一种新型低温碱性蛋白酶、制造方法、应用和产生该蛋白酶的微生物的制作方法

专利名称：：一种新型低温碱性蛋白酶、制造方法、应用和产生该蛋白酶的微生物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种新型低温碱性蛋白酶、制造方法、应用和产生该蛋白酶的微生物，特别是涉及一种源于一种新的黄杆菌属未知种菌株(保藏号CCTCCM200014)、在中温至低温度条件具有低活化能和高酶活性比的新型低温碱性蛋白酶，其制造方法及其在去污剂、发制品(人发)、海洋抗氧化活性多肽等领域中的应用和产生该低温碱性蛋白酶的菌株。碱性蛋白酶作为一种改进合成洗涤剂去垢性的必要成分已为世人共知。但在过去的10年中，世界洗涤领域发生了根本性的改变。全球洗衣正向着低温、节水型发展，传统的洗涤剂用酶(主要是碱性蛋白酶)在较低温度下所表现出的清洁能力已难以满足消费者的需求，所以需要在低温区域具有明显相对活性优势的酶。目前已知的洗涤剂用商品低温碱性蛋白酶包括ProperaseCT(GENENCOR国际公司，美国)、Savinase4．0T低温碱性蛋白酶(NOVO公司，丹麦)等品牌，氧化稳定性洗涤剂碱性蛋白酶为MaxapemCX(GENENCOR国际公司，美国)。其中Savinase4．0T低温碱性蛋白酶在pH10．1条件下，最适反应温度55℃、20℃时相对活性约为15％。ProperaseCT低温碱性蛋白酶在pH10条件下，最适反应温度50－55℃、20℃时相对活性约为42％。MaxapemCX碱性蛋白酶在最适条件下于20mMH2O2中可稳定60分。可见，在各自推荐的最适条件下，在低温区蛋白酶的相对活性较低，所以这些酶的低温活性区和对氧化剂的稳定性仍然没有令人完全满意。众所周知，以东方人人发为材料生产发制品，尤其假发制品，需首先专一性破坏其表面鳞质层再以氧化手段脱色、造型。然而人发鳞质层的基础成分是各种天然氨基酸组成的硬性角蛋白质，一般情况下，它既不溶于水、稀的酸和碱，也不为普通蛋白酶所分解。故多年来发制品制造业均采用浓酸法脱鳞生产工艺，但酸法水解存在诸多缺点，例如胱氨酸、色氨酸等被破坏后形成黑色不溶物沉积在头发表面并伴有恶臭产生而严重污染环境；并使头发鳞质层中的结晶区(肽链排列比较密集)被过度破坏而伤至皮质层，使色发成品抗拉强度降低，造成色发成品的档次较低，产品质量合格率＜50％。现有的对人发角蛋白质最有效的商品酶是角蛋白酶，但试验结果，角蛋白酶对人发表面鳞质层缺乏满意的作用专一性，易将其彻底水解成低聚肽和芳香族游离氨基酸，而无法实际应用。另外，为了进一步加强海洋生物资源可持续利用，近年来应用海洋资源非食用部分中生物活性物质生产医药保健品也是当务之急。海洋抗氧化活性肽系从海洋甲壳类动物提取的特定物质(胶原蛋白N端组织)，有确定的抗紫外线氧化、清除活性氧自由基的能力，对预防日光中紫外线对头发、皮肤损伤和促进放疗病人恢复有增强免疫的重要作用。但由于海洋生物资源的多样性，使得该领域研究极为复杂，长期以来都希望找到具有专一底物范围的新型蛋白酶，以通过酶解手段大量制备抗氧化活性肽。应用市售537酸性蛋白酶(水解条件50℃、pH3)、AS1398中性蛋白酶(水解条件50℃、pH7)、胰蛋白酶(水解条件37℃、pH8)、2709碱性蛋白酶(水解条件40℃、pH9．5)等商品酶在各自推荐的最适条件下试验，结果发现均对已选定作用底物缺乏专一性在酸性至弱碱性范围内，提取的活性物质易变性、沉淀或不为相应蛋白酶所水解；在碱性范围内，水解产物多为游离氨基酸而无特定生物活性。本发明的目的克服现有技术存在问题，提供一种能适应于中温至低温条件、氧化稳定型的低温碱性蛋白酶、所述蛋白酶的制造方法和在去污剂、发制品(人发)生产、海洋抗氧化活性多肽生产等领域的应用以及产生该低温碱性蛋白酶的微生物。产酶微生物本发明提供的能够产生新的低温碱性蛋白酶的新型微生物是由海产贝类样品中分离的黄杆菌(Flavobacterium)属未知种菌株YS9412－130，该菌株于2000年6月30日保藏于中国武汉中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)保藏号为M200014。本发明的黄杆菌属未知种菌株YS9412－130的形态学及细菌学特性按照本发明提供的黄杆菌属未知种菌株YS9412－130是一种与泥色黄杆菌(Flavobacterium)在细菌学上密切相关的菌株。然而所述菌株在一些特性方面明显地不同于其它的已知菌株，其被认为是一个新的菌株。形态学及细菌学特性如下<tablesid="table3"num="003"><table>项目特性大小形态杆状，0．6－0．