专利名称：可降低钙离子灵敏度的果胶的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是可以增强蛋白质的稳定性的果胶，但该果胶并不带来不合乎需要的粘度的增加。更具体的说，本发明涉及的是用酶或化学手段处理果胶、以生产可以增强蛋白质的稳定性而具有相对较低钙离子灵敏度的果胶。
从化学上讲，果胶是聚半乳糖醛酸的甲基化的酯，它主要包括D-半乳糖醛酸和半乳糖醛酸甲基酯的单元，并形成了线性的多糖链，其中D-半乳糖醛酸单元与β-1，4-配糖键(β-1，4-glycosidic linkage)相连。通常也存在一些中性的糖例如鼠李糖和阿戊糖(arabinose)。聚半乳糖醛酸部分地被甲基酯化，而游离的酸性团(acid group)则部分地或全部地被钠、钾或铵离子中和。被酯化的半乳糖醛酸的酸性团与总的半乳糖醛酸酸性团的比率称为酯化度(DE)，它影响着果胶的性质，特别是其溶解度和凝胶体的形成特性。
果胶通常是根据其酯化度来进行分类，这里可分成两个主要的类别高(甲基)酯(HM)果胶和低(甲基)酯(LM)果胶(为了便于讨论，低酯和低甲基酯被认为是可以相互替换的术语，高酯和高甲基酯也一样)。LM果胶中，以甲基酯形式出现的羧酸根小于50％；而HM果胶中，以甲基酯形式出现的羧酸根多于50％。这种命名是FCC出于管理目的给予的强制定义，等于和大于50％酯化度的果胶被称为HM果胶，而低于50％酯化度的果胶被称为LM果胶。
HM果胶的胶化在低PH和高溶解性固体的存在下特别容易实现，而LM果胶胶化的特点是在二价阳离子溶液中较易实现，例如钙和/或镁离子。虽然凝胶化是果胶的一个重要特性，但它也常常被用于提高食品和饮料制品的稳定性。果胶在稳定含有蛋白质的饮料例如奶蛋白方面有着特殊的效用，尤其是在低PH值时。一种这样的饮料就是酸性乳类饮品(acidified milk drinks)，它是通过发酵或直接酸化而生产的。若不受理论的束缚，则似乎可以认为果胶是通过与蛋白质如酪蛋白的表面离子电荷相互作用而起到稳定蛋白质的作用。如果缺乏稳定性，饮料中的蛋白粒子容易相互作用而凝聚，导致出现混浊和/或沉淀物。果胶是通过沿着其骨架带负电核的羧酸部位，与蛋白质表面离子之间发生相互作用，而起到蛋白质的稳定作用。由于酪蛋白是两性的，稳定作用也可以由沿着果胶主脉带负电核的羧酸部位与酪蛋白颗粒带负电部分之间的钙桥(calcium bridging)来实现。但是，在低pH条件下，如pH值低于4.4，酪蛋白中主要是正电核占主导地位，因此钙桥变得很少，果胶的稳定作用主要或完全由其与酪蛋白之间的静电相互作用来实现。
食品和饮料的生产厂商可能会遇到因其产品初始原料不同而带来的巨大变化。在含有果汁和/或牛奶的酸奶(yogurt)和饮料等产品中，这些变化主要包括pH值、蛋白质浓度、钙离子浓度的明显变化，而这些变化可能来自处理工艺的不同或起始原料的不同或者二者。如果采用能够稳定典型的或标准组成产品的果胶来稳定这类产品时，那么当特定产品组合物的组成超过所使用量的果胶的稳定能力，就会导致产品质量变差，或者甚至根本不能使用。这一风险可以通过加入过量的果胶来加以弥补，也就是说，加入超过稳定典型或标准产品所需理论量的果胶。过量的程度随生产厂商和应用情况而变化，差别可能很大，例如过量50％、100％或者更多。但是，依赖于某一特定产品或者一批产品的pH值、固体含量以及钙离子含量等因素，“额外”的果胶可能会造成粘度显著增加，有时称作过量粘度(overdosing viscosity)。例如，包含乳固体(milk solid)或者基于乳固体而生产的产品如酸性乳类饮品，也可含有相当高浓度的钙离子。因此，食品生产商和加工商将左右为难，因为能提供良好稳定能力的果胶，也会产生明显的过量粘度。
