一种黄花倒水莲离体快繁育苗方法
【专利摘要】本发明公开了涉及一种黄花倒水莲离体快繁育苗方法。其以黄花倒水莲嫩茎为外植体，经消毒后，接种于MS+6?BA 2.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L的启动培养基中诱导不定芽发生，继而将不定芽接种在附加不同种类及浓度外源激素的增殖及生根培养基上进行增殖和生根培养，并将生根试管苗移栽于炼苗基质炼苗。本发明建立的黄花倒水莲离体快繁体系，取材方便，稳定性好，重复性高，为实现黄花倒水莲优良种质的快速繁殖以及解决其野生资源匮乏而在生产上供不应求的现状提供方法。
【专利说明】
一种黄花倒水莲离体快繁育苗方法
技术领域
[0001] 本发明涉及黄花倒水莲离体快繁技术领域，特别是涉及黄花倒水莲离体快繁育苗 方法。
【背景技术】
[0002] 黄花倒水莲/aDaz Hemsl.)别名黄花参、黄花吊水莲、观音串、黄花大 远志等，属远志科(Polygalaceae)远志属(PoJ/g'aJa)植物[1 ]。主要分布于我国的福建、湖 南、广西等地[2-4]。是一种较为珍稀的中药材，全草入药，性味甘、微苦，平。有补益气血，健 脾利湿，活血调经之功能。是瑶、苗、壮等少数民族常用的民间药物[5]。黄花倒水莲作为一 种珍贵的药材，随着药材市场对其需求不断增加，一再出现供不应求的局面，一些地区甚至 出现紧缺的状况。野生资源不断被挖掘利用，已难以满足目前的市场需求。黄花倒水莲以种 子繁殖较多，但繁殖能力弱[6]。因此要开发及利用好黄花倒水莲这一重要资源，就必须解 决其快繁问题。而组织培养技术是在短期内迅速扩大种苗数量的最有效方法。有关黄花倒 水莲的离体快繁研究，仅见国内有相关报道[7-9]，但在稳定性及可重复性方面有一定的局 限性。因此，建立稳定性好，重复性高的黄花倒水莲离体快繁技术，有望实现黄花倒水莲优 良种质的快速繁殖，对解决其野生资源匮乏而在生产上供不应求的现状具有重要意义。
[0003] 在现有技术中，申请号为201210147606.9,名称为一种黄花倒水莲的组织培养繁 殖方法已经公开了一种黄花倒水莲的组织培养繁殖方法，包括以下步骤： (1) 外植体采集及消毒:取黄花倒水莲当年生带腋芽幼嫩茎段作为外植体，用洗洁精浸 泡处理10 min，用软毛刷轻轻刷洗茎段表面，流水冲洗30 min，置于超净工作台上，剪成带 1-2个节间的茎段，用质量浓度为0.1%的ΚΜη04浸泡处理5min，无菌水冲洗2遍，体积浓度 为75%的乙醇浸泡处理20 s，再用质量浓度为0.1%的升汞浸泡处理10 min，无菌水冲洗6 遍，获得无菌材料； (2) 不定芽的诱导:将上述无菌材料接种于不定芽诱导培养基上，在温度25±1 °C，光 照时间11 h/d，光照强度3000 LX的条件下诱导黄花倒水莲不定芽，诱导培养30天； (3) 不定芽增殖培养:将诱导出的黄花倒水莲不定芽转接至不定芽增殖培养基中进行 不定芽的增殖培养，培养条件为:温度25±1 °C，光照时间11 h/d，光照强度3000 LX，增殖 培养25天； (4) 不定芽生根培养:将增殖培养的不定芽转入不定芽生根培养基中进行生根培养，培 养条件为:温度25±1 °C，光照时间11 h/d，光照强度3000 LX，生根培养25天即可获得组 培苗； (5) 炼苗及移栽:待组培苗80%长出根原基时将其移至大棚进行炼苗，7天后将瓶苗轻 轻夹出，洗净根部培养基，用质量浓度为0.1%的代森猛锌浸泡处理2~3 min，阴干，待植 株枝干上的水分阴干好后，移栽入事先已用质量浓度为0.1%的高锰酸钾消毒的移栽基质 中，保持环境温度25±1 °C，喷雾保湿，使空气湿度保持在85-95%，覆盖遮阴率70%的遮阳 网，每7天喷洒一次广谱杀菌剂，30天后长出新根时浇一次两倍MS大量元素溶液。