7×2．3μm运动性+革蓝氏染色-含有结晶紫的洋菜培养基+37℃生长+适宜生长温度5－20℃适宜生长pH6－9耐盐性+鞭毛染色+菌落形成全缘、扁圆、表面光滑产生色素黄色至略呈橘黄色脲酶试验+吲哚产物+H2S试验-淀粉试验-糖产酸试验-由NO3到NO2+肠道培养基无色菌落有指示剂的蛋白胨培养基示pH上升甲基红试验</table></tables><tablesid="table4"num="004"><table>伏一普二氏(VP)试验-明胶液化试验-脂酶活性试验-半固体穿刺培养表面生长，示嗜氧从海洋环境分得+G+C摩尔％65</table></tables>参考Bergey′S的系统细菌学手册(William和Wilkins，Vol．2，1986)，将所述的具有上述细菌学特征的细菌的系统特征与其它的菌株比较如下本发明提供的黄杆菌属未知种菌株YS9412－130在由葡萄糖产酸和脲酶试验、吲哚产物试验方面没有表现出与泥色黄杆菌相同的特征。然而，本发明菌株YS9412－130由低温生长并在此温度条件下时产生色素最显著等等其它细菌学特征可以明显地看出菌株YS9412－130是一种嗜低温细菌，是与泥色黄杆菌密切相关的黄杆菌属未知种菌株，而且该菌株与其它的已知菌株不同。因此这种菌株被认为是一种新的菌株。此外，属于所述的菌株通过自发或者诱导突变而得到的且使产酶能力改进的突变体可以作为产生本发明蛋白酶的细菌。为了制备这些突变体，可以使用常规的方法，例如紫外辐射或者用诱变剂(如N－甲基－N′－硝基－N－亚硝基胍(NTG))对原始菌株诱导人工突变后，将培养物接种到含有酪蛋白的琼脂培养基中，从在菌落周围形成较大清晰环带的菌落中选择具有最好产酶能力的突变株。而且可以通过在合适的宿主细胞中表达该酶基因，得到产生本发明低温碱性蛋白酶的工程菌株。黄杆菌属未知种菌株YS9412－130的培养及低温碱性蛋白酶的生产方法发酵培养本发明的黄杆菌属未知种菌株YS9412－130的培养和低温碱性蛋白酶的生产是在需氧条件下，培养于能使上述菌株生长并产生所述低温碱性蛋白酶的培养基中发酵培养，使用的培养温度通常为5－37℃，优选为5－25℃，更优选为18－20℃。理想的初始培养pH为6－7，培养期限间微生物的适宜生长pH为6－9，优选为6．7－7．5，pH的调节可以通过培养基消毒后加入合适的诸如磷酸缓冲液之类缓冲液进行调节到所需pH值。培养时间通常获得最大的蛋白酶活性一般为20－60小时，优选为30－40小时。所述需氧的条件，可以例如使用发酵罐或摇瓶培养来实现，当采用容量发酵罐培养时，必须进行人工通气，通气速率类似于常规大容量发酵罐采用通气速率，例如1∶0．4－1∶2(V／V／分)。所述培养基包括碳源、氮源、无机盐等以及其它必要的营养物质。无论是合成培养基还是天然的培养基都可使用，只要含有上述成份的。本发明的培养基中适合的碳源，只要是可使本发明菌株正常生长的碳源，其它并无特殊限制，从菌株增殖考虑，合适的碳源为碳水化合物，诸如蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、果糖、乳糖、甘露糖、密糖、木糖、糖浆、甘油和可溶性淀粉之类的糖类，或者诸如谷粒、麦芽、大米和高梁之类的含糖类的物质，优选为甘露糖、淀粉、蔗糖、葡萄糖及糖浆，所述碳源物质可以单独使用或二种以上配合使用(其配合比例任选)，加入培养基中的碳源如糖类以葡萄糖的当量计算其浓度可以在较大范围内变化，通常为0．5－10％(W／V)，优选为5－8％(W／V)。所述培养基中氮源为有机氮化合物，常用的氮源为大豆粉，棉子粉、花生粉、酪蛋白、玉米浸液、酵母提取物，尿素、蛋白胨、白蛋白、豆饼粉、豆渣等，优选为大豆粉、花生粉、酪蛋白。这些氮源物质可单独使用或二种以上配合使用(其配合比例任选)。所述氮源在培养基中添加浓度随所选氮源种类以及培养基中除氮源以外其它培养基成份不同而各异，当使用氮源含量较高的氮源如大豆粉一般为1－5％(w／v)，优选为2－3％(w／v)。所述无机盐可以使用如钾、钠、钙、镁、铁、铜、锌等磷酸盐或磷酸氢盐、盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐，乙酸盐。优选为钾、钠、钙、镁的磷酸盐或磷酸氢盐及乙酸盐。这些无机盐可单独使用或二种以上配合使用(其配合比例任选)。此外，可根据需要，在培养基中还可适当添加消泡剂、植物油，表面活性剂、维生素类、血液或血液成份。粗酶的提取发酵液用离心机1000－4000，优选3000转／分钟离心分离或如板框过滤，取所得上清液加入30％－75％饱和度硫酸铵或硫酸钠沉淀酶蛋白；或每容积加入0．8－1．