已经尝试或建议了许多方法来解决这一问题。Akahoshi等在美国专利5,690,975讨论了一种生产富含钙的、发酵牛奶或发酵乳品饮料的方法。该方法是将HM果胶和“钙离子分别与糖浆”共同加入到酸性发酵乳品饮料中，并混匀最终的混合物；或者先混匀酸性发酵乳品饮料，再加入糖浆和HM果胶，混合，加入钙离子，再混合搅拌。在上述任一方法中，可以使用一种凝聚(block-wise)型果胶作为HM果胶。然而，从食品和饮料生产商的角度考虑，更希望减少加工工序的变化。因此需要获得一种能够应用于食品和饮料中的、固含量具有相对较高溶解度的、PH值较低的果胶，而且在提供稳定能力时没有不需要的粘度增加，即使在过量使用的条件下。
所述果胶的ΔCS可以不超过约30厘泊，或者不超过约20厘泊，或者不超过约10厘泊，或者不超过约5厘泊，最优选约为0厘泊。优选的ΔCS范围是介于约0到20厘泊之间，更优选的是介于0到10厘泊之间。
所述果胶的凝结度可以至少为20％，优选的凝结度是不超过30％，更优选的凝结度是在15％-25％之间。
所述果胶的酯化度至少约为60％、至少约为70％或者至少约为80％；酯化度的范围可以为55％到80％，优选的范围是介于60％和72％之间。
本发明中，果胶的分子量至少约为40000，优选的约为50000，更优选的是70000左右，或至少为200000。优选的分子量范围介于5000到200000之间，更优选的是介于70000到90000之间。
在一实施方式中，所述果胶的凝结度在约10到15之间，酯化度在约70到75之间，ΔCS不超过18。或者是，ΔCS不超过14，或不超过10，或不超过6，或不超过3，或不超过2，或不超过1。
在另一实施方式中，本发明针对的是制备果胶的工艺方法，包括用果胶裂解酶(pectin lyase)在充分的条件下处理凝结度为10％、酯化度为55％、ΔCS大于0厘泊的起始果胶(starting pectin)，生产出ΔCS值低于起始果胶的加工后果胶(processed pectin)。起始果胶的凝结度至少为20％，或者不超过30％，优选介于15％到25％之间。
起始果胶的酯化度至少为55％，或至少为70％，或至少为80％，优选介于55％到80％之间，更优选介于60％到72％之间。
起始果胶的ΔCS值至少为20，或至少为200，或至少为300，或至少为500。
通过此方法生产出的加工后果胶其ΔCS不超过20厘泊，优选不超过10厘泊，更优选不超过5厘泊，最优选约为0厘泊。加工后果胶的ΔCS范围优选在0厘泊到20厘泊之间，最优选在0厘泊到10厘泊之间。
起始果胶的分子量不超过240,000，优选不超过150,000，而且分子量至少为100,000。
在本发明的另一工艺方法中，凝结度至少为10％、酯化度至少为70％和ΔCS大于0厘泊的的果胶，在适当的条件下用植物果胶甲酯酶(plant pectin methylesterase)处理，以生成凝结度至少为10％、酯化度至少为55％和ΔCS大于0厘泊的脱脂果胶(de-esterified pectin)；然后，该脱脂果胶在适当的条件下用果胶裂解酶处理，以生成凝结度至少为10％和ΔCS不超过20厘泊的果胶。
本发明也延伸到上述方法所制得的果胶。
在又一实施方式中，本发明涉及含有任何上述本发明的果胶或者加工后果胶的食品组合物。在一方案中，这种果胶的凝结度至少为10％、酯化度为至少55％和ΔCS不超过100厘泊。所述食品组合物可包含酪蛋白，并优选是饮料，更优选是酸性乳类饮品。
在本发明的再一实施方式中，本发明是关于一种增加食品组合物储藏稳定性的方法，该方法包括利用上述本发明中的果胶或加工后果胶，对食品组合物进行调配。发明详述借助本发明，可以获得具有良好稳定能力的果胶，而且该果胶即使用在相对较高的浓度中，也不会有明显的不合需要的粘度增长。