[0004] 该专利通过取以当年生幼嫩带腋芽(未萌发)茎段作为外植体，经消毒获得无菌材 料后，通过诱导不定芽，再经不定芽的增殖、生根从而获得组培苗，组培苗经过驯化获得栽 培苗，从外植体的诱导到获得存活的黄花倒水莲栽培苗只需110天，大大加快黄花倒水莲 的繁殖速度。该发明中黄花倒水莲不定芽的诱导率为95.1，同时不定芽每月的增殖系数为 6.12，生根率为95.67%，移栽成活率可达92.6%，因此，可以在短期内提供大量的黄花倒水莲 栽培苗，决解目前黄花倒水莲野生资源有限、导致资源严重短缺等问题，同时为其优质苗木 的规模化生产乃至资源培育与利用奠定基础。但是，该发明在稳定性及可重复性方面有一 定的局限性。因此，建立稳定性好，重复性高的黄花倒水莲离体快繁技术，有望实现黄花倒 水莲优良种质的快速繁殖，对解决其野生资源匮乏而在生产上供不应求的现状具有重要意 义。
【发明内容】
[0005] 为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了黄花倒水莲离体快繁育苗方法，其 目的在于用75%酒精消毒10s，0.1%升汞消毒15min获得了较好的消毒效果，污染率低至 3.15% ;适宜黄花倒水莲增殖的培养基为1^+6-8八2.〇11^/1+财八0.1〇11^/1，增殖系数为 5.50;在1/2MS+IBA 0.1 mg/L+NAA 0.3mg/L+0.3g/L活性炭的生根培养基中，其生根率可 达96%;黄花倒水莲试管苗炼苗的最佳基质为红壤:腐殖土:珍珠岩=1:1:1，成活率为94.5%， 成功建立了黄花倒水莲离体快繁技术体系。
[0006] 本发明所采用的技术方案是:黄花倒水莲离体快繁育苗方法，包括如下步骤： 步骤一，材料获取:当年生带有嫩茎的黄花倒水莲枝条； 步骤二，材料预处理:外植体在洗洁精水中漂洗3-5 min，然后用流水冲洗25-35 min， 在清洗过程中同时对过长或过大的枝条进行修剪，方便后续的消毒工作； 步骤三，外植体消毒:取步骤二中预处理的黄花水莲枝条，用75%酒精消毒10-30S，再用 〇. 1%的升汞消毒时间为10_20min; 步骤四，诱导腋芽:将步骤三中经消毒后的材料切成长约2cm带1-2个叶腋的茎段，竖直 插于培养基MS+6-BA 2.0 mg/L +NAA 0.05 mg/L中，附加30.0g/L蔗糖，5.0g//L琼脂，pH 5.7，外植体培养12-18d，叶腋处可诱导出腋芽，在30d后即可长至2-3cm高； 步骤五，增殖培养:截取上述步骤四中诱导出的腋芽接种于增殖培养基中，进行增殖培 养，20-25d培养一代； 步骤六，生根培养:选取步骤五中获得的健壮试管苗，切取顶端长2cm接入生根培养基 中进行生根培养，20d后试管苗可生根； 步骤七，炼苗移栽:将步骤六中生根良好，生长健壮的试管苗从组织培养室移至普通实 验室或温室大棚，瓶内炼苗5d，然后将瓶盖揭开1/3的开度，炼苗2d，最后将瓶盖完全揭开， 炼苗Id后，将组培苗从组培瓶中移栽至基质中，并用小拱棚覆盖;炼苗过程中，要保证基质 足够的水分，并采取遮光措施;25d后即可成活；以上步骤四、五和六接种工作均在超净工 作台中操作，试管苗的培养均在组织培养室内进行，其培养条件为:在温度25°C，光照强度 1200-1500LX，光照周期12h/d的条件下进行的。
[0007] 进一步地，步骤七炼苗移栽：以红壤、腐殖土及珍珠岩为原料，将生根良好，生长健 壮的试管苗从组织培养室移至普通实验室或温室大棚，瓶内炼苗5d，然后将瓶盖揭开1/3的 开度，炼苗2d;最后将瓶盖完全揭开，炼苗1 d后，将组培苗从组培瓶中移栽至基质中，并用小 拱棚覆盖。