4容积的有机溶剂(诸如乙醇或丙酮等)作为沉淀剂，一般为95％(V／V)－96％(V／V)的工业用有机溶剂，例如工业用酒精或丙酮；或进行超滤截留2万～7万分子量范围的组份；也可用薄膜蒸发器在35－40℃真空(640毫米汞柱左右)浓缩3－4倍。然后真空冷冻干燥，也可喷雾干燥得粗酶粉，根据需要可进一步纯化。酶的纯化发酵液用离心机4000转／分离心分离，取上清液用30％－65％饱和度的硫酸铵分级沉淀，在10℃以下放置过夜。用离心机4000转／分离心40分钟，弃上清液，沉淀用预冷蒸馏水或适宜的缓冲液溶解得清液。将清液置4℃下用三(羟甲基)氨基甲烷－盐酸缓冲液(PH7．2)透析24小时，取透析液上阴离子层析柱，以缓冲液洗涤平衡1～2小时，然后用0－1MNaCl·三(羟甲基)氨基甲烷－盐酸缓冲液线性梯度洗脱，分部收集活性峰组份。合并活性峰组份，加65％饱和度的硫酸铵在4℃下放置过夜，离心弃上清液，用预冷蒸馏水溶解沉淀得清液，将此清液置4℃下用PH7．4磷酸缓冲液透析24小时，取清液上经缓冲液平衡的分子筛柱(如SephaCryls－200)，然后用缓冲液洗脱，分部收集活性峰组份，真空冷冻干燥得纯化酶。低温碱性蛋白酶活性测定方法(Folin－酚试剂法)。将1ml适当稀释的低温碱性蛋白酶溶液(约20u／ml)在20℃恒温水浴中预热3－5分钟，然后再将1ml预热的2％(W／V)酪素溶液(pH10、50mM的硼砂－氢氧化钠缓冲体系)加入到此溶液中，恒温反应10分钟后，加入2m10．4mol／L三氯乙酸溶液使反应终止。沉淀在40℃水浴中放置10分钟以上，然后用2号滤纸过滤。取1ml滤液，分别加入5ml0．4mol／L的碳酸钠、1ml用水稀释2倍的福林试剂(磷钨酸与磷钼酸的混合物)，40℃下显色20分钟以上，冷至室温，然后用分光光度计于波长680nm，10mm比色皿测定其吸光度。1ml液体酶在1min水解酪素产生1ug酪氨酸定义为1个酶活力单位，以u／ml表示。低温碱性蛋白酶本发明提供的新型低温碱性蛋白酶是通过上述在合适的包含碳源、氮源及无机盐的营养培养基中培养本发明的黄杆菌属未知种菌株YS9412－130或所述菌株其突变体、变体获得；所述酶也可以通过重组DNA技术获得。本发明提供的低温碱性蛋白酶具有以下的理化性质。(1)酶的基因以pUC19质粒做载体、末端半补齐技术，构建该酶的基因文库，并从中筛选出阳性克隆。取重组质粒，用核酸自动测序仪进行DNA序列的测定，基因序列为ATGACTGATCAGCGCAAAGGCAGCGATGCCGAACCCACCACGCACTTCGGTTTCAAAAATGTTCCGGAAAGCCAGAAAGCGGAAAAAGTCGCTGAGGTGTTCCATTCCGTAGCGGGCAAATATGACCTGATGAACGACGTTCTGTCGGGCGGCATGCACCGCCTGTGGAAGCGTTTCACCATCGAGCTGTCGGGCGTTCGCCCTGGCAACAAAGTGCTGGACATCGCAGGCGGCACGGGCGATCTGGCACGCAAGTTCTCGCATCTGGTCGGTCCAACCGGTCAAGTGGTGCTGGCCGACATCAACGCCTCGATGCTCAAGGTTGGCCGAGACCGCCTTTTGGACAAAGGCGTGGCGGGCAATATCGAATTTGTTCAGGCCGACGCTGAAAAGCTGCCGTTCCCGGACAACTACTTTGATTGCGTGACCATCGCTTTCGGCCTGCGCAATGTGACCCACAAAGAAGACGCCCTGCGTTCGATGCTGCGCGTGCTCAAGCCAGGGGGTCGCCTGCTGGTGCTGGAATTCTCCAAGCCGACCAATGCCCTGATGTCCAAGGTCTACGACGCCTATTCGTTCGCGTTCATGCCGATGGTTGGCAGCTCGTCCTCAACGACCCGGAAAGCTACCGCTACCTGGCCGAATCGATCCGCATGCACCCGAATCAGGAAACCCTGAAATCGATGATGGTCGAAGCCGGTTTTGACCGCGTGACGTACCACAACATGACCTCGGGCATTGTTGCCCTGCATCGCGGCATCAAGCCCTGA根据已测定的上述基因序列，用PC／GENE软件将本发明所获的低温碱性蛋白酶与不同来源克隆得到的碱性蛋白酶进行氨基酸一级结构同源性比较，本发明的低温碱性蛋白酶与丝氨酸蛋白酶有不同程度的同源性，大约为25－40％，而与其它已知的碱性蛋白酶无同源性。