银鱼三倍体高效育成方法
【专利摘要】本发明公开了一种银鱼三倍体高效育成方法，包括如下步骤：他莫昔芬抑制剂配备、他莫昔芬注射液的配制、注射处理母本、冷休克+静水压处理、雌激素抑制剂溶液的配制、取受精卵放入雌激素抑制剂溶液中，获得银鱼雄性四倍体纯系、取雄性四倍体作为父本，取普通二倍体作为母本，采用回交的方式，获得100%三倍体。采用本发明的方法，可获得100%的银鱼三倍体纯系，提高了三倍体的育成率与出苗率，减少了育种与选种的麻烦，更主要是对自然水产品种种质和生态环境无污染。
【专利说明】
银鱼三倍体高效育成方法
技术领域
[0001]本发明涉及银鱼的多倍体繁育方法，具体涉及银鱼三倍体高效育成方法。
【背景技术】
[0002] 银鱼，体长略圆，细嫩透明，色泽如银，生活周期短，生殖力和定居能力强，其营养 价值高，是我国重要的经济鱼类之一。三倍体银鱼的不育特征，使其在生长速度、抗逆性、抗 病性以及肉质等方面表现出更为显著的优势。现有技术中，不育三倍体银鱼是通过四倍体 鱼与二倍体鱼倍间杂交获得，但要获得98%以上的三倍体鱼，那么就需要建立遗传稳定、纯 度极高的四倍体鱼系。
[0003] 在鱼类遗传育种中，通常利用冷/热休克，或通过杂交等方法抑制受精卵的第一次 有丝分裂或直接异源染色体加倍，制备出同源或异源四倍体鱼，其中冷休克一般是与静水 压处理一起，难以获得较高纯度的四倍体系，而热休克的方式虽然易于操作，同样，难以获 得纯度高的四倍体系;而杂交的方法虽然纯度高，但成功率低、周期长。此外，上述这些方法 制备的四倍体鱼，有些可育、有些又不可育，同时也可能存在基因混杂现象（异源四倍体）， 容易造成生物危险。
【发明内容】
[0004] 针对上述现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种高受精率和孵化率、且 方法稳定、种群纯度高达100%的银鱼三倍体高效育成方法。
[0005] 为达到上述目的，本发明的技术方案如下： 银鱼三倍体高效育成方法，包括如下步骤： (1) 他莫昔芬抑制剂配备:取纯度为95%以上的他莫昔芬粉剂，加入90%的乙醇溶液进行 溶解，制成母液，其中他莫昔芬含量约为50~80mg/ml，待用； (2) 他莫昔芬注射液的配制:取上述母液直接加入到已配制好的催产剂溶液中，其比例 为lml他莫昔芬母液加入到200~500ml的已配制好的催产剂溶液中，制成注射液待用，催产 剂溶液是将绒毛膜促性腺激素用〇. 9%生理盐水稀释配制，催产剂溶液中绒毛膜促性腺激素 的剂量为5-10 IU/g; (3) 注射处理母本:在母本人工产卵前，按常规人工催产方法对母本进行人工注射他莫 昔芬注射液，其中他莫昔芬注射液的用量约为50~200yg/kg，即每kg母本注射他莫昔芬注 射液 50_200yg; (4) 冷休克+静水压处理:在一次卵裂时，采用冷休克与静水压相结合的方法，把经过注 射处理的母本与不经过任何处理的父本杂交获得的受精卵放入温度为-1~l.〇°C的冷水 中，静水压压力为250~340Kg/cm 2,持续时间为3~5min; (5) 雌激素抑制剂溶液的配制:将氯米芬和睾酮一起溶于80%~90%的乙醇中，再加蒸馏 水配制成雌激素抑制剂溶液，其中雌激素抑制剂溶液中氯米芬的浓度为100~250mg/l，睾 酮的浓度为40~100mg/l; (6)取步骤(4)处理后的受精卵放入按步骤(5)所制备的雌激素抑制剂溶液中，受精卵 与雌激素抑制剂溶液的用量按重量计比为1:3,常温浸泡10~30s，然后取出放于孵化器中 正常孵化;从而获得银鱼雄性四倍体纯系； (7 )三倍体的获得:取步骤(6 )的雄性四倍体作为父本，取普通二倍体作为母本，采用回 交的方式，获得1 〇〇%三倍体。