以往，稳定蛋白质和粘度增长最低，通常是果胶矛盾的目标。若不受理论的束缚，可以认为稳定蛋白质的作用是源于果胶上负电核的存在，主要为酸性团的形式，而酸性团又与导致粘度增长直至形成凝胶的二价阳离子桥(divalent cation bridging)或者交联(cross-linking)有关，因此，酸性团数量的增加有助于改善稳定能力，同时也增加了果胶使含二价阳离子如钙离子液体的粘度增加的趋势。相反的，选择具有低酸度的果胶，会避免明显的粘度增加，但同时稳定能力也相对较弱。从理论上讲，可以选择出介于两种极端情况之间的果胶，使其具有相对较高的稳定能力而不会产生明显的粘度增加。然而，实际上这样使用果胶的优点会因为先前讨论的过量需求而被抵消，因为在过量的条件下，这种特性的折衷会打破，从而产生不需要的粘度增加。
本发明者已经发现了能够提供具有良好的稳定能力而且即使在过量情况下也不会导致粘度增加无法接受的果胶。本发明的果胶可以有各种表述其性质的参数，包括酯化度即％DE、凝结度即DB、钙离子灵敏度即ΔCS、分子量、蛋白质稳定能力即YOG、粘度能力即VIS以及粘度能力和稳定能力的比值VIS/YOG。这些参数以及它们的测量方法将在下面进一步讨论和解释。
酯化度(％DE)如前所述，果胶的酯化度指的是果胶中的酸性团甲基化后所占的百分比。对于HM果胶，至少有50％的羧基单元是以甲酯的形式出现。随着％DE的增加，钙离子的灵敏度降低，而且可以预料，稳定能力也有所降低。本发明中的果胶的％DE值至少为55％，优选在约60％或70％到约72％范围之内，最高可以达到约80％。在这些较高的范围时，可以预计稳定能力有所下降，这种预计的理论基础是相对减少的酸性团不能提供足够的负电荷，以使蛋白质有效地稳定。还应值得一提的是，当制备本发明的果胶时是采用酶来处理起始原料，则起始原料的％DE值基本保持不变。
样品制备称取2.0000g果胶置于250ml玻璃烧杯中，加入100ml醇酸(100ml 60％异丙醇加5ml 37％发烟盐酸)，磁力搅拌10分钟。用干燥的、称重的玻璃过滤坩埚过滤所得的溶液；分别用15ml醇酸洗涤烧杯6次，同样过滤洗涤所用的溶液。用60％的异丙醇(IPA)洗涤滤液，直到该滤液被测定为不含氯化物为止；测定时，取约10ml滤液加入试管中，再加入约3ml 3N的硝酸，然后再加入几滴(2或3滴)硝酸银，如果溶液澄清，没有观察到氯化银沉淀，则该滤液可以认为不含氯化物。大约使用500ml IPA洗涤液就足够了。一旦滤液被认定为不含氯化物，再用20ml 100％的IPA洗涤，在105℃干燥2.5小时，称重坩埚。
测量法称取两份滤液，每份重0.4000g，分别置于两个250ml烧杯中，第二个样品用作第一个样品的校核(check)，两个样品采取相同的步骤。用大约2ml 100％的IPA浸湿果胶，然后在磁力搅拌器上边搅拌边加入约100ml的去离子水。此时，样品准备好进行滴定了。对第二个样品进行同样的操作步骤，将第二次滴定量记录为B1。
滴定1.用0.1NNaOH滴定至pH为8.5，记录滴定量为V1；2.加入20.00ml 0.5N的NaOH，盖上锡箔纸，静置15分钟；3.加入20.00ml 0.5N的HCl，然后进行磁力搅拌直到pH值恒定；4.用0.1N NaOH滴定至pH为8.5，记录滴定量为V2。空白实验1.用0.1N NaOH滴定100ml已脱除二氧化碳的去离子水至pH为8.5，记录滴定量为V1；2.加入20.00ml 0.5N的NaOH，盖上锡箔纸，静置15分钟；3.加入20.00ml 0.5N的HCl，然后进行磁力搅拌直到pH值恒定；4.用0.1NNaOH滴定至pH为8.5，记录滴定量为B1。
在上述第四步中，滴定所允许的最大量是1ml 0.1N的NaOH，如果超过了1ml，则需要重复实验，将第三步中的0.5N HCl用少量的去离子水稀释；同样，如果在上述第三步中加入0.5N HCl后pH值不能降到8.5以下，则需要在第二步中用少量的去离子水稀释0.5N NaOH。当必须要进行稀释时，最多只能稀释到所得溶液浓度在0.52至0.48N之间。