已知丝氨酸蛋白酶分为胰蛋白酶(trypsin)、枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)、羧肽酶Y(carboxypeptidaseY)三个家族，每个家族成员不仅在初级结构上(如活性中心丝氧酸残基周围的氨基酸序列高度保守)具有同源性，而且三维结构也十分相似。用[3H]DFP(二异丙基磷酰氟)鉴定本发明酶的活性中心氨基酸为丝氨酸，比较其与上述三种丝氨酸蛋白酶家族活性中心丝氨酸周围的氨基酸顺序，结果显示该酶丝氨酸周围的保守序列不同于已知的三个家族。因此，本发明所获的低温碱性蛋白酶属于一个新的丝氨酸蛋白酶家族，为一新型低温碱性蛋白酶。(2)酶的作用温度和底物特异性本发明低温碱性蛋白酶在40℃以下低温条件下具有低活化能和高活性，所以在低温下能有效地降解蛋白质类，诸如蛋白污渍(奶、血、草汁)或肽及酪蛋白、血红蛋白、白蛋白、肉蛋白质、鱼蛋白质、大豆蛋白质和人发鳞质层角蛋白等蛋白质。(3)分子量、等电点本发明酶基因编码由792个核苷酸组成，分子量为32986Da，等电点为7．26。通过SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳测得该酶的表观分子量34，000±2，000。通过等电聚焦聚丙烯酰胺凝胶电泳测得该酶的等电点为7．5。(4)最适反应温度、pH及稳定范围采用上述Folin－酚试剂法测定所述的低温碱性蛋白酶活性，通过预先调整的pH缓冲体系，测定了不同pH对酶活性的影响(结果见图1)。由图可见该酶的有效pH稳定范围大约在5－11(不同pH条件下，20℃保温24小时后于pH10测该酶的活性)；最适反应pH为9．5－10．5(20℃，反应时间10min)。通过上述相同的测酶活性方法，测定了不同温度对酶活性的影响(结果见图2)。由图可见该酶的有效温度稳定范围大约在40℃以下(不同温度条件下，pH10保温10min后于20℃测该酶的活性)；最适反应温度为35℃(pH10，反应时间10min)。(5)酶与常规试剂的配伍性①金属离子对低温碱性蛋白酶活性的影响采用Folin－酚试剂法测定所述的低温碱性蛋白酶活性，将下列影响因子按表1中所示浓度加入到此缓冲溶液中，研究了各种常见配伍金属离子对本发明的酶活性的影响，结果见表1。表1．常见金属离子对酶活性的影响*<tablesid="table5"num="005"><table>名称浓度mM相对酶活保留率％不含金属离子0100Cu2+559．7Hg2+54．2Pb2+554．8Ca2+5104Mg2+5106Mn2+598Ni2+596Co2+552Fe3+599Zn2+545．5K+5100Na+5100Ag+58．4</table></tables>*初始酶活2000u／ml，常温反应60min。②配伍化学试剂对酶活性的影响采用Folin－酚试剂法测定所述的低温碱性蛋白酶活性，将下列影响因子按表2中所示浓度加入到此缓冲溶液中，研究了常见各种化学试剂对本发明的酶活性的影响，结果见表2。表2．化学试剂对酶活性的影响*<tablesid="table6"num="006"><table>名称浓度相对酶活保留率(％)不含配伍试剂0100乙醇1％(V／V)95硼砂1％(W／V)100戊二醛1％(V／V)45尿素1％(W／V)95聚氧乙烯(20)失水山梨醇单油酸酯(吐温80)0．1％(W／V)91</table></tables><tablesid="table7"num="007"><table>聚氧乙烯(20)失水山梨醇单棕榈酸酯(吐温40)0．1％(W／V)93乙二醇苯醚0．1％(W／V)91KH2PO41％(W／V)100Na2HPO41％(W／V)100Na2SO30．1％(W／V)90NaBO31％(W／V)100三羟甲基氨基甲烷(Tris)1mM109十二烷基硫酸钠(SDS)0．1mM77直链烷基苯磺酸钠(LAS)500ppm75</table></tables>*初始酶活2000u／ml，常温反应60min。③抑制物质对酶活性的影响采用Folin－酚试剂法测定所述的低温碱性蛋白酶活性，将下列影响因子按表3中所示浓度加入到此缓冲溶液中，研究了各种常见抑制物对本发明酶活性的影响(见表3)。结果甲苯磺酰氟(PMSF)强烈抑制该酶活性，说明本发明的蛋白酶是丝氨酸蛋白酶。但同时该酶也能被乙二胺四乙酸(EDTA)抑制，因此可以认为本发明蛋白酶属一种新的特殊丝氨酸蛋白酶。而一般丝氨酸蛋白酶可不被EDTA所抑制。表3．常见抑制物对酶活性的影响*<tablesid="table8"num="008"><table>名称浓度mM相对酶活保留率％不含抑制物0100大豆蛋白抑制剂193对汞苯甲酸PCMV1100白蛋白酶抑制剂1100胰蛋白酶抑制剂196PMSF10．6EDTA13．