一种苹果砧木组培繁殖技术的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种苹果砧木组培繁殖技术，所述苹果砧木组培繁殖技术，包括以下步骤：1)前处理，2)无菌组织建立，3)愈伤组织分化培养及扩大培养，4)增长培养，5)分化出根，6)移栽培养；本发明所提供的组培繁殖技术，具有繁殖系数高、生产周期短、程序简单易于操作、成本低廉等优点，适于苹果砧木的快速繁殖。
【专利说明】
一种苹果砧木组培繁殖技术
技术领域
[0001]本发明涉及植物组织培养技术领域，具体是一种苹果砧木组培繁殖技术。
【背景技术】
[0002]苹果(Apple)，是最常见的水果之一。苹果树属于蔷薇科，落叶乔木，叶椭圆形，有锯齿。其果实球形，味甜，口感爽脆，且富含丰富的营养，是世界四大水果之冠。苹果通常为红色，不过也有黄色和绿色。苹果是一种低热量食物，每100克只产生60千卡热量。苹果属落叶乔木，高达15米，树干灰褐色，老皮有不规则的纵裂或片状剥落，小枝幼时密生绒毛，后变光滑，紫褐色。叶序为单叶互生，椭圆形到卵形，长4.9?10厘米，先端尖，缘有圆钝锯齿，幼时两面有毛，后表面光滑，暗绿色。花白色带红晕，径3?5厘米，花梗与花萼均具有灰白色绒毛，萼叶长尖，宿存，雄蕊20，花柱5，大多数品种自花不育，需种植授粉树。果为略扁之球形，径5厘米以上，两端均凹陷，端部常有棱脊。花期4?6月；果期7?11月果熟。苹果是落叶乔木，有较强的极性，通常生长旺盛，树冠高大，树高可达15米，栽培条件下一般高3?5米左右。树干灰褐色，老皮有不规则的纵裂或片状剥落，小枝光滑。果实为仁果，颜色及大小因品种而异。喜光，喜微酸性到中性土壤。最适于土层深厚、富含有机质、心土为通气排水良好的沙质土壤。繁殖栽培用嫁接繁殖。砧木有乔化砧和矮化砧。常用乔化砧有:楸子、西府海棠、山荆子，矮化砧主要引进英国品种。采用宽行密植，行向南北。偏南部地区秋冬土壤封冻前栽植，偏北部地区春季解冻时栽植。苹果自花结实力差，栽植时必须配置授粉树。当前苹果砧木的组培繁殖技术存在操作复杂，繁殖周期长，成本较高等缺陷；因此苹果砧木组培繁殖技术的开发，是十分紧迫的任务。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于提供一种苹果砧木组培繁殖技术，以解决上述【背景技术】中提出的问题。
[0004]为实现上述目的，本发明提供如下技术方案:
[0005]—种苹果砧木组培繁殖技术，包括以下步骤:
[0006]I)前处理
[0007]挑选健康无虫害1cm长左右的苹果站木半木质化新枝，去除杂叶和顶芽，使用无菌水清洗枝条表面的灰尘并裁剪成四个茎段；随后置于2%浓度的二氧化氯溶液中浸泡1min，使用小苏打水冲洗15-20min，并置于保鲜膜中喷水放置，放置时间不超过6h;
[0008]2)无菌组织建立
[0009]在无菌工作台上，将步骤I)中采集到的茎段放入锥形瓶中，首先加入过氧化氢在摇床上进行摇晃浸泡2min，迅速倒出，然后加入次氯酸钠溶液进行搅拌处理5min，处理后使用无菌水反复冲洗，并使用热风机吹干茎段表面的水分;使用无菌刀沿着茎段的横向位置将茎段剪开小断口，随后将含有小断口的茎段接种在初代培养基中，并使其保持直立，初代培养条件为:黑暗，25°C-28°C，培养8天-15天；
[0010]3)愈伤组织分化培养及扩大培养
[0011]将在初代培养基中培养后的材料放置愈伤组织培养基中进行诱导分化，直至茎段中的小断口产生淡黄色愈伤组织，愈伤组织培养条件为:900LX-1 10Lx，26°C-28°C，光照时间12h-16h，黑暗时间12h-8h，培养8天-15天;愈伤组织培养结束后，将茎段放置扩大培养基中进行增殖培养，如此循环往复，直至得到所需数量的无根苗；
[0012]4)增长培养
[0013]将无根苗的基部切开产生小断口，转入到增长培养基中培养，直至小断口处生芽长度为2cm以上时，并切下放置增长培养基中继续培养7天，增长培养条件为SOOLx，28 °C_30°C，光照时间4h-8h，黑暗时间20h-16h;
[0014]5)分化出根