[0008] 进一步地，步骤七中采用红壤土、珍珠岩与腐殖土配合制得练苗移植基质。
[0009] 进一步地，步骤七炼苗移栽中的炼苗基质为红壤:腐殖土 :珍珠岩=1 : 1: 1或腐殖 土:珍珠岩=1:1或全腐殖土中的一种。
[0010] 进一步地，步骤一中75%酒精消毒时间为1 Os，0.1%升汞为15min，外植体的消毒效 果较佳。
[0011] 进一步地，步骤五的增殖培养基为MS+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.05mg/L。
[0012] 进一步地，步骤六所述的生根培养基配方为1/2MS+IBA 0.1 mg/L+ NAA 0.3 mg/L +0.2 g/L活性炭。
[0013] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：以黄花倒水莲嫩茎为外植体，经不同方法 消毒后，接种于MS+6-BA 2.0 mg/L +NAA 0.05 mg/L的培养基中诱导腋芽发生，继而将腋芽 接种在附加不同种类及浓度外源激素的培养基进行培养，根据增殖和生根情况，筛选适宜 的黄花倒水莲增殖及生根培养基;然后将生根试管苗移栽于不同的基质中，依据成活率，确 定其最佳炼苗基质。用75%酒精消毒10s，0.1%升汞消毒15min获得了较好的消毒效果，污染 率低至3.15%;适宜黄花倒水莲增殖的培养基为MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.10mg/L，增殖系数 为5.50;在1/2MS+IBA 0.1 mg/L+NAA 0.3mg/L+0.3g/L活性炭的生根培养基中，其生根率 可达96%;黄花倒水莲试管苗炼苗的最佳基质为红壤：腐殖土 ：珍珠岩=1:1:1，成活率为 94.5%。本发明中，从外植体的诱导到获得成活的黄花倒水莲幼苗只需100-105d，且在生根 后一般管理即可，无需用两倍MS大量元素溶液进行浇灌。这样大大加快了黄花倒水莲的繁 殖速度，且该方法稳定性及重复性均高。因此，可以在短期内提供大量的黄花倒水莲栽培 苗，决解目前黄花倒水莲野生资源有限、导致资源严重短缺等问题，可以满足其工厂化生 产。
【附图说明】
[0014] 图1为黄花倒水莲腋芽诱导阶段的一个实施例的照片； 图2为黄花倒水莲增殖培养阶段的一个实施例的照片； 图3为黄花倒水莲生根培养阶段的一个实施例的照片； 图4为黄花倒水莲移栽炼苗阶段的一个实施例的照片。
【具体实施方式】
[0015] 为了加深对本发明的理解，下面结合附图和实施例对本发明进一步说明，该实施 例仅用于解释本发明，并不对本发明的保护范围构成限定。
[0016]实施例以黄花倒水莲离体快繁体系建立所需步骤以及具体参数为对象，进行如 下试验 1材料与方法 1.1试验材料 试验材料为当年生带有嫩茎的枝条，取自福建三明市清流县。
[0017] 1.2试验方法 1.2.1材料预处理 外植体在洗洁精水中漂洗3~5 min，然后用流水冲洗30 min。在清洗过程中对过长或过 大的枝条进行修剪，方便后续的消毒工作。
[0018] 1.2.2外植体消毒及腋芽诱导 取上述预处理的材料，用75%酒精和0.1%的升汞进行消毒，设置不同的消毒时间以确定 适宜黄花倒水莲的消毒方案(表1)。材料经消毒后切成长约2cm带1-2个叶腋的茎段，竖直插 于培养基MS+6-BA 2.0 mg/L +NAA 0.05 mg/L中，附加30.0g//L蔗糖，5.0g/U京脂，pH 5.7 (下同）。试验共计12个处理，每个处理20瓶，每处理放置外植体4段。茎段叶腋处诱导出的不 定芽，则用作增殖培养的材料。如图1所示为黄花倒水莲腋芽诱导阶段的一个实施例的照 片。
