根和驯化；以及（iii) 步骤(ii)中获得的微扦插苗的生长和驯化。
【附图说明】
[0013] 图1说明了本发明的方法，示出各步骤的材料的微繁殖和微扦插。
[0014] 图2示出了间歇浸没方案中在液体营养培养基中的体外微繁殖步骤。
[0015] 图3示出无性系幼苗大规模和大批量地从正确克隆选择到市场推广的发展阶段。
【具体实施方式】
[0016] 发明详述
[0017] 间歇浸没生物反应器中无性系木本树种如桉属的微扦插苗的大规模和高生产力 的生产系统的主要目标是通过植物生物工厂逐渐取代经营性林业苗圃的传统无性系花园， 目的是生产用于随后在特定温室(钟形玻璃盖(estufins))中的生根和驯化的工业微型粧。
[0018] 在生物反应器中，可通过连续使用液体营养培养基，辅以在植物容器内注入空气 和富集二氧化碳以及用发光二极管灯进行光合有效辐射而获得较高速率的增殖和作物生 长。因此，嫩枝和生物质的生产管理通过关键生长因素的自动化操控而最佳地优化，使得能 对培养条件进行更好的生理控制。
[0019] 该技术中寻求的是将玻璃质化最小化，玻璃质化会引起对通过间歇浸没方法获得 的无性系幼苗的干扰和退化，以及同时保留该技术在生产成本和所生产的幼苗的健康/活 力方面的优势。本发明的发明人迎接了该挑战，该发明人己创建了一种方法，其中材料在营 养繁殖中的浸没和静止的交替期在嫩枝的繁殖和伸长阶段中是不同的。该过程使得能降低 无性系植物幼苗，特别是木本树种、以及最优选地是桉属物种，的玻璃质化和使其生产最大 化。图1中，这两个阶段表示为实验室中的活动，其中微繁殖即包括增殖和伸长阶段的步骤 一般要约45天的时间。
[0020] 本发明的方法已被定制成满足用于木本树种特别是桉属的营养繁殖的生理需要， 允许植物集中和准确的发育，分化从而得到所生产嫩枝的最佳质量标准和一致性以及活 力，提供微扦插苗的较好生根以及之后用于大规模工作用途的无性系幼苗的更好的驯化和 早期产量。
[0021] 除了提供用于生产无性系变化的周期时间降低33%之外，本发明的方法还允许获 得比生产来自商用苗圃的幼苗的传统方法大至少30倍的生产率。另外，本发明的方法在苗 圃中的运营性部署使人力降低以及无性系花园的构建成本降低。
[0022]其中本发明的方法解决了以下问题：
[0023] -在降低运营成本和生产周期的情况下，大规模和大批量地生产质量均匀的无性 系幼苗，以获得木本植物例如桉属的营养繁殖的最大效率和生产周期。
[0024] -降低与外植体的玻璃质化（即通常称为植物玻璃化的现象)有关的生理异常和 紊乱。气体交换管理是本发明的优点之一，该管理优选地在BIT型的生物反应器中进行，但 也可在另一种类型如RITA的生物反应器中进行，这实际上消除了这些生物问题。
[0025] -降低了与包含运营过程中无性系花园（jardins clonais)的劳工降低有关的桉 属无性系幼苗的生产成本。
[0026] 一间歇浸没生物反应器中进行的营养繁殖中植物基质和微型粧的生理品质模式 的一致性，与从环境条件不一致的无性系花园中生长的植物获得的植物和扦插苗 (estacas)的一致性的缺乏相反。
[0027] 一生物反应器中体外营养繁殖克服了包括桉属、顽拗性植物(recalcitrantes)的 木本树种的物种和无性系的营养繁殖的困难，允许使用不能由常规手段产生的新的或更有 生产力的无性系。
[0028] -无性系清选（limpeza clonal)，通过在不会与其他克隆体混合的情况下获得没 有致病微生物的植物和作物的基质以及还有单一克隆的具有高遗传稳定性的培养物。
[0029] -除了所选择无性系和基质的复壮之外，还通过优良无性系的繁殖加速育种程 序，目的是在较少时间内和减小的空间内产生较大的数量的幼苗。