[0015]增长后的无根苗达到14cm-18cm时，将它们转入生根诱导培养基中，生根诱导培养条件为:开始的3天-5天，黑暗，24°C培养;I OOOLx光照，28 °C培养15天；
[0016]6)移栽培养
[0017]待苗生根3-5条，根长3-5cm时，使用无菌水彻底洗净苗根，并在0.8%浓度的高锰酸钾溶液中浸泡3min，最后移栽到由细砂土、硅藻土和腐殖质组成并灭菌的基质中，套上塑料膜，保持相对湿度72%-76%，温度280C-340C，3200Lx光照，48h，随后按照一般试管苗方法进行管理。
[0018]作为本发明进一步的方案:所述初代培养基主要成份为l/2MS+l/2NB+2mg//L钼酸钠+2mg/L盐酸吡哆醇+120mg/L三七粉+45mg/L肌醇+30g/L蔗糖+4g/L琼脂，pH 5.8-6.3。
[0019]作为本发明进一步的方案:所述愈伤组织培养基主要成份为MS+3mg/L6-BA+lmg/L NAA+80mg/Li3-羟基丁酸+20mg/L壳聚糖+32g/L蔗糖+6g/L琼脂，pH 5.8-6.0。
[0020]作为本发明进一步的方案:所述扩大培养基培养基主要成份为MS+0.2mg/LNAA+2.7mg/L IBA+0.8mg/L GA+2mg/L硫酸亚铁+20mg/L色氨酸+28g/L鹿糖+4g/L琼脂，pH 5.8-
6.0ο
[0021]作为本发明进一步的方案:所述增长培养基主要成份为2/3MS+0.2mg/LNAA+lmg/L GA3+0.1mg/L KT+2g/L蛋白胨+3g/L半乳糖+24g/L蔗糖+3g/L琼脂，pH 5.8-6.0。
[0022]作为本发明进一步的方案:所述生根诱导培养基主要成份为GS+0.7mg/LNAA+
1.4mg/L I BA+1.8mg/L硫辛酸+2.2mg/L维生素H+500mg/L活性炭+32g/L鹿糖+4.6g/L琼脂，pH 6.0-6.5o
[0023]与现有技术相比，本发明的有益效果是:
[0024]本发明所提供的组培繁殖技术，具有繁殖系数高、生产周期短、程序简单易于操作、成本低廉等优点，适于苹果砧木的快速繁殖。
【具体实施方式】
[0025]下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0026]实施例1
[0027]—种苹果砧木组培繁殖技术，包括以下步骤:
[0028]I)前处理
[0029]挑选健康无虫害1cm长左右的苹果站木半木质化新枝，去除杂叶和顶芽，使用无菌水清洗枝条表面的灰尘并裁剪成四个茎段；随后置于2%浓度的二氧化氯溶液中浸泡1min，使用小苏打水冲洗15min，并置于保鲜膜中喷水放置，放置时间不超过6h;
[0030]2)无菌组织建立
[0031]在无菌工作台上，将步骤I)中采集到的茎段放入锥形瓶中，首先加入过氧化氢在摇床上进行摇晃浸泡2min，迅速倒出，然后加入次氯酸钠溶液进行搅拌处理5min，处理后使用无菌水反复冲洗，并使用热风机吹干茎段表面的水分;使用无菌刀沿着茎段的横向位置将茎段剪开小断口，随后将含有小断口的茎段接种在初代培养基中，并使其保持直立，初代培养条件为:黑暗，25°C，培养8天；
[0032]3)愈伤组织分化培养及扩大培养
[0033]将在初代培养基中培养后的材料放置愈伤组织培养基中进行诱导分化，直至茎段中的小断口产生淡黄色愈伤组织，愈伤组织培养条件为:900Lx，260C，光照时间12h，黑暗时间12h，培养8天;愈伤组织培养结束后，将茎段放置扩大培养基中进行增殖培养，如此循环往复，直至得到所需数量的无根苗；
[0034]4)增长培养
[0035]将无根苗的基部切开产生小断口，转入到增长培养基中培养，直至小断口处生芽长度为2cm以上时，并切下放置增长培养基中继续培养7天，增长培养条件为SOOLx，28°C，光照时间4h，黑暗时间20h;
[0036]5)分化出根
[0037]增长后的无根苗达到14cm时，将它们转入生根诱导培养基中，生根诱导培养条件为:开始的3天，黑暗，24 °C培养;I OOOLx光照，28 °C培养15天；
[0038]6)移栽培养