计算酯化度依照下式计算Vt＝V1+(V2-B1)％DE＝(V2-B1)*100/Vt凝结度(DB)凝结度是一个衡量果胶分子中酸性团分布的参数。凝结度指的是酸性团聚集在一起、与其随机分散在聚合物中相对的性质。当酸性团随机分散时，其单独的负电荷相对较弱，因此，在稳定蛋白质或增加粘度方面的作用都比较小。但是，当酸性团以块状聚集状态存在时，负电荷也聚集在一起，相对比较大，因此可以增加果胶的稳定能力和粘度能力。为便于描述，％DB表达的是没有甲基化的半乳糖醛酸分子(单体、二聚体和三聚体)的含量，该半乳糖醛酸分子经内聚半乳糖醛酸酶(PG，EC3.2.1.15)处理而被释放，％DB为每克果胶中没有酯化的所有半乳糖醛酸分子的百分含量。本发明中的果胶的％DB值在约10到30之间。对于％DB值来说，当本发明的果胶是通过用酶处理起始原料而被制备时，起始原料中的％DB值基本上保留在产物中。
原理和计算大家知道，聚半乳糖醛酸酶可以通过水解解离半乳糖醛酸的链而使果胶聚合物裂解。它只进攻剩余的未甲基化的半乳糖醛酸，这就意味着从果胶聚合物中释放单半乳糖醛酸、二半乳糖醛酸和三半乳糖醛酸，主要取决于(a)现存剩余的未甲基化的半乳糖醛酸；(b)未甲基化的半乳糖醛酸的分子内的分布。如果剩余的未甲基化的半乳糖醛酸在分子内的分布保持不变的话，那么果胶中现存剩余的未甲基化的半乳糖醛酸的量越大，经PG保温处理后，从果胶聚合物中释放出的单体、二聚体和三聚体的量也就越大。如果剩余的未甲基化的半乳糖醛酸的量保持不变的话，那么剩余的未甲基化的半乳糖醛酸的聚集(clustered or blocky)程度越大，经PG保温处理后，从果胶聚合物中释放出的单体、二聚体和三聚体的量也就越大。
对于具有给定％DE的果胶，以％DB表示的凝结度，可根据PG处理后所释放出的未酯化的半乳糖醛酸单体、二聚体和三聚体进行量化测定。量化测定采用高性能的阴离子交换色谱(HPAEC)来进行，详见Daas，P.J.H等，Anal.Biochem.，257(2)，pp.195-202(1988)，此处引为参考文献。
聚半乳糖醛酸酶的制备在此所用的聚半乳糖醛酸酶PG-1制品是来源于黑区霉(A.Niger)。尽管此处使用的PG-1制品是根据EU资助的项目“AIR2-CT941345”用克隆法生产的，但该酶天然存在于黑区霉中，而且可以采用常规的酶分离技术和纯化技术从黑区霉中予以分离。
聚半乳糖醛酸酶的反应活性PG的活性测试方法如下取260μl(这里所用的符号“μl”代表微升)聚半乳糖醛酸溶液(聚-D-半乳糖醛酸(C6H8O6)n约150USB)加入到210μl50mM的醋酸钠中，所得溶液的温度调节至30℃；然后，加入50μl待测酶，溶液仔细混合，分别在0、1、2、3、4、5分钟后取出50μl样品；将移液管吸取的样品加入到1ml Na2CO3(26.5g/l)中，反应立即停止；仔细振摇后，加入0.5mlneucoproin溶液(在11离子交换水中加入400mg neucoproin氯化氢CR，C14H13ClN2l+200mg CuSO4·5H2O)，将样品保温在65℃放置15分钟，再室温放置15分钟；然后在460nm波长处，用比色杯测量制品相对于0分钟时所取样品的吸光度。为了测定还原端基(reducing end group)的含量(μmol)，用D-半乳糖醛酸的溶液(8.57mg/ml)绘制一个标准曲线，分别取0、15、30、45、60μl半乳糖醛酸溶液，用50mM醋酸钠稀释至1ml；然后，每个样品各取50μl，按上面从“将移液管吸取的样品…”开始所描述的方法进行处理；以半乳糖醛酸的含量μmol对460nm处的吸光度绘制标准曲线。活性表示为