[0030] 重要的是要注意，使用根据本发明的方法获得的芽(或微繁殖的产物）用于特定容 器(其可以是管、塞、泡沫塑料托盘或其他容器）中的直接播种替代了来自已知的无性系花 园(无性系迷你园或无性系微型园）嫩枝供应至市场。这是本发明的微繁殖方法中使用的技 术的一大优势，且另一个优势是随着桉属的生产，在数量和质量方面呈现出无以伦比的回 馈，这与无性系花园中使用的技术是不可比的。
[0031] 根据本发明的生物反应器中营养培养基培养的说明
[0032] 生物反应器中植物生长和发育的整个过程中，可以使用两种基本培养基，如下所 示。根据培养需要和生理阶段，根据本发明将这些培养基化学改性以照料特定的无性系。该 培养基补充有生长植物调节剂(行1：〇1^6〖1113(1〇^8)，培育芽增殖、嫩枝伸长和微扦插苗体 外生根的预诱导。
[0033]生长调节剂浓聚物类型以及其管理生物反应器工艺的用途是本领域中常用的那 些，同时适当适应优选包括木本树种以及更优选地桉属的用于繁殖的所需物种的培养。 [0034]表1:液体营养培养基型JADS(参见Correia，D. 1993. "在液体和固体培养基中桉属 的体外增殖中芽的生长和发育（Crescimento e desenvolvimento de gemas na multipiict^aode eucalipto in vitro em meio de culturaliquido e S0lid〇) ·"林业 科学硕士学位论文（Di.S.sert%E〇:de Mestrado emCi^nciasFlorestais)，路易斯德凯农 学院（Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz)，皮拉西卡巴（Piracicaba))
[0035]
[0山6」 表2:淞体宫乔培乔.MS型（参见Murashige，T·&Skoog，K· 1962 ·用t烟皁組织培乔 物快速生长和生物测定的改进培养基（A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue cultures·)植物生理学（Physiologia Plantarum) 15: 473-497)
[0037]
[0038] 微扦插苗在生物可降解塞中的种植
[0039] 如图1所示，将伸长的嫩枝从实验室转移至进行生根和驯化阶段的命名为钟形玻 璃盖(Estufim)的受控环境。要这么做，将嫩枝分离并将每个个体置于含有固体培养基的容 器中，这类容器置于托盘中或在架上。有用于无性系幼苗生根的一些特定类型的容器，如以 下所记载的类型。
[0040] 种植容器和托盘:
[0041 ] Ellepot EP：由丹麦公司Ellegaard?:生产的可降解塑料管，包含：白色聚酯或纤 维膜和具有圆柱形状的孔;容量:85cc和110cc;尺寸:30 X 100mm和40 X 100mm。
[0042] Jiffy Pellet:由挪威公司Jiffy?:生产的生物可降解塑料管，包含有椰子纤维和 水藓泥炭的可膨胀插入物，圆柱形;容量:85cc和110cc;尺寸:30 X 100mm和36 X 100mm。
[0043] Care-Free?型泥炭颗粒可膨胀片:尺寸：30 X100和36 X100,干燥和压制的水藓 泥炭、珍珠岩和矿物添加物的组合，涂覆有渗透膜和生物可降解PLA，由挪威公司Jiffy?的 加拿大分部生产。
[0044] Air-Trav? 托盘 117:打算作为用于 CareFree? Jif f y-Pe 11 ets 30 X 100mm和 390父590111111(2301〇112)的支架，具有117个单元，且平均面积为19.6〇11 2/单元，对于占用率为 100%的托盘(处理T-l)。
[0045] Air-Tray?托盘64:打算作为用于CareFree?Jiffy-Pellets 36 X 100mm和380 父380_(1444〇112)的支架，具有64个单元，且平均面积为22.5〇11 2/单元，对于占用率为100% 的托盘(处理T-2)。