[0039]待苗生根3条，根长3cm时，使用无菌水彻底洗净苗根，并在0.8%浓度的高锰酸钾溶液中浸泡3min，最后移栽到由细砂土、硅藻土和腐殖质组成并灭菌的基质中，套上塑料膜，保持相对湿度72%，温度28°C，3200Lx光照，48h，随后按照一般试管苗方法进行管理。
[0040]其中:
[0041 ] 所述初代培养基主要成份为l/2MS+l/2NB+2mg/L钼酸钠+2mg/L盐酸吡哆醇+120mg/L三七粉+45mg/L肌醇+30g/L蔗糖+4g/L琼脂，pH 5.8。
[0042]所述愈伤组织培养基主要成份为MS+3mg/L 6-BA+lmg/L NAA+80mg/U3-轻基丁酸+20mg/L壳聚糖+32g/L鹿糖+6g/L琼脂，pH 5.8。
[0043]所述扩大培养基培养基主要成份为MS+0.2mg/L NAA+2.7mg/L IBA+0.8mg/L GA+2mg/L硫酸亚铁+20mg/L色氨酸+28g/L鹿糖+4g/L琼脂，pH 5.8。
[0044]所述增长培养基主要成份为2/3MS+0.2mg/LNAA+lmg/L GA3+0.lmg/L KT+2g/L蛋白胨+3g/L半乳糖+24g/L蔗糖+3g/L琼脂，pH 5.8。
[0045]所述生根诱导培养基主要成份为GS+0.7mg/L NAA+1.4mg/L IBA+1.8mg/L硫辛酸+
2.2mg/L维生素H+500mg/L活性炭+32g/L鹿糖+4.6g/L琼脂，pH 6.0。
[0046]实施例2
[0047]—种苹果砧木组培繁殖技术，包括以下步骤:
[0048]I)前处理
[0049]挑选健康无虫害1cm长左右的苹果站木半木质化新枝，去除杂叶和顶芽，使用无菌水清洗枝条表面的灰尘并裁剪成四个茎段；随后置于2%浓度的二氧化氯溶液中浸泡lOmin，使用小苏打水冲洗18min，并置于保鲜膜中喷水放置，放置时间不超过6h;
[0050]2)无菌组织建立
[0051]在无菌工作台上，将步骤I)中采集到的茎段放入锥形瓶中，首先加入过氧化氢在摇床上进行摇晃浸泡2min，迅速倒出，然后加入次氯酸钠溶液进行搅拌处理5min，处理后使用无菌水反复冲洗，并使用热风机吹干茎段表面的水分;使用无菌刀沿着茎段的横向位置将茎段剪开小断口，随后将含有小断口的茎段接种在初代培养基中，并使其保持直立，初代培养条件为:黑暗，27°C，培养11天；
[0052]3)愈伤组织分化培养及扩大培养
[0053]将在初代培养基中培养后的材料放置愈伤组织培养基中进行诱导分化，直至茎段中的小断口产生淡黄色愈伤组织，愈伤组织培养条件为:1050Lx，27°C，光照时间14h，黑暗时间1h，培养12天;愈伤组织培养结束后，将茎段放置扩大培养基中进行增殖培养，如此循环往复，直至得到所需数量的无根苗；
[0054]4)增长培养
[0055]将无根苗的基部切开产生小断口，转入到增长培养基中培养，直至小断口处生芽长度为2cm以上时，并切下放置增长培养基中继续培养7天，增长培养条件为SOOLx，29°C，光照时间6h，黑暗时间18h;
[0056]5)分化出根
[0057]增长后的无根苗达到16cm时，将它们转入生根诱导培养基中，生根诱导培养条件为:开始的5天，黑暗，24 °C培养;I OOOLx光照，28 °C培养15天；
[0058]6)移栽培养
[0059]待苗生根4条，根长4cm时，使用无菌水彻底洗净苗根，并在0.8%浓度的高锰酸钾溶液中浸泡3min，最后移栽到由细砂土、硅藻土和腐殖质组成并灭菌的基质中，套上塑料膜，保持相对湿度74%，温度31°C，3200Lx光照，48h，随后按照一般试管苗方法进行管理。
[0060]其中:
[0061 ] 所述初代培养基主要成份为l/2MS+l/2NB+2mg/L钼酸钠+2mg/L盐酸吡哆醇+120mg/L三七粉+45mg/L肌醇+30g/L蔗糖+4g/L琼脂，pH 6.0。
[0062]所述愈伤组织培养基主要成份为MS+3mg/L 6-BA+lmg/L NAA+80mg/U3-轻基丁酸+20mg/L壳聚糖+32g/L鹿糖+6g/L琼脂，pH 6.0。