[0019] 表1黄花倒水莲外植体消毒方案
1.2.3增殖培养 截取1.2.2中诱导出的腋芽，约1 cm长，分别以MS和WPM为基础培养基，采用相同激素种 类及浓度配比设计方案，进行黄花倒水莲增殖培养基的筛选。试验设计如表2。试验共计18 个处理及1个对照，每个处理20瓶，每处理放置材料4段。图2为黄花倒水莲增殖培养阶段的 一个实施例的照片。
[0020] 表2黄花倒水莲增殖培养基方案
1.2.4生根培养 试验设计IBA、NAA两种激素不同浓度与不同量的活性炭配比，添加到1/2MS培养基中 (表3)。选取经增殖培养的健壮试管苗，切取顶端长约2cm接入培养基中。试验共计9个处理 及1个对照，每个处理20瓶，每处理放置材料4段。如图3所示为黄花倒水莲生根培养阶段的 一个实施例的照片。
[0021] 表3黄花倒水莲生根培养基方案
1.2.5炼苗移栽 以红壤、腐殖土和珍珠岩为原料，配置6种不同的基质，其配比设计如表4。将生根良好， 生长健壮的试管苗从组织培养室移至普通实验室或温室大棚，瓶内炼苗5d，然后将瓶盖揭 开1/3的开度，炼苗2d，最后将瓶盖完全揭开，炼苗Id后，将组培苗从组培瓶中移栽至基质 中，并用小拱棚覆盖。炼苗过程中，要保证基质足够的水分，并采取一定的遮光措施。如图4 所示为黄花倒水莲移栽炼苗阶段的一个实施例的照片。
[QQ22] 表4黄花倒水莲移栽基质方案_
1.2.6培养条件
上述室内培养，均是在温度25°C，光照强度1200Lx，光照周期12h/d的条件下进行的。 [0023] 1.3数据分析 试验数据采用SPSS17.0软件进行统计分析。
[0024]结果与分析 2.1外植体消毒 黄花倒水莲经不同消毒处理后，结果如表5,在12种处理中，污染率最高的是处理1，污 染率为45.71%，污染率最低的是处理8,污染率为2.47%。消毒时间处理7、8、9和10之间无显 著差异，污染率均较低(分别为3.15%、2.47%、2.66%及3.52%)。说明，在这4种消毒条件下，均 可获得良好的消毒效果。但处理7中，外植体生长情况较处理8、9和10均要好。因此认为，处 理7(75%酒精10s，0.1%升汞15min)为黄花倒水莲外植体消毒的最理想方法。初代培养12-18d左右，叶腋处可诱导出不定芽，在30d后即可长至2_3cm高。
[0025] 表5不同消毒处理效果比较
注:表中同列数据不同小写字母表示差异显著(P<〇.05)，下同。
[0026] 2.2增殖培养 在不同的增殖培养基中，黄花倒水莲腋芽的增殖效果如表6,未添加激素的对照中增殖 系数最低，分别为2.08和1.89,说明外源激素的加入可以明显提高黄花倒水莲的增殖系数。 在添加了外源激素的处理中，以MS为基础培养基中处理4的增殖系数最高为5.50,且与其他 各处理均有显著差异。处理11的增殖系数最低为2.29;以WPM为基础培养基中处理6的增殖 系数最高为4.13,且与其他各处理均有显著差异。处理10的增殖系数最低为1.39。因此，黄 花倒水莲不定芽最佳增殖培养基为MS+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.05mg/L。
[0027] 表6不同培养基对黄花倒水莲不定芽增殖的影响