[0006] 本发明的优点：1、本发明中在母本中注射他莫昔芬，起到抑制DNA复制和促雄性的 双重作用的同时，推延了受精卵第一次卵裂的时间（3-5min)和提高了同步程度(高达99%)， 为染色体加倍和提高其四倍体率提供了时间保障和奠定了坚实基础;2、在受精卵一次卵裂 采用冷休克与较低的静水压(低于常用的350kg/cm 2)，以及较短的处理时间（低于5min)，不 仅有效降低了因为冷休克时间过长、压力过高对受精卵的破坏程度，提高受精卵的成活率， 而且降低了操作难度与加压成本;3、雌激素抑制剂溶液浸泡，再一次强化与保证雄性转化 率;4、用纯系的雄性四倍体与原有的雌性二倍体回交，有效保证了三倍体的纯度。因而通过 此方法，可获得100%的银鱼三倍体纯系，提高了三倍体的育成率与出苗率，减少了育种与选 种的麻烦，更主要是对自然水产品种种质和生态环境无污染。
【具体实施方式】
[0007] 现结合具体实施例，对本发明作进一步描述。
[0008] 实施例一 银鱼三倍体高效育成方法，包括如下步骤： (1) 他莫昔芬抑制剂配备:取纯度为95%以上的他莫昔芬粉剂，加入90%的乙醇溶液进行 溶解，制成母液，其中他莫昔芬含量约为80mg/ml，待用； (2) 他莫昔芬注射液的配制:取上述母液直接加入到已配制好的催产剂溶液中，其比例 为lml他莫昔芬母液加入到200ml的已配制好的催产剂溶液中，制成注射液，注射液中他莫 昔芬的浓度约为〇.4mg/ml，待用； (3) 注射处理母本:在母本人工产卵前，按常规人工催产方法对母本进行人工注射他莫 昔芬注射液，其中他莫昔芬注射液的用量约为150yg/kg; (4) 冷休克+静水压处理:在一次卵裂时，采用冷休克与静水压相结合的方法，把经过注 射处理的母本与不经过任何处理的父本杂交获得的受精卵放入温度为〇°C的冷水中，静水 压压力为280Kg/cm 2,持续时间为3min; (5) 雌激素抑制剂溶液的配制:将氯米芬和睾酮一起溶于90%的乙醇中，再加蒸馏水配 制成雌激素抑制剂溶液，其中雌激素抑制剂溶液中氯米芬的浓度为200mg/l，睾酮的浓度为 80mg/l； (6) 取步骤(4)处理后的受精卵放入按步骤(5)所制备的雌激素抑制剂溶液中，常温浸 泡30s，然后取出放于孵化器中正常孵化;从而获得银鱼雄性四倍体纯系； (7 )三倍体的获得:取步骤(6 )的雄性四倍体作为父本，取普通二倍体作为母本，采用回 交的方式，获得1 〇〇%三倍体。
[0009] 实施例二 银鱼三倍体高效育成方法，包括如下步骤： (1)他莫昔芬抑制剂配备:取纯度为95%以上的他莫昔芬粉剂，加入90%的乙醇溶液进行 溶解，制成母液，其中他莫昔芬含量约为50mg/ml，待用； (2) 他莫昔芬注射液的配制:取上述母液直接加入到已配制好的催产剂溶液中，其比例 为lml他莫昔芬母液加入到500ml的已配制好的催产剂溶液中，制成注射液，注射液中他莫 昔芬的浓度为〇. lmg/ml，待用； (3) 