[0063]所述扩大培养基培养基主要成份为MS+0.2mg/L NAA+2.7mg/L IBA+0.8mg/L GA+2mg/L硫酸亚铁+20mg/L色氨酸+28g/L鹿糖+4g/L琼脂，pH 5.9。
[0064]所述增长培养基主要成份为2/3MS+0.2mg/LNAA+lmg/L GA3+0.lmg/L KT+2g/L蛋白胨+3g/L半乳糖+24g/L蔗糖+3g/L琼脂，pH 5.9。
[0065]所述生根诱导培养基主要成份为GS+0.7mg/L NAA+1.4mg/L IBA+1.8mg/L硫辛酸+
2.2mg/L维生素H+500mg/L活性炭+32g/L鹿糖+4.6g/L琼脂，pH 6.3。
[0066]实施例3
[0067]—种苹果砧木组培繁殖技术，包括以下步骤:
[0068]I)前处理
[0069]挑选健康无虫害1cm长左右的苹果站木半木质化新枝，去除杂叶和顶芽，使用无菌水清洗枝条表面的灰尘并裁剪成四个茎段；随后置于2%浓度的二氧化氯溶液中浸泡1min，使用小苏打水冲洗20min，并置于保鲜膜中喷水放置，放置时间不超过6h ；
[0070]2)无菌组织建立
[0071]在无菌工作台上，将步骤I)中采集到的茎段放入锥形瓶中，首先加入过氧化氢在摇床上进行摇晃浸泡2min，迅速倒出，然后加入次氯酸钠溶液进行搅拌处理5min，处理后使用无菌水反复冲洗，并使用热风机吹干茎段表面的水分;使用无菌刀沿着茎段的横向位置将茎段剪开小断口，随后将含有小断口的茎段接种在初代培养基中，并使其保持直立，初代培养条件为:黑暗，28°C，培养15天；
[0072]3)愈伤组织分化培养及扩大培养
[0073]将在初代培养基中培养后的材料放置愈伤组织培养基中进行诱导分化，直至茎段中的小断口产生淡黄色愈伤组织，愈伤组织培养条件为:IlOOLx，280C，光照时间16h，黑暗时间8h，培养15天;愈伤组织培养结束后，将茎段放置扩大培养基中进行增殖培养，如此循环往复，直至得到所需数量的无根苗；
[0074]4)增长培养
[0075]将无根苗的基部切开产生小断口，转入到增长培养基中培养，直至小断口处生芽长度为2cm以上时，并切下放置增长培养基中继续培养7天，增长培养条件为SOOLx，30°C，光照时间8h，黑暗时间16h;
[0076]5)分化出根
[0077]增长后的无根苗达到18cm时，将它们转入生根诱导培养基中，生根诱导培养条件为:开始的5天，黑暗，24 °C培养;I OOOLx光照，28 °C培养15天；
[0078]6)移栽培养
[0079]待苗生根5条，根长5cm时，使用无菌水彻底洗净苗根，并在0.8%浓度的高锰酸钾溶液中浸泡3min，最后移栽到由细砂土、硅藻土和腐殖质组成并灭菌的基质中，套上塑料膜，保持相对湿度76%，温度34°C，3200Lx光照，48h，随后按照一般试管苗方法进行管理。
[0080]其中:
[0081 ] 所述初代培养基主要成份为l/2MS+l/2NB+2mg/L钼酸钠+2mg/L盐酸吡哆醇+120mg/L三七粉+45mg/L肌醇+30g/L蔗糖+4g/L琼脂，pH 6.3。
[0082]所述愈伤组织培养基主要成份为MS+3mg/L 6-BA+lmg/L NAA+8Omg/L0-羟基丁酸+20mg/L壳聚糖+32g/L鹿糖+6g/L琼脂，pH 6.0。
[0083]所述扩大培养基培养基主要成份为MS+0.2mg/L NAA+2.7mg/L IBA+0.8mg/L GA+2mg/L硫酸亚铁+20mg/L色氨酸+28g/L鹿糖+4g/L琼脂，pH 6.0。
[0084]所述增长培养基主要成份为2/3MS+0.2mg/LNAA+lmg/L GA3+0.lmg/L KT+2g/L蛋白胨+3g/L半乳糖+24g/L蔗糖+3g/L琼脂，pH 6.0。
[0085]所述生根诱导培养基主要成份为GS+0.7mg/L NAA+1.4mg/L IBA+1.8mg/L硫辛酸+2.2mg/L维生素H+500mg/L活性炭+32g/L鹿糖+4.6g/L琼脂，pH 6.5。
[0086]综上所述，本发明采用上述组培繁殖技术后，生根率达97%以上，移栽成活率达95%以上。
[0087]对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