2.4生根培养 不同的生根培养条件下黄花倒水莲的生根效果不同（如表7)。生根率最低处理为未添 加任何激素的对照组CK，为21.0%，其余1-9处理实验中的生根率均在50.0%以上，说明外源 激素的加入有利于黄花倒水莲生根。生根率最高为处理4,达96.0%，且生根条数和根长也在 所有处理中最高。综合分析认为，处理4(1/2MS+IBA 0.1 mg/L+ NAA 0.3 mg/L+0.2 g/L活 性炭)为黄花倒水莲的最佳生根培养基。
[0028]表7不同培养基对黄花倒水莲生根的影响
2.5炼苗移栽 由表8可知，不同的移栽基质对黄花倒水莲的生根率有显著差异，成活率最低的是处理 1，成活率仅为66.7%，在处理6的基质中，黄花倒水莲试管苗的成活率最高(为95.2%)，且与 处理4和5之间差异不显著(分别为94.5%和94.9%)，所以，这3个处理的基质均适宜黄花倒水 莲的移栽炼苗。但从管理和基质成本来看，添加一定比例的红壤有助于提尚基质的保水性， 减少补水次数，还可以降低基质的成本。因此，实际生产栽培过程中建议使用处理4红壤:腐 殖土:珍珠岩=1:1:1基质配比，成活率达94.5%。
[0029]表8不同基质对黄花倒水莲炼苗的影响
3讨论 试验结果表明，MS培养基适合黄花倒水莲外植体腋芽诱导，罗万业等[8]，李翠兰等[9] 在建立黄花倒水莲离体快繁技术体系时，也选用了同样的培养基。而刘秀芳等[7]则以1/ 2MS为基础培养基，附加与本试验相同的激素种类和配比，对黄花倒水莲茎段进行诱导培 养，也取得了较理想的效果。MS是一种元素间平衡较好，缓冲能力强的基础培养基[10]，1/ 2MS只是将大量元素减半。在腋芽诱导初期，外植体内本身贮存着一定量的能量及营养，甚 至这些能量及营养足够或超出诱导腋芽之所需，因此，此类基础培养的选择对腋芽的诱导 影响并不大。另外，培养时的条件及取材的基因型不同也会有一定的影响。
[0030] 增殖培养时发现，随着6-BA浓度的增高，不论是以MS还是经WPM为基础培养基的培 养方案中，不定芽的增殖系数均呈上升趋势。但以1.5 mg/L时最为适宜，超过则增殖系数开 始下降，且出现玻璃化现象。这与刘秀芳等[7]的研究结果以及在对同属植物晋产远志进行 增殖试验时获得的结果相一致[11]。一般情下，TDZ的作用强度要大于6-BA。而试验结果表 明，在两种基础培养基中添加〇. 01、〇.03、0.05 mg/L的TDZ，其增殖效果显著不如6-BA的效 果。这可能与所添加的TDZ的浓度较低有关。
[0031] 在生根培养时，添加合理浓度范围的生长素有利用黄花倒水莲芽苗的生根。但是 不论任何一种激素配比的培养基，均会产生一定量的愈伤组织。而且这种情况会随着生长 素浓度的提高而加剧。试验过程中，往往在高生根率的同时伴随着较多愈伤组织的产生。花 黄倒水莲生根培养试验结果表明，在生根培养基中添加一定量的活性炭，能较好地抑制愈 伤组织的形成，在后期炼苗时，其根不易断开，有利于提高移栽炼苗时的成活率。这与李翠 兰等[9]的研究结果相一致。
[0032]已有报道认为，泥炭土:黄泥土:珍珠岩=2:1:1是较适合黄花倒水莲的炼苗基质， 移栽成活率可达92.6%[ 7 ]。本试验结果显示，红壤:腐殖土:珍珠岩=1:1:1、腐殖土:珍珠岩= 1:1、全腐殖土三种基质组合的成活率均高于94%。然而，在全红壤的基质中，移栽数天后，苗 木根部变黑并逐渐腐烂，最终大量死亡。推测是基质透气性太差，导致根部无氧呼吸产生酒 精，继而造成根部毒害。较多研究表明，试管苗移栽成活率与基质本身的保水、保肥、透气性 和自身稳定性密切相关。因此，要求炼苗基质要疏松透气，并具有一定的持水力[12-15]。
[0033]本发明的实施例公布的是较佳的实施例，但并不局限于此，本领域的普通技术人 员，极易根据上述实施例，领会本发明的精神，并做出不同的引申和变化，但只要不脱离本 发明的精神，都在本发明的保护范围内。