注射处理母本:在母本人工产卵前，按常规人工催产方法对母本进行人工注射他莫 昔芬注射液，其中他莫昔芬注射液的用量约为200yg/kg; (4) 冷休克+静水压处理:在一次卵裂时，采用冷休克与静水压相结合的方法，把经过注 射处理的母本与不经过任何处理的父本杂交获得的受精卵放入温度为-1°C的冷水中，静水 压压力为310Kg/cm 2,持续时间为3min; (5) 雌激素抑制剂溶液的配制:将氯米芬和睾酮一起溶于90%的乙醇中，再加蒸馏水配 制成雌激素抑制剂溶液，其中雌激素抑制剂溶液中氯米芬的浓度为250mg/l，睾酮的浓度为 100mg/l； (6) 取步骤(4)处理后的受精卵放入按步骤(5)所制备的雌激素抑制剂溶液中，常温浸 泡l〇s，然后取出放于孵化器中正常孵化;从而获得银鱼雄性四倍体纯系； (7 )三倍体的获得:取步骤(6 )的雄性四倍体作为父本，取普通二倍体作为母本，采用回 交的方式，获得1 〇〇%三倍体。
[0010]上述两个实施例仅为本发明的优选方案之二，并不能限制本发明的保护范围，任 意与本发明等同或相似的技术手段视为本发明的保护范围。以下附上本发明部分处理方式 及结果统计。
[0011]附:银鱼三倍体育成结果统计表
注:上述结果是在注射液中他莫昔芬浓度为O.lmg/ml的条件下常温浸泡10S，静水压处 理3min所取得的结果。
【主权项】
1.银鱼三倍体高效育成方法，包括如下步骤： (1) 他莫昔芬抑制剂配备:取纯度为95%以上的他莫昔芬粉剂，加入90%的乙醇溶液进行 溶解，制成母液，其中他莫昔芬含量约为50~80mg/ml，待用； (2) 他莫昔芬注射液的配制:取上述母液直接加入到已配制好的催产剂溶液中，其比例 为lml他莫昔芬母液加入到200~500ml的已配制好的催产剂溶液中，制成注射液待用，催产 剂溶液是将绒毛膜促性腺激素用〇. 9%生理盐水稀释配制，催产剂溶液中绒毛膜促性腺激素 的剂量为5-10 IU/g; (3) 注射处理母本:在母本人工产卵前，按常规人工催产方法对母本进行人工注射他莫 昔芬注射液，其中他莫昔芬注射液的用量约为50~200yg/kg; (4) 冷休克+静水压处理:在一次卵裂时，采用冷休克与静水压相结合的方法，把经过注 射处理的母本与不经过任何处理的父本杂交获得的受精卵放入温度为-1~l.〇°C的冷水 中，静水压压力为250~340Kg/cm 2,持续时间为3~5min; (5) 雌激素抑制剂溶液的配制:将氯米芬和睾酮一起溶于80%~90%的乙醇中，再加蒸馏 水配制成雌激素抑制剂溶液，其中雌激素抑制剂溶液中氯米芬的浓度为100~250mg/l，睾 酮的浓度为40~100mg/l; (6) 取步骤(4)处理后的受精卵放入按步骤(5)所制备的雌激素抑制剂溶液中，受精卵 与雌激素抑制剂溶液的用量按重量计比为1:3,常温浸泡10~30s，然后取出放于孵化器中 正常孵化;从而获得银鱼雄性四倍体纯系； (7) 三倍体的获得:取步骤(6)的雄性四倍体作为父本，取普通二倍体作为母本，采用回 交的方式，获得1 〇〇%三倍体。
【文档编号】A01K67/027GK106035235SQ201610500180
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月30日
【发明人】杨品红, 罗玉双, 石彭灵
【申请人】湖南文理学院