[0046] 托盘中颗粒合理配置之后，它们必须放置成它们的底部（基部）与纯水的浅层接 触，使得托盘中的颗粒未覆盖(或漂浮)在水中。这是颗粒膨胀的过程，在这种情况下，该过 程通过毛细管作用使它们"再水化"。重要的是要注意，颗粒的基部应保持与水的该层接触， 直到完全膨胀。如果水深减小（由于颗粒的吸收），则必须更换水。不必担心"过量水"。该操 作仅花费几分钟。如果有人想使膨胀过程加速，则其可利用约45°C的热水。在这种情况下， 有必要提前使颗粒膨胀数分钟，从而使得开始接受微扦插苗之前它们的温度接近室温。 [0047]微繁殖的桉属幼苗的驯化技术
[0048] 一般而言，在微繁殖的桉属植物种群中，很可能小亚种群将由于微繁殖中生物反 应器和其他烧瓶内的条件不平衡而呈现出解剖学、形态学以及生理学的异常。所有这些变 化都与用于微扦插苗生根和之后的幼苗驯化的过程的不适当条件相关，并因此降低了幼苗 的存活率和质量。
[0049] 应用驯化技术的目的是提供体外（生物反应器)和外部(苗圃）环境之间过渡中的 较好分等级（gradua?S〇)。这些技术中，我们强调利用雾雾系统（systemas de mist e fog)，有助于维持植物活力和降低蒸发需要。遮阴帮助降低来自外部环境的高水平的亮度， 且也帮助降低驯化中植物的温度和压力。
[0050] 可替换地，其他产品和保护的环境可用在生物反应器中生产的微扦插苗的种植 中。所用的产品包括用于种植在木质纤维容器中的由生物可降解聚合物稳定的底质 (substratos)，和椰子纤维以及水藓泥炭（turfa de Sphagnum)。这些容器用作压制的颗粒 且当水化时是可膨胀的。
[0051 ] 有雾和钟形玻璃盖的栽培系统
[0052] 该系统生成有直径小于15微米的极小水滴的雾，用特定喷嘴或超声喷雾器在钟形 玻璃盖环境内将该水滴雾化，生成超薄(<5μπι)干雾。这些液滴如此小，以致它们保持悬浮在 空气中，直至蒸发，有助于增加湿度和温度降低，且同时避免叶湿润。这些悬浮中的水滴能 维持两个叶表面上非常薄的水汽膜，这保持幼苗吸胀(torgiadas )和温度可控。
[0053] 雾系统与钟形玻璃盖结构一起使用，该结构优选为特别设计用于桉属生根和驯化 的结构。该钟形玻璃盖由迷你温室或正常温室内的拱形大棚（sobre-n'ineis)的组装体组 成，保持悬在圆形桌上。钟形玻璃盖中幼苗的生长和发育期间，利用地下灌溉系统（流动 的），这使生物可降解塞的基部间歇浸没在用于向植物供应营养素的水或营养溶液中，而无 需湿润幼苗的地上部分。
[0054] 生物可降解塞中微扦插苗移植技术
[0055]生物可降解容器内生物反应器中生产的微扦插苗的种植体系包括选择有满意质 量的标准微扦插苗和将微扦插苗的基部插入袋子或之前水化的压制颗粒(塞），如上所描述 的。
[0056] · Jiffy再水化和膨胀阶段：
[0057] 一将颗粒置于托盘之后，它们必须放置成在室温下它们的底部(基部）与纯水的浅 层接触，使得在种植微扦插苗之前托盘中的颗粒未覆盖(或漂浮)在水中，直至完全膨胀。 [0058] 一仅通过毛细管作用而不通过它们在水中的浸没完成颗粒的再水化。重要的是要 注意，颗粒的基部应保持与水层接触，直至它们完全膨胀。如果水位降低（由于颗粒的吸 收），则必须更换水。不必担心过量水。该操作仅花费几分钟。
[0059] 一如果有人想使膨胀过程加速，则其可利用加热至约45°C的水。在这种情况下，有 必要提前使颗粒膨胀数分钟，从而使得种植期间开始接受微扦插苗之前它们的温度接近室 温。
[0060] 通过非限制性实施例，提供了关于可用于进行生物反应器中生产的微型粧的种植 的技术的一些信息。
[0061] ?塞和托盘的技术规格(PLA网=生物可降解的玉米淀粉树脂）
[0062]