[0034] 参考文献
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【主权项】
1. 一种黄花倒水莲离体快繁育苗方法，其特征在于，包括如下步骤： 步骤一，材料获取:当年生带有嫩茎的黄花倒水莲枝条； 步骤二，材料预处理:外植体在洗洁精水中漂洗3-5 min，然后用流水冲洗25-35 min， 在清洗过程中同时对过长或过大的枝条进行修剪，方便后续的消毒工作； 步骤三，外植体消毒:取步骤二中预处理的黄花水莲枝条，用75%酒精消毒10-30S，再用 〇. 1%的升汞消毒时间为10_20min; 步骤四，诱导腋芽:将步骤三中经消毒后的材料切成长约2cm带1-2个叶腋的茎段，竖直 插于培养基MS+6-BA 2.0 mg/L +NAA 0.05 mg/L中，附加30.0g/L蔗糖，5.0g//L琼脂，pH 5.7，外植体培养12-18d，叶腋处可诱导出腋芽，在30d后即可长至2-3cm高； 步骤五，增殖培养:截取上述步骤四中诱导出的腋芽接种于增殖培养基中，进行增殖培 养，20-25d培养一代； 步骤六，生根培养:选取步骤五中获得的健壮试管苗，切取顶端长2cm接入生根培养基 中进行生根培养，20d后试管苗可生根； 步骤七，炼苗移栽:将步骤六中生根良好，生长健壮的试管苗从组织培养室移至普通实 验室或温室大棚，瓶内炼苗5d，然后将瓶盖揭开1/3的开度，炼苗2d，最后将瓶盖完全揭开， 炼苗Id后，将组培苗从组培瓶中移栽至基质中，并用小拱棚覆盖;炼苗过程中，要保证基质 足够的水分，并采取遮光措施;25d后即可成活； 以上步骤四、五和六接种工作均在超净工作台中操作，试管苗的培养均在组织培养室 内进行，其培养条件为:在温度25°C，光照强度1200-1500LX，光照周期12h/d的条件下进行 的。2. 根据权利要求1所述的黄花倒水莲离体快繁育苗方法，其特征在于，步骤七炼苗移 栽：以红壤或腐殖土为原料，将生根良好，生长健壮的试管苗从组织培养室移至普通实验室 或温室大棚，瓶内炼苗5d，然后将瓶盖揭开1/3的开度，炼苗2d;最后将瓶盖完全揭开，炼苗 Id后，将组培苗从组培瓶中移栽至基质中，并用小拱棚覆盖。3. 根据权利要求2所述的黄花倒水莲离体快繁育苗方法，其特征在于，步骤七中采用珍 珠岩与红壤土，或者珍珠岩与腐殖土配合制得练苗移植基质。4. 根据权利要求1或2或3所述的黄花倒水莲离体快繁育苗方法，其特征在于，步骤七炼 苗移栽中的炼苗基质为红壤:腐殖土:珍珠岩=1:1:1或腐殖土:珍珠岩=1:1或全腐殖土中的 一种。5. 根据权利要求1所述的黄花倒水莲离体快繁育苗方法，其特征在于，所述步骤一中 75%酒精消毒时间为1 Os，0.1%升汞为15min，外植体的消毒效果较佳。6. 根据权利要求1所述的黄花倒水莲离体快繁育苗方法，其特征在于，步骤五所述的增 殖培养基配方为MS+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.05mg/L。7. 根据权利要求1所述的黄花倒水莲离体快繁育苗方法，其特征在于，步骤六所述的生 根培养基配方为 1/2MS+IBA (hi mg/L+ NAA 0.3 mg/L+0.2 g/L活性炭。
【文档编号】A01H4/00GK105993955SQ201610377608
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月31日
【发明人】辛培尧, 辛亚龙, 唐军荣, 李斌, 费希同, 何承忠, 韩国伟
【申请人】西南林业大学