一种罗汉果外植体表面灭菌技术的制作方法
【专利摘要】本发明提供的一种罗汉果外植体表面灭菌技术，属于植物组织培养技术领域，使用本发明的方法处理的罗汉果外植体，其外植体的污染率降低到15％以下，褐化率降低到5以下，诱导率在50％以上，该处理方法能够保证后续的组织培养的成活率提高。
【专利说明】
一种罗汉果外植体表面灭菌技术
技术领域
[0001] 本发明属于植物组织培养技术，尤其涉及一种罗汉果外植体表面灭菌技术。
【背景技术】
[0002] 罗汉果(学名：Siraitiagrosvenorii)是萌芦科多年生藤本植物。其叶心形，雌雄 异株，夏季开花，秋天结果。中医以其果实入药，含有罗汉果甜苷、多种氨基酸和维生素等药 用成分，主治肺热痰火咳嗽、咽喉炎、扁桃体炎、急性胃炎、便秘等。因为罗汉果是雌雄异株， 又花期不遇，加之花粉粘重且着生于花药不易被昆虫触及的地方，所以很难像普通的风媒 花或虫媒花那样传粉，因此自然条件下，结果的机率极低（目前人工栽培仍然必须人工授 粉）。同时，罗汉果种子实生苗有70%左右为雄株，且要等到2~3年之后，开花时才能判定， 生产上基本无实用价值。但是，罗汉果的习性是，到了秋季分枝藤蔓会向下垂，并迅速伸长， 一经着地就会膨大变作指头大小的块茎(俗称"薯块"、"薯仔"），可以顽强地越冬，来年萌发 成为独立的新植株。这是罗汉果自然繁殖的重要方式。在人工栽培之后，演化成了人工压 蔓，小"块茎"依然是罗汉果最重要的种源。然而，这些传统块茎容易传播病毒及其它病虫 害，又难以大批量生产，无法满足现代规模化种植的需求。
[0003] 世纪末无菌无毒的罗汉果组培苗研究成功，很快就取代传统块茎成为最重要的种 源。先研究在罗汉果组培技术前，其消毒杀菌下过不是很理想，导致后面的组织培养成活率 不尚。
【发明内容】
[0004] 为解决上述技术问题，本发明提供了一种罗汉果外植体表面灭菌技术。
[0005] 本发明通过以下技术方案得以实现。
[0006] 本发明提供的一种罗汉果外植体表面灭菌技术，包括以下步骤：
[0007] 1)使用常规方法制作罗汉果组培苗，并取中间健壮部分，分切成带腋芽单节茎段；
[0008] 2)用浓度为3~5%的肥皂水浸泡5~lOmin，捞起后使用无菌水冲洗一次；
[0009] 3)再用浓度为0.05~0.1 %的柠檬酸溶液浸泡5~lOmin，捞起后使用无菌水冲洗 一次；
[0010] 4)再用浓度50~60%的酒精溶液浸泡15~20s，捞起后使用无菌水冲洗一次；
[0011] 5)再使用浓度为0.1~0.3%的高锰酸钾溶液浸泡3~5min，捞起后使用无菌水冲 洗一次，得到灭菌的罗汉果外植体。
[0012] 进一步的，包括以下步骤：
[0013] 1)使用常规方法制作罗汉果组培苗，并取中间健壮部分，分切成带腋芽单节茎段；
[0014] 2)用浓度为4%的肥皂水浸泡8min，捞起后使用无菌水冲洗一次；
[0015] 3)再用浓度为0.08%的柠檬酸溶液浸泡8min，捞起后使用无菌水冲洗一次；
[0016] 4)再用浓度55 %的酒精溶液浸泡18s，捞起后使用无菌水冲洗一次；
[0017] 5)再使用浓度为0.2%的高锰酸钾溶液浸泡4min，捞起后使用无菌水冲洗一次，得 到灭菌的罗汉果外植体。
[0018] 进一步的，得到灭菌的罗汉果外植体使用紫外线照射10~20s。
[0019] 进一步的，得到的灭菌的罗汉果外植体用滤纸包裹，并对滤纸喷洒MS+BA0.5~ 0.7mg/L+IAA0.1~0.2mg/L+蔗糖30g/L的溶液喷洒，使得滤纸足够湿润。