6</table></tables>*初始酶活2000u／ml，常温反应60min。④稳定剂(增稠剂)对酶活性的影响采用Folin－酚试剂法测定所述的蛋白酶活性，将下列影响因子按表4中所示浓度加入到此缓冲溶液中，研究了常见各种增稠剂对本发明的酶的影响，结果见表4。表4．常见增稠剂对酶活性的影响*<tablesid="table9"num="009"><table>名称浓度％(W／V)相对酶活保留率％不含增稠剂0100丙三醇198．6乙二醇195聚乙二醇192．2聚乙烯醇197甘露醇173．3海藻酸钠191．5糊精1100．3阿拉伯胶199．1烷基酚聚氧乙烯醚(乳化剂OP)170．8明胶199．6琼脂196．3橄榄油197．8胰蛋白胨190．1</table></tables>*初始酶活2000u／ml，常温反应60min。(6)酶稳定性本发明的低温碱性蛋白酶能够满足至少下列条件之一①按Folin－酚试剂法测定所述的蛋白酶活性，25℃下在含过氧化氢(H2O2)缓冲溶液(50mM硼砂盐缓冲液、pH10，H2O220mM、Ca2+5mM)中放置60min后剩余酶活性不低于95％。②按Folin－酚试剂法测定所述的蛋白酶活性，25℃下在含1％(W／V)过硼酸钠(NaBO3)缓冲溶液(50mM硼砂盐缓冲溶夜pH10，Ca2+5mM)中放置60min后剩余酶活性不低于90％。③按Folin－酚试剂法测定所述的蛋白酶活性，25℃下在含直链烷基苯磺酸钠(LAS)缓冲溶液(50mM硼砂盐缓冲液、pH10，LAS500ppm、Ca2+5mM)中放置60min后剩余酶活不低于65％。④按Folin－酚试剂法测定所述的蛋白酶活性，25℃下在含过硫酸钠(Na2SO3)缓冲溶液(50mM硼砂盐缓冲液、pH10，Na2SO38mM、Ca2+5mM)中放置60min后剩余酶活不低于90％。⑤按Folin－酚试剂法测定所述的蛋白酶活性，10℃下在含5％(W／V)NaCl缓冲溶液(50mM硼砂盐缓冲液、pH10、Ca2+5mM)中放置12小时后剩余酶活不低于70％。⑥按Folin－酚试剂法测定所述的蛋白酶活性，25℃下在含2％(V／V)乙醇缓冲溶液(50mM硼砂盐缓冲液、pH10、Ca2+5mM)中放置12小时后剩余酶活不低于70％。特点与效果(1)本发明的产酶菌株及其突变体是很容易处理的常温生长型新菌株，能有效地生产出本发明的低温碱性蛋白酶。本发明的蛋白酶与其它化学试剂、酶类、氧化剂、抑制剂配伍是稳定的且有效反应温度较低。因此，用本发明蛋白酶处理蛋白质或者多肽(例如人发、鱼肉、水溶性糖蛋白等)，生产其它水溶性更好的多肽或者游离氨基酸较为经济。(2)本发明的低温碱性蛋白酶在与常用的阴离子表面活性剂如直链烷基苯磺酸钠(LAS)和／或烷基硫酸盐(AS)等配伍时，比常规碱性蛋白酶更稳定，甚至在常规酶易失活或活性极低的苛刻条件下，本发明的蛋白酶仍可应用。例如，不仅可以在含有释氧漂白剂的环境中使用，可以在水硬度指标超过250ppm甚至天然海水的条件下使用，而且在小于10℃的环境下也可以正常使用。(3)本发明的低温碱性蛋白酶为一种耐碱性对低温区适应性好、氧化稳定型洗涤剂蛋白酶。与目前已有的ProperaseCT(GENENCOR国际公司，美国)及Savinase4．0T(NOVO公司，丹麦)等商品低温碱性蛋白酶相比，对低温区有突出的适应性和抗氧化稳定性(见图3、图4)，图3是不同低温酶对温度的适应性比较图例，图4是不同碱性蛋白酶在氧化剂中的稳定性比较图例。用于洗涤剂组合物中能有效地降解标准“污布”上的蛋白质(见图6)，图6表示不同酶在去污剂中稳定性，可以增加其去垢性。低温区洗涤效果明显优于市售蛋白酶，本发明低温碱性蛋白酶在洗涤剂或去污剂中使用量一般为0．0001－1．0％(wt)即可。(4)本发明的低温碱性蛋白酶具有酶解人发鳞质层专一性，水解进程易控制在鳞质层的非结晶区，能极大程度的保护人发皮质层。与传统的“酸法脱鳞”技术相比，“酶法脱鳞”工艺极大的减少了环境污染，其排放污水中总悬浮物含量(mg／L)减少88．2％、化学耗氧量(COD，mg／L)减少90％。色发成品合格率大于95％。(5)本发明的低温碱性蛋白酶能特异性水解海洋动物蛋白以制备海洋抗氧化活性多肽(具有抗氧化防晒和增强免疫功效)具有专一性。与市售常规蛋白酶相比，该酶仅对甲壳类动物肝胰腺组织有专一性，并在＜10℃条件下(保证酶解底物不致于因温度关系而失去生物活性)表现出足够的酶解活性。生产的活性肽为含精氨酸、脯氨酸等几种氨基酸的短肽，分子量范围主要在800Dal、pH4－9介质中有良好的溶解性。在相同浓度条件下，活性肽对O－2。的清除能力与超氧化物歧化酶(SOD)相似。