1U(unit)＝μmol生成的还原端基x min-1/ml色谱分析前用PG处理将250mg待分析的果胶用40μl乙醇浸湿，于70℃下磁力搅拌，使之溶于50ml去离子水中；将果胶样品冷却到40℃，其pH调节为4.2；然后，将1.5ml果胶制品加入3.5单位(unit)的PG-1，样品于40℃恒温30分钟并持续搅拌；加入70μl HNO3并加热至80℃持续10分钟，停止反应。
色谱分析PG处理后得到的果胶水解液(pectin digest)按照Daas，P.J.H.等描述的方法分析，所作的少量修改描述如下使用Dionex(Sunnyvale，CA，USA)DX-500高效液相色谱(HPLC)系统，并配备有一台GP40四元梯度泵、一个AS3500自动进样器和一个流动相脱气(He)室。检测是用氢氧化钠柱后传送系统和带有一个安培池的Dionex ED40电化学检测器实现的。检测器以脉冲电流检测(PAD)模式工作，并配有金工作电极和Ag/AgCl参比电极。柱后传送系统由DQP-1泵、脉动阻尼器系统和保护柱(GM-3)组成。出口用一个T形接头与色谱柱出口连接，并混合接入一个1500μL的混合池。洗脱液与氢氧化钠(2.5M)混合后，样品进入PAD检测器。色谱图用Dionex Peak网络软件4.11版本记录。低聚物在Dionex CarboPac PA 1柱上用CarboPacPA-1保护柱分离。洗脱过程是用0.05-0.7M醋酸钠(pH＝5.0)以0.5毫升/分的速率线性梯度洗脱65分钟，然后用1M的醋酸钠线性梯度洗脱10分钟，再用0.5毫升水洗。平衡15分钟后，随0.05M醋酸钠(pH＝5.0)，注入80μl样品。调节柱后泵，使流向PAD池的最终流速为1.0毫升/分。
醋酸盐缓冲液的制备方法为用水稀释醋酸，再用50％的氢氧化钠溶液滴定至pH＝5.0，然后用水调节体积，最终使醋酸盐浓度为1M。通过混合醋酸盐缓冲液和Millipore(微孔)系统水，实现梯度。
用于电流检测的三脉冲序列包括下述电位和持续时间E1＝0.05V(t1＝0.4s)，E2＝0.75V(t2＝0.2s)和E3＝-0.15V(t3＝0.4s)，延迟0.2秒后，累积(Integration)0.2秒。
为了定量非酯化的半乳糖醛酸单体、二聚体和三聚体，这些组份的PAD响应因子必须被确定(见Hotchkiss A.T.等，Anal.Biochem.，184，200-206(1990))。首先，获得不同量的二聚体和三聚体(0.05-2.5微摩尔)的峰面积，并与相同量的单半乳糖醛酸进行比较。计算相应的响应因子。在每一系列中，确定标准量的单半乳糖醛酸(0.051μm)的PAD响应面积，以便能够精确计算该系列的半乳糖醛酸单体、二聚体和三聚体的浓度。根据半乳糖醛酸单体、二聚体和三聚体的量，用上面提出的％DB公式计算凝结度。
分子量(MW)果胶分子量(重量平均)依据所用提取源和方法的不同，变化的范围较大。为了本发明的目的，用作起始原料的果胶一般有低于240,000的分子量，并且优选的范围大致从100,000到150,000(除非特别说明，此处提及的分子量以道尔顿表示)。酶处理之后，加工后果胶的分子量当然低于所选起始果胶，并且一般来说应在约40,000到约200,000道尔顿范围内。可以看出加工后果胶的效力基本上降到约40-50,000分子量以下，并且在约40-50,000到70,000范围内被稍微降低，但是仍然有用。本发明优选的果胶分子量范围是从约70,000到约90,000。
果胶样品的制备通过用六偏磷酸钠测量0.1％果胶溶液的相对粘度的方法来估计果胶的分子量。首先，样品按照有关测定％DE的那部分所述进行制备。六偏磷酸钠溶液的制备方法为在1800毫升去除空气(沸腾)的离子交换水中溶解20.0克六偏磷酸钠，用1M HCl调节pH值为4.50±0.05，再用去除空气(沸腾)的离子交换水稀释至2000毫升。就在测量前，必需量的六偏磷酸钠溶液用#3玻璃漏斗过滤，然后，大约90克的六偏磷酸钠溶液被称量并放入一个加了磁子的已配衡的烧杯。