[0020] 本发明的有益效果在于:使用本发明的方法处理的罗汉果外植体，其外植体的污 染率降低到15%以下，褐化率降低到5以下，诱导率在50%以上，该处理方法能够保证后续 的组织培养的成活率提高。
[0021 ]为了证明本发明的技术效果，本发明还提供以下试验例：
[0022] 试验例一
[0023] 试验组1:其处理步骤为：
[0024] 1)使用常规方法制作罗汉果组培苗，并取中间健壮部分，分切成带腋芽单节茎段；
[0025] 2)用浓度为4%的肥皂水浸泡8min，捞起后使用无菌水冲洗一次；
[0026] 3)再用浓度为0.08%的柠檬酸溶液浸泡8min，捞起后使用无菌水冲洗一次；
[0027] 4)再用浓度55 %的酒精溶液浸泡18s，捞起后使用无菌水冲洗一次；
[0028] 5)再使用浓度为0.2%的高锰酸钾溶液浸泡4min，捞起后使用无菌水冲洗一次，得 到灭菌的罗汉果外植体。
[0029] 6 )得到的灭菌的罗汉果外植体用滤纸包裹，并对滤纸喷洒MS + BAO . 6mg/L+ ΙΑΑ0.2mg/L+蔗糖30g/L的溶液喷洒，使得滤纸足够湿润
[0030] 试验组2:其处理步骤为：
[0031] 1)使用常规方法制作罗汉果组培苗，并取中间健壮部分，分切成带腋芽单节茎段；
[0032] 2)用浓度为4%的肥皂水浸泡8min，捞起后使用无菌水冲洗一次；
[0033] 3)再用浓度为0.08%的柠檬酸溶液浸泡8min，捞起后使用无菌水冲洗一次；
[0034] 4)再用浓度55 %的酒精溶液浸泡18s，捞起后使用无菌水冲洗一次；
[0035] 5)再使用浓度为0.2 %的高猛酸钾溶液浸泡4min，捞起后使用无菌水冲洗一次，得 到灭菌的罗汉果外植体；
[0036] 6)得到灭菌的罗汉果外植体使用紫外线照射10~20s;
[0037] 7 )得到的灭菌的罗汉果外植体用滤纸包裹，并对滤纸喷洒MS + BAO . 6mg/L+ ΙΑΑΟ. 2mg/L+蔗糖30g/L的溶液喷洒，使得滤纸足够湿润 [0038] 对照组：其处理步骤为：
[0039] 1)使用常规方法制作罗汉果组培苗，并取中间健壮部分，分切成带腋芽单节茎段；
[0040] 2)使用无菌水进行处理；
[0041] 检测上述试验的诱导率、污染率和褐化率，具体如下表：
[0042]
[0043]
[0044] 结果表明，使用本发明的方法处理的罗汉果外植体，其外植体的污染率降低到 15%以下，褐化率降低到5以下，诱导率在50%以上，该处理方法能够保证后续的组织培养 的成活率提尚。
【具体实施方式】
[0045] 下面进一步描述本发明的技术方案，但要求保护的范围并不局限于所述。
[0046] 实施例一
[0047] 本发明提供的一种罗汉果外植体表面灭菌技术，包括以下步骤：
[0048] 1)使用常规方法制作罗汉果组培苗，并取中间健壮部分，分切成带腋芽单节茎段；
[0049] 2)用浓度为3%的肥皂水浸泡5min，捞起后使用无菌水冲洗一次；
[0050] 3)再用浓度为0.05%的梓檬酸溶液浸泡5min，捞起后使用无菌水冲洗一次；
[00511 4)再用浓度50~60%的酒精溶液浸泡15s，捞起后使用无菌水冲洗一次；
[0052] 5)再使用浓度为0.1 %的高猛酸钾溶液浸泡3min，捞起后使用无菌水冲洗一次，得 到灭菌的罗汉果外植体。
[0053] 6 )得到的灭菌的罗汉果外植体用滤纸包裹，并对滤纸喷洒MS + BAO . 6mg/L+ ΙΑΑ0.2mg/L+蔗糖30g/L的溶液喷洒，使得滤纸足够湿润。
[0054] 实施例二
[0055] 本发明提供的一种罗汉果外植体表面灭菌技术，包括以下步骤：