能显著减轻地塞米松对免疫细胞的抑制作用，同时可以促进免疫细胞的活性。以浓度3％的条件测定其HPF(防晒系数)值约为35。本发明提供的新的黄杆菌属未知种菌株YS9412－130及由它产生的低温碱性蛋白酶具有很高的经济价值。可广泛应用于以下方面(并不限于下列方面)日用化工业化学合成洗衣粉、液体洗涤剂、化妆品、牙膏、洗浴液和脱毛剂等。食品加工业肉类加工、制备海洋抗氧化活性肽等。轻工产品加工业纤维加工、羊毛加工、皮革脱毛和人发(假发制品)前处理等。此外，本发明的蛋白酶还可以用于饲料加工、光学镜头的清洗及临检用生化试剂等。本发明用下列实施例进一步说明本发明，但本发明并不限于下列实施例。实施例1产酶菌株的培养及低温碱性蛋白酶的生产20℃下将本发明黄杆菌属未知种菌株YS9412－130在500ml含有0．6％(V／V)甘露糖、2．4％大豆粉、0．02％NaH2PO4、0．2％K2HPO4、0．06％Ca(AC)2的培养基中震荡培养55小时(用1M氢氧化钠将培养基的pH调节到6－7)，然后可在培养基中产生并分泌所述的低温碱性蛋白酶。4℃下以1000G离心此培养物，获得含有本发明酶的上清液。上清液中的酶的活性大约为5000u／ml(用上述Folin－酚试剂法测定)。实施例2低温碱性蛋白酶的纯化将在实施例1．中获得的培养物的上清液再用30％－65％饱和度的(NH4)2SO4分级沉淀，离心收取沉淀。将沉淀溶解在20mM三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)－盐酸(HCl)缓冲液(pH6．5，含2mMCaCl2)中，并对此缓冲液透析24小时。在所述pH条件下，将透析液过二乙氨乙基一琼脂糖(DEAE－SepharoseFF)阴离子交换层析柱，用0－0．5MNaCl·Tris－HCl缓冲液(20mM，pH6．5)梯度洗脱，收集活性组分再经SephacrylS－200凝胶过滤洗脱、收集所述的低温碱性蛋白酶。然后进行SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定，经考马斯亮兰染色为单一条带，激光灰度扫描结果，样品纯度大于95％。实施例3在氧化剂中的稳定性比较按照下列条件和方法研究了本发明酶对氧化剂的稳定性。将H2O2(20mM)溶解于浓度50mM、pH10．0并含有1000ppmCa2+的硼砂－氢氧化钠缓冲溶液中，将本发明酶和其它市售碱性蛋白酶(2709、CW302)分别加入到此缓冲液，调整各初始酶活性大约为20u／ml于25℃恒温不同时间。在20℃下定期检测剩余酶活性(以开始时活性保留率为100％)，结果见图4。与市售常规酶相比，本发明酶在氧化剂中具有良好的稳定性。实施例4在去污剂溶液中的稳定性与比较按照下列条件和方法研究了本发明酶在市售去污剂(国标普粉，徐州合成洗涤剂厂生产)中的稳定性。将去污剂(1000ppm)溶解于浓度50mM、pH10．0并含有1000ppmCa2+的硼砂－氢氧化钠缓冲溶液中，将此酶和其它市售碱性蛋白酶(2709、CW302)分别加入到此缓冲液，调整各初始酶活性大约为20u／ml于25℃恒温不同时间。在20℃下定期检测剩余酶活性(以开始时活性保留率为100％)，结果见图5，图5是各种蛋白酶在去污剂中稳定性比较。与市售常规洗涤用酶相比，本发明酶在市售去污剂中具有显著的稳定性。实施例5在合成洗衣粉中的去污性能与比较用实施例1相同的方式获得的培养物的上清液，经超滤膜浓缩、冷冻干燥制备出此酶的粗制品。将得到的粗制品酶加入到基础洗涤剂(“白猫”洗衣粉)中，以相同的酶含量(50nM)、不同的洗涤温度进行去污性能试验。试验采用“标准污布”在一个模拟的洗涤系统中进行，其中织物／洗涤液大约为5g／L，每种酶在规定条件下独立试验两次，结果取平均值。通过测定污布洗涤后的白度变量ΔR(ΔR=加酶洗涤污布白度值－基础洗涤剂污布白度值)，比较去污效果；以市售Properes(洗涤用低温碱性蛋白酶，美国GENENCOR公司生产)和CAP(国产洗涤用碱性蛋白酶，浙江德清生化总公司生产)作为检测去污性对照(见图6)，图6不同温度下各种蛋白酶的洗涤效能。试验结果表明与市售常规洗涤用酶相比，本发明酶的加入增加了市售洗衣粉的去污有效性能，且低温区效果明显好于对照洗涤用蛋白酶。其它试验条件涡轮式去污机，搅拌速度100转／min。瑞士产“EMPA－117人工污布”、不欲浸泡洗涤，洗涤时间20min、洗涤后水冲洗时间20min；基础洗涤剂添加量2．0g／L、洗涤液pH10．0、洗涤温度20℃、水硬度150ppmCa2+。施例6用于假发制品(人发)酶法“脱鳞”效果试验用实施例1相同的方式获得的培养物的上清液，经超滤膜浓缩后加入丙三醇2．