其次，0.100克酸洗的果胶在搅拌下逐渐加入上述烧杯中。溶液在搅拌下被加热到70℃，并继续搅拌直到果胶完全溶解。然后溶液冷却到25℃，用六偏磷酸钠溶液调到重量为100.0克并用#3玻璃漏斗过滤。
分子量的测定对每组分子量的测定，果胶/六偏磷酸钠溶液的流出时间用下述程序在两个不同的粘度计上进行测量。用所用粘度计上已测的的六偏磷酸钠溶液的流出时间来分别计算每个粘度计上的分子量。如果两组计算的分子量差值小于3500，平均值被计算并四舍五入到最近的1000的整数倍。如果两组计算的分子量差值是3500或更多，清洗粘度计，而且应该重新测量六偏磷酸钠溶液的流出时间。
为测量流出时间，用样品清洗两次粘度计，然后，5.00毫升的样品倒入粘度计，并在测量前放入25.0℃±0.3℃的恒温水浴中至少15分钟。在两个出口测量流出时间，如果时间差值大于0.2秒(测量六偏磷酸钠溶液时)或大于0.4秒(测量样品时)，重复进行测量，直到差值小于适当的值。用于确定分子量的流出时间是上面提及的相同或基本相同的测量结果的平均值。
相对粘度用下式计算nr=(to-Kto)(th-Kth)]]>式中to和th分别是果胶溶液和六偏磷酸钠溶液的流出时间。
参数K能用Witeg-Ostwald粘度计十分精确地固定在107s2。否则K可按下式计算K=Q×tv2Q+(0.026×L×tv)]]>式中Q为粘度计球的体积，单位为cm3，L为毛细管长度，单位cm，tv为水的流出时间，单位为秒。分子量按下式计算M=(nr1/P-1)k×C×P]]>式中P固定为6，k固定为4.7×10-5摩尔/克；C是样品系统果胶的重量百分数。代入数值可得 钙灵敏度(ΔCS)通过本发明的方法加工后果胶的钙灵敏度被显著降低，特别令人奇异的是DB基本上保持不变。钙灵敏度指包含不含钙果胶的参比溶液与包含含有钙果胶的溶液的粘度差值，并因此可用ΔCS表示，这一点在下面有进一步的阐释。本发明果胶的ΔCS值将低于100，优选地低于20，如在约5到约10的范围内，而且优选地可以约为0。起始原料的ΔCS可能是高于约20的任何值，并且可能更高，如可能高于约300，或甚至高于约500。
在含0.5％果胶的溶液中果胶的钙灵敏度，优选在纯的果胶中测量。为避免钙离子和果胶有任何强的结合，钙盐和果胶在低pH下混合。加入醋酸钠/醋酸缓冲溶液后，果胶和钙离子开始反应。比较含钙果胶溶液的粘度与不含钙的相同溶液的粘度，其粘度差就是钙灵敏度，或ΔCS，单位为厘泊。
更具体地，用2.4克果胶制备400克溶液(0.6％的溶液)。如果没有使用纯的果胶，溶液应用按下式计算的果胶量进行校正0.6×400A]]>式中A是样品的果胶含量。
所用果胶的量(如是纯果胶为2.4克，否则按上式计算)被精确称至三位十进制小数。果胶被在高剪切搅拌器(Waring搅拌器型号34BL99，Waring Product Division Dynamic Corporation of America，NewHartford，Connecticut)中高速分散到250毫升的沸腾去离子水中，约需4分钟。(此处所用的所有去离子水是电导率在1.0μS/cm以下的离子交换水)。剪切的果胶溶液被倒入配衡的烧杯中，加入磁子在JK IKA-Combimag REO磁力搅拌器(Janke & Kunkel(IKA)，Staufen，Germany)上搅拌。高剪切搅拌器用另外的100毫升去离子水清洗，这100毫升水也被加入烧杯里的果胶溶液中。溶液冷却到25℃±1℃，然后用1M盐酸溶液在搅拌下调节pH值为1.5。加入额外的去离子水，以使溶液重量为400克，而后分别称取145±1克果胶溶液加入两个50×100毫米的粘度杯(Holm & Halby)中。