[0063] ?幼苗托盘的空间管理：
[0064]
[0065] ?灌溉管理：
[0066] 一灌溉用水深度的应用应调整以达到每种底质的田间持水量，特别是生根(CV)和 驯化(CA)阶段时，其中E11印ot和Jiffy必须是未经水饱和的。
[0067]-在温室中，灌溉管理应产生持续时间短的灌溉间隔和灌溉之间的间隔，例如，灌 溉之间每10-15分钟6秒的持续时间，以在不出现底质的灌溉的情况下提高相对湿度的水 平。
[0068] 一在驯化中，灌溉管理应允许Ellepot和Jiffy的底质完全湿润，而不会引起其的 过度和饱和。例如，遮阳网型的遮阴必须仅在当天的最热的一段时间例如上午11点至下午2 点保持延长。
[0069] -相反，在生长(PC)和硬化（Rustifica?3o)(PR)阶段，由于对较大水深的需要， Ellepot和Jiffy应是几乎饱和的，以弥补来自容器、根系吸收和叶片蒸腾的蒸发损失。
[0070] 一另外，在生长和硬化梯田中，Ellepot和Jiffy的灌溉推荐使用用于均匀湿润整 个底质的灌溉杆或喷头。
[0071] ?底质湿度的监测：
[0072] 一Ellepot和Jiffy容器中的生根和幼苗生长过程期间，必须监测底质的含水量， 以建议灌溉变化(持续时间和间隔)使得底质含量保持在田间持水量的理想范围内。
[0073] -这些瞬时实时的底质水分测量必须利用便携式水分测定仪+电导率+温度，例如 AT商标(Delta-T brand)模型湿度传感器(model WET Sensor)来进行。该设备必须在实验 室中校准以用于用在测试中的底质。
[0074] 一该湿度传感器必须插到Ellepot和Jiffy内的至少两个位置(深度）中，因为仅传 感器的尖部能准确地记录根围区域中的值。在CV中，该位置应是浅的（2-3cm)，在CA中，该位 置应在中间（3-6cm)，以及在PC位置中，其应在底部(7-9cm) 〇
[0075] -在一次测量与另一次之间，必须等待一段时间（10-15秒）用于湿底质中的传感 器稳定。在相同Ellepot或Jiffy中，第一测量必须在较低湿度时进行，第二测量必须在较高 湿度时进行。
[0076] -我们建议以下范围的水分用于测试中的底质，用湿度传感器测量，如下所示：
[0077]
[0078] 实施例
[0079]实施例1 一获得桉属无性系幼苗
[0080]本发明的用于在生物反应器中通过间歇浸没技术获得桉属无性系幼苗方法包括 以下步骤：
[0081 ]步骤1 一在将植物浸没于培养基和生物反应器内部隔室气氛的气体交换之间的间 隔期间，植物材料保持静止。将培养基储存在外容器(下)和内隔室(上面的）中的外植体中。 该有效光合辐射生物反应器由有蓝色、红色和白色颜色的LED灯的管状固定装置组成。 [0082]步骤2-通过在一定范围预设时间和持续时间的定时器启动电磁阀。这允许压缩 空气进入外容器，增加了外隔室（下）内的压力，使得液体培养基通过容器之间的连接通道 转移到植物的内室(上）中，并接触到培养物的基部。间歇浸没的管理随桉属无性系的类型 以及随培养阶段而变化。在嫩枝的增殖阶段中，间歇浸没以及持续1-2分钟的浸没之间用2-3小时。在嫩枝伸长阶段时，间歇浸没以及持续20-30秒的浸没之间用4-5小时。
[0083]步骤3-浸没期之后，关闭电磁阀，且培养基通过重力经排出管(drenos)回到外壳 体中。在此阶段时，发生与注入分配植物材料的内容器的压缩空气的交换。该气体交换(空 气和二氧化碳）由通过定时器控制的电磁阀驱动。
[0084]步骤4 一随着以每分钟1.3升的流率在植物材料生长的内容器中注入特定浓度的 C02，发生气体交换，以提高作物的光合和生产能力，流量为每秒500微摩尔C02，浓度为每摩 尔空气800-1000摩尔的C〇2。该气体交换也通过定时器控制的电磁阀驱动。