5％(W／V)、Ca(Ac)21．0％(W／V)、糊精0．5％(W／V)，制备液体浓缩酶。将此液体浓缩酶按5％(V／V)浓度溶解于50mM、pH9并含有1000ppmCa2+的硼砂－氢氧化钠缓冲溶液中，25℃条件下进行人发“脱鳞”试验。试验中头发／酶解液大约为80－100g／L，酶解时间7－9小时。通过测定水解产物中主要组成氨基酸量(结晶区主要以胱氨酸、丙氨酸、甘氨酸的残基为代表；非结晶区主要以脯氨酸残基为代表)，比较酶法“脱鳞”效果(控制水解反应集中在鳞质层的非结晶区)；以传统酸法技术(硫酸+次氯酸钠法)在推荐的最适条件作为对照(图7)，图7酸法与酶法脱鳞效果试验与比较。试验结果表明与传统采用的酸法“脱鳞”相比，本发明的酶具有“脱鳞”专一性，且应用酶法“脱鳞”不仅可提高产品收率而且消除了生产过程对环境的污染。实施例7酶法制备“海洋抗氧化活性多肽”试验海洋抗氧化活性肽系从海洋甲壳类动物提取的特定物质经蛋白酶水解后分离的活性产物，有确定的抗紫外线氧化损伤、清除活性氧自由基和免疫增强剂的作用。用实施例1相同的方式获得的培养物的上清液，经超滤膜浓缩、冷冻干燥制备出此酶的粗制品。将得到的粗制品酶以含量5％(W／W相对于作用底物)的比例加入到含特定提取物质的硼砂－氢氧化钠缓冲溶液中(pH8．5、浓度50mM并含有1000ppmCa2+)，25℃条件下进行“海洋抗氧化活性多肽”制备试验。试验中底物浓度约2－5％(W／V)，酶解时间10－12小时。在不同的水解时间，通过测定水解产物对O－2。的清除能力或抗紫外线(UV)的HPF值，比较酶法制备效率；以市售537酸性蛋白酶(水解条件50℃、pH3)、AS1398中性蛋白酶(水解条件50℃、pH7)、胰蛋白酶(水解条件37℃、pH8)在各自推荐的最适条件作为对照(图8)，图8为多肽抗氧化效果与比较图。试验结果表明与市售酶相比，本发明的酶具有制备“海洋抗氧化活性多肽”的专一性。权利要求1．一种黄杆菌(Flavobacterium)属未知种菌株YS9412－130，该菌株保藏在中国武汉典型培养物保藏中心，保藏号为M200014。2．一种低温碱性蛋白酶，其特征在于由黄杆菌属未知种菌株YS9412－130产生的低温碱性蛋白酶。3．根据权利要求2的低温碱性蛋白酶，其特征在于酶的基因序列为ATGACTGATCAGCGCAAAGGCAGCGATGCCGAACCCACCACGCACTTCGGTTTCAAAAATGTTCCGGAAAGCCAGAAAGCGGAAAAAGTCGCTGAGGTGTTCCATTCCGTAGCGGGCAAATATGACCTGATGAACGACGTTCTGTCGGGCGGCATGCACCGCCTGTGGAAGCGTTTCACCATCGAGCTGTCGGGCGTTCGCCCTGGCAACAAAGTGCTGGACATCGCAGGCGGCACGGGCGATCTGGCACGCAAGTTCTCGCATCTGGTCGGTCCAACCGGTCAAGTGGTGCTGGCCGACATCAACGCCTCGATGCTCAAGGTTGGCCGAGACCGCCTTTTGGACAAAGGCGTGGCGGGCAATATCGAATTTGTTCAGGCCGACGCTGAAAAGCTGCCGTTCCCGGACAACTACTTTGATTGCGTGACCATCGCTTTCGGCCTGCGCAATGTGACCCACAAAGAAGACGCCCTGCGTTCGATGCTGCGCGTGCTCAAGCCAGGGGGTCGCCTGCTGGTGCTGGAATTCTCCAAGCCGACCAATGCCCTGATGTCCAAGGTCTACGACGCCTATTCGTTCGCGTTCATGCCGATGGTTGGCAGCTCGTCCTCAACGACCCGGAAAGCTACCGCTACCTGGCCGAATCGATCCGCATGCACCCGAATCAGGAAACCCTGAAATCGATGATGGTCGAAGCCGGTTTTGACCGCGTGACGTACCACAACATGACCTCGGGCATTGTTGCCCTGCATCGCGGCATCAAGCCCTGA酶的作用温度和底物特异性所述酶在40℃以下低温条件下具有低活化能和高活性，能在低温下有效地降解蛋白质类物质；分子量理论计算所述酶基因编码由792个核苷酸组成，分子量为32986Da；SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳测得酶的表观分子量34，000±2，000；等电点理论计算等电点为7．26，等电聚焦聚丙烯酰胺凝胶电泳测得该酶的等电点为7．5。最适反应温度35℃；有效稳定温度40℃以下；最适pH9．