[0088]此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
【主权项】
1.一种苹果砧木组培繁殖技术，其特征在于，包括以下步骤: 1)前处理 挑选健康无虫害1cm长左右的苹果站木半木质化新枝，去除杂叶和顶芽，使用无菌水清洗枝条表面的灰尘并裁剪成四个茎段;随后置于2%浓度的二氧化氯溶液中浸泡lOmin，使用小苏打水冲洗15_20min，并置于保鲜膜中喷水放置，放置时间不超过6h; 2)无菌组织建立 在无菌工作台上，将步骤I)中采集到的茎段放入锥形瓶中，首先加入过氧化氢在摇床上进行摇晃浸泡2min，迅速倒出，然后加入次氯酸钠溶液进行搅拌处理5min，处理后使用无菌水反复冲洗，并使用热风机吹干茎段表面的水分;使用无菌刀沿着茎段的横向位置将茎段剪开小断口，随后将含有小断口的茎段接种在初代培养基中，并使其保持直立，初代培养条件为:黑暗，25°C-28°C，培养8天-15天； 3)愈伤组织分化培养及扩大培养 将在初代培养基中培养后的材料放置愈伤组织培养基中进行诱导分化，直至茎段中的小断口产生淡黄色愈伤组织，愈伤组织培养条件为:900Lx-l 10Lx，26°C-28°C，光照时间12h-16h，黑暗时间12h-8h，培养8天-15天;愈伤组织培养结束后，将茎段放置扩大培养基中进行增殖培养，如此循环往复，直至得到所需数量的无根苗； 4)增长培养 将无根苗的基部切开产生小断口，转入到增长培养基中培养，直至小断口处生芽长度为2cm以上时，并切下放置增长培养基中继续培养7天，增长培养条件为800Lx，28 °C-30 °C，光照时间4h-8h，黑暗时间20h-16h; 5)分化出根 增长后的无根苗达到14cm-18cm时，将它们转入生根诱导培养基中，生根诱导培养条件为:开始的3天-5天，黑暗，24 °C培养;I OOOLx光照，28 °C培养15天； 6)移栽培养 待苗生根3-5条，根长3-5cm时，使用无菌水彻底洗净苗根，并在0.8%浓度的高锰酸钾溶液中浸泡3min，最后移栽到由细砂土、硅藻土和腐殖质组成并灭菌的基质中，套上塑料膜，保持相对湿度72%-76%,温度280C-340C，3200Lx光照，48h，随后按照一般试管苗方法进行管理。2.根据权利要求1所述的苹果砧木组培繁殖技术，其特征在于，所述初代培养基主要成份为l/2MS+l/2NB+2mg/L钼酸钠+2mg/L盐酸吡哆醇+120mg/L三七粉+45mg/L肌醇+30g/L蔗糖+4g/L琼脂，pH 5.8-6.3。3.根据权利要求1或2所述的苹果砧木组培繁殖技术，其特征在于，所述愈伤组织培养基主要成份为MS+3mg/L 6-BA+lmg/L NAA+80mg/Li3-羟基丁酸+20mg/L壳聚糖+32g/L蔗糖+6g/L琼脂，pH 5.8-6.0。4.根据权利要求3所述的苹果砧木组培繁殖技术，其特征在于，所述扩大培养基培养基主要成份为MS+0.2mg/L NAA+2.7mg/L IBA+0.8mg/L GA+2mg/L硫酸亚铁+20mg/L色氨酸+28g/L鹿糖+4g/L琼脂，pH 5.8-6.0。5.根据权利要求4所述的苹果砧木组培繁殖技术，其特征在于，所述增长培养基主要成份为2/3MS+0.2mg/L NAA+lmg/L GA3+0.1mg/L KT+2g/L蛋白胨+3g//L半乳糖+24g/L蔗糖+3g/L琼脂，pH 5.8-6.0。6.根据权利要求4所述的苹果砧木组培繁殖技术，其特征在于，所述生根诱导培养基主要成份为 GS+0.7mg/L NAA+1.4mg/L I BA+1.8mg/L 硫辛酸+2.2mg/L 维生素 H+500mg/L 活性炭+32g/L蔗糖+4.6g/L琼脂，pH 6.0-6.5。
【文档编号】A01H4/00GK105993963SQ201610604544
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月26日
【发明人】周开全, 陈子敏, 李谦盛, 李方盛
【申请人】象山宏森源农产品开发有限公司