[0085] PAR辐射一在整个生产周期中，我们使用光合有效辐射(PAR)，其对应用于作物生 长和发育的400nm至700nm的范围。在该情况中，使用具有发光二极管(LED)的电灯代替生物 工厂中采用的传统荧光灯。植物主要吸收红光范围（600nm至700nm)和蓝光(400nm至500nm) 中的光谱，因此，控制照明管理以提供分别用于增殖和伸长的3/1(红光/蓝光)至2/1(红光/ 蓝光）的比率。根据培养的生理阶段，PAR的强度也不同。典型地，在增殖阶段，使用20-30μ mol/m2/s，和在伸长阶段，使用 4〇-60ymol/m2/s。
[0086] 该说明书中提到的所有出版物和专利申请都表明本实用新型涉及的本领域技术 人员的水平。所有出版物和专利申请都通过引用并入本文中，其参考程度如同各单个出版 物或专利申请各自具体地和个别地表明被并入的一样，以便参考。
[0087] 尽管已描述了某些实施方式，但是它们仅是以示例性方式示出，而不意图限制本 实用新型的范围。所附权利要求和该说明书中它们的等同方案被认为涵盖了在本实用新型 的范围和精神内的这类形式或改进。
【主权项】
1. 用于植物材料体外微繁殖的方法，所述方法包括通过间歇浸没方法增殖和伸长由植 物幼苗发育的嫩枝的步骤，所述步骤包括： (a) 在所述嫩枝的增殖步骤中，将待繁殖材料铺展在第一容器（营养繁殖容器）中的适 当支持物上，并在来自第二容器(液体培养基的贮藏容器)的液体营养培养基中进行间歇浸 没管理，所述管理包括浸没和静止的交替期； (b) 在所述嫩枝伸长的步骤中，优选地使用步骤(a)的相同营养培养基对所述繁殖材料 进行间歇浸没管理，所述管理包括浸没和静止的交替期，其中所述方法在所述步骤(b)(伸 长）中，分别与(增殖的）步骤(a)中的浸没期和静止期相比，所述浸没期显著较短，且所述静 止期较长。2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述植物材料是木本植物。3. 根据权利要求2所述的方法，其中所述木本植物是桉属物种。4. 根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(a)中，所述浸没期为至少1分钟，且所述静 止期为至少2小时。5. 根据权利要求4所述的方法，其中所述浸没期最大为3分钟，且所述静止期至多为4小 时。6. 根据权利要求4或5中任一项所述的方法，其中所述浸没期为1分钟至2分钟，且所述 静止期为2小时至3小时。7. 根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(b)中，所述浸没期为至少20秒，且所述静止 期为至少4小时。8. 根据权利要求7所述的方法，其中所述浸没期最大为60秒，且所述静止期至多为6小 时。9. 根据权利要求7或8中任一项所述的方法，其中所述浸没期为20秒至30秒，且所述静 止期为4小时至5小时。10. 根据权利要求1所述的方法，其中所述植物材料的体外微繁殖在BIT型的生物反应 器中进行。11. 用于大规模和大批量生产准备用于田间开发的无性系植物幼苗的方法，所述方法 包括以下步骤：（i)通过如权利要求1-10所限定的方法进行植物材料的营养繁殖；（ii)允许 步骤(i)中获得的伸长的嫩枝在适用于维持植物膨压和降低蒸发需要的条件的容器中生根 和驯化；以及(iii)使步骤(ii)中获得的微扦插苗能生长和驯化，直到所述无性系幼苗的大 小适用于转移至田间。12. 根据权利要求11所述的方法，其中所述步骤(ii)在潮湿环境中进行，其中水蒸汽液 滴如此小，以致能保持悬浮在空气中直至蒸发，同时避免叶面湿润。
【文档编号】A01H4/00GK105939598SQ201480071933
【公开日】2016年9月14日
【申请日】2014年10月30日
【发明人】R·M·彭切尔, J·P·D·雷斯, M·L·D·奥利韦拉
【申请人】非布利亚塞鲁罗斯股份公司