5－10．5；pH稳定范围5－11；与常规试剂配伍初始酶活2000u／ml，常温反应60min。<tablesid="table1"num="001"><table>名称浓度相对酶活保留率％无任何试剂配伍0100Cu2+5mM59．7Hg2+5mM4．2Pb2+5mM54．8Ca2+5mM104Mg2+5mM106Mn2+5mM98Ni2+5mM96Co2+5mM52Fe2+5mM99Zn2+5mM45．5K+5mM100Na+5mM100Ag+5mM8．4乙醇1％(v／v)95硼砂1％(w／v)100戊二醛1％(w／V)45尿素1％95聚氧乙烯(20)失水山梨醇单油酸酯(吐温80)0．1％(w／v)91聚氧乙烯(20)失水山梨醇单棕榈酸酯(吐温40)0．1％(w／v)93乙二醇苯醚0．1％(w／v)91KH2PO41％(w／v)100NaHPO41％(w／v)100Na2SO30．1％(w／v)90NaBO31％(w／v)100三羟甲基氨基甲烷(Tris)1mM109十二烷基硫酸钠(SDS)0．1mM77直链烷基苯磺酸钠(LAS)500ppm75大豆蛋白抑制剂1mM93对汞苯甲酸PCMV1mM100</table></tables><tablesid="table2"num="002"><table>白蛋白酶抑制剂1mM100胰蛋白酶抑制剂1mM96PMSF1mM0．6EDTA1mM3．6丙三醇1(W／V)98．6乙二醇1(W／V)95聚乙二醇1(W／V)92．2聚乙烯醇1(W／V)97甘露醇1(W／V)73．3海藻酸钠1(W／V)91．5糊精1(W／V)100．3阿拉伯胶1(W／V)99．1烷基酚聚氧乙烯醚(乳化剂OP)1(W／V)70．8明胶1(W／V)99．6琼脂1(W／V)96．3橄榄油1(W／V)97．8胰蛋白胨1(W／V)90．1</table></tables>4．一种由黄杆菌属未知种菌株YS－9412－130产生的低温碱性蛋白酶的制造方法，该方法包括(1)发酵培养在需氧条件下，将本发明的黄杆菌属未知种菌株YS－9412－130培养于能使所述菌株生长并产生所述低温碱性蛋白酶的培养基发酵培养，培养温度5－37℃，pH为6－9，培养时间20－60小时；(2)酶的提取发酵液以1000－4000G离心或过滤得上清液，加入30％－75％饱和硫酸铵或硫酸钠，或乙醇或丙酮之类有机溶剂进行沉淀，或超滤截留2万－7万分子量范围的组分；或用薄膜蒸发器在35－40℃，640毫米汞柱左右真空下浓缩3－4倍；然后真空冷冻干燥或喷雾干燥得粗酶粉；(3)酶的纯化将上述沉淀用预冷蒸馏水溶解得清液，将清液置缓冲液中透析24小时，透析液上阴离子层析柱层析，用0－1MNaCl缓冲液线形梯度洗脱，收集活性组分，加65％饱和度的硫酸铵在4℃下放置过夜，离心弃上清液再用预冷蒸馏水溶解沉淀得清液，取清液上经缓冲液平衡的分子筛柱，用缓冲液洗脱，收集活性峰组分，再进行真空冷冻干燥得纯化低温碱性蛋白酶。5.根据权利要求4的制造方法，其中所述发酵培养温度为18－20℃，pH为6．7－7．5，时间30－40小时。6.根据权利要求4的制造方法，其中所述培养基中的所述碳源为甘露醇、淀粉、蔗糖、葡萄糖及糖浆；所述氮源为大豆粉、花生粉、酪蛋白；所述无机盐为K、Na、Ca、镁的磷酸盐或磷酸氢盐或乙酸盐。7.一种根据权利要求2－3的低温碱性蛋白酶用于制备海洋抗氧化活性肽。8.一种根据权利要求2－3的低温碱性蛋白酶用于假发制品、酶法脱鳞的前处理。9.一种根据权利要求2－3的低温碱性蛋白酶用作洗涤组合物、其用量为0．0001－1．0％。10.一种根据权利要求2－3的低温碱性蛋白酶用于去污剂组合物质，使用量为0．0001－1．0％。11.一种根据权利要求2－3的低温碱性蛋白酶用于化妆品、脱毛剂、去皮革脱毛、纤维和羊毛加工、饲料加工、生化试剂。全文摘要本发明涉及一种新的黄杆菌属末知种菌株YS9412—130,保藏在中国武汉CCTCC,保藏号为M200014。由该菌株或其突变体产生的新型低温碱性蛋白酶,该蛋白酶在低温条件下具有低活化能和高活性比,能有效降解蛋白类;酶基因编码由792个核苷酸组成,与丝氨酸蛋白酶有不同程度的同源性,但不同于已有丝氨酸蛋白酶家族,为一种新生型丝氨酸蛋白酶家族,它广泛应用于洗涤领域,制备抗氧化活性肽、发制品、饲料加工品等。文档编号C12N15/57GK1280186SQ0012340公开日2001年1月17日申请日期2000年8月15日优先权日2000年8月15日发明者孙谧,王跃军,张云波申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所