[0056] 1)使用常规方法制作罗汉果组培苗，并取中间健壮部分，分切成带腋芽单节茎段；
[0057] 2)用浓度为5%的肥皂水浸泡lOmin，捞起后使用无菌水冲洗一次；
[0058] 3)再用浓度为0.1%的柠檬酸溶液浸泡lOmin，捞起后使用无菌水冲洗一次；
[0059] 4)再用浓度60 %的酒精溶液浸泡20s，捞起后使用无菌水冲洗一次；
[0060] 5)再使用浓度为0.3%的高锰酸钾溶液浸泡5min，捞起后使用无菌水冲洗一次，得 到灭菌的罗汉果外植体。
[0061 ] 6 )得到的灭菌的罗汉果外植体用滤纸包裹，并对滤纸喷洒MS + BAO . 6mg/L+ ΙΑΑ0.2mg/L+蔗糖30g/L的溶液喷洒，使得滤纸足够湿润。
[0062] 实施例三
[0063] 本发明提供的一种罗汉果外植体表面灭菌技术，包括以下步骤：
[0064] 1)使用常规方法制作罗汉果组培苗，并取中间健壮部分，分切成带腋芽单节茎段；
[0065] 2)用浓度为4%的肥皂水浸泡8min，捞起后使用无菌水冲洗一次；
[0066] 3)再用浓度为0.08%的柠檬酸溶液浸泡8min，捞起后使用无菌水冲洗一次；
[0067] 4)再用浓度55 %的酒精溶液浸泡18s，捞起后使用无菌水冲洗一次；
[0068] 5)再使用浓度为0.2 %的高猛酸钾溶液浸泡4min，捞起后使用无菌水冲洗一次，得 到灭菌的罗汉果外植体；
[0069] 6)得到灭菌的罗汉果外植体使用紫外线照射10~20s;
[0070] 7 )得到的灭菌的罗汉果外植体用滤纸包裹，并对滤纸喷洒MS + BAO . 6mg/L+ ΙΑΑ0.2mg/L+蔗糖30g/L的溶液喷洒，使得滤纸足够湿润。
【主权项】
1. 一种罗汉果外植体表面灭菌技术，其特征在于包括以下步骤： 1) 使用常规方法制作罗汉果组培苗，并取中间健壮部分，分切成带腋芽单节茎段； 2) 用浓度为3~5 %的肥皂水浸泡5~lOmin，捞起后使用无菌水冲洗一次； 3) 再用浓度为0.05~0.1 %的梓檬酸溶液浸泡5~lOmin，捞起后使用无菌水冲洗一次； 4) 再用浓度50~60 %的酒精溶液浸泡15~20s，捞起后使用无菌水冲洗一次； 5) 再使用浓度为0.1~0.3%的高锰酸钾溶液浸泡3~5min，捞起后使用无菌水冲洗一 次，得到灭菌的罗汉果外植体。2. 如权利要求1所述的罗汉果外植体表面灭菌技术，其特征在于包括以下步骤： 1) 使用常规方法制作罗汉果组培苗，并取中间健壮部分，分切成带腋芽单节茎段； 2) 用浓度为4 %的肥皂水浸泡8min，捞起后使用无菌水冲洗一次； 3) 再用浓度为0.08 %的柠檬酸溶液浸泡8min，捞起后使用无菌水冲洗一次； 4) 再用浓度55 %的酒精溶液浸泡18s，捞起后使用无菌水冲洗一次； 5) 再使用浓度为0.2 %的高锰酸钾溶液浸泡4min，捞起后使用无菌水冲洗一次，得到灭 菌的罗汉果外植体。3. 如权利要求1或2所述的罗汉果外植体表面灭菌技术，其特征在于:得到灭菌的罗汉 果外植体使用紫外线照射10~20s。4. 如权利要求1或2所述的罗汉果外植体表面灭菌技术，其特征在于:得到的灭菌的罗 汉果外植体用滤纸包裹，并对滤纸喷洒MS+BA0 · 5~0 · 7mg/L+IAA0 · 1~0 · 2mg/L+鹿糖30g/L 的溶液喷洒，使得滤纸足够湿润。
【文档编号】A01H4/00GK105993953SQ201610371100
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月27日
【发明人】张俊连, 罗小廷, 张俊蛟
【申请人】贵州德江易盛农业科技发展有限公司