每个粘度杯中加入一个磁子；第一步中，在IKA MAG EOA 9磁力盘式搅拌器上，边搅拌边向一个粘度杯中加入5毫升去离子水，向另一个粘度杯中加入5毫升250mM的Ca2+溶液(36.7550克/升CaCl2·2H2O)。接下来，在IKA MAG RET磁力搅拌器剧烈搅拌下向每个粘度杯中加入25毫升1M的醋酸盐缓冲溶液(68.04克/升500mM的CH3COONa·3H2O，和28.6克/升500mM的CH3COONa，100％)。在第一步中继续搅拌2分钟，而后移出磁子，溶液用Parafilm膜密封并放于25℃下过夜。然后，用Brookfield LVT粘度计于60RPM下在25℃恒温水浴中测定粘度。以厘泊表示的、两组溶液的粘度差就是目标果胶的钙灵敏度，或ΔCS。
本发明的果胶可以用果胶裂解酶处理起始果胶而制得，果胶裂解酶的用量足以获得具备欲得性质的果胶，这将在本发明中进一步描述。本发明果胶的制备过程不受起始原料凝结度或酯化度的明显影响。因为DB与沿果胶骨架的酸性团的浓度大小有关，而且酸性团浓度一般与钙灵敏度有关，所以，不改变DB而能降低钙灵敏度是十分奇特的。
无论是用于处理的特定的果胶裂解酶，还是用作起始原料的果胶源，对于工艺优化都不是关键的，也不可能被选择或调节作为进行工艺优化的常规物质。果胶裂解酶是人们熟知的，尽管可以有其它的来源，但通常是从黑曲霉中获得的；黑曲霉中有几种变体，见荷兰Wageningen农业大学Van Houdenhoven F.E.A.的博士论文“果胶裂解酶的研究”17(1975)和荷兰乌得勒支州立大学的Kusters-Van Someren，M.A.的博士论文“黑曲霉果胶裂解酶族的表征”(1991)，此处引为参考文献。分解酶制备中的污染物，尤其是有生化活性的污染物，将降低实施上述过程和获得本发明果胶的能力，因此只应当使用基本上纯的或被纯化到基本上均一的分解酶制品。
正如前面所指，果胶存在于很大范围内的植物源中并且能从其中提取，包括相对普遍的商业来源如柠檬、酸柠檬(lime)、柑桔、葡萄、苹果和甜菜，但这并非限制性的。
实施例酶使用四种不同的包含果胶裂解酶(PL，E.C.4.2.2.10)的酶制品。制品A是源自黑曲酶的果胶裂解酶A(PLA)，制品B是同样源自黑曲酶的果胶裂解酶D(PLD)。尽管下面实施例所用样品PLA和PLD是按欧洲资助项目“AIR2-CT941345”被克隆生产的，但这些酶自然存在于黑曲酶中，因而可以使用常规的酶分离技术和纯化技术，从黑曲酶中将它们分离出来，如Van Houdenhoven论文中所述。为了使活性最大化，这种酶应该被纯化到基本上均一，并且要避免来自不纯制品的污染和/或不希望的副反应。
制品C是一种商业真菌酶制品，可从英国的Biocatalyst以“Pectinase444L”的形式得到；而制品D是一种商业酶制品，可从德国的Roehm以“Rohapect PTE”的形式得到，它是从遗传改进的有机体(黑曲酶种)中制备的。
酶的活性酶制品A到D都进行PL活性测试。PL通过聚合物骨架C-4处的反式消除分裂，催化果胶的非水解性断裂，并同时从C-5处消除H，在C-4和C-5间生成一个双键，这就引起235nm处的吸收增加。因而，果胶裂解酶的活性是根据在30℃测量235nm处光强的增加、用分光光度法测定的。测定混合液包含1.4ml Mcllvaine缓冲溶液(36.85mM柠檬酸，126.3mM NaH2PO4，用0.5N NaOH调节pH到5.5)、0.4lml、0.0625％的果胶(DE为72％的B-快速凝固，丹麦的哥本哈根Pectin A/S)和0.2ml酶。用摩尔消光系数∑2355500计算活性。一单位量(1U)的活性被定义为每分钟生成1微摩尔不饱和产品的酶的量。
此处所述过程提及的果胶裂解酶的“适当量”或表达这种意思的词，是指基于分解酶处理的果胶的目标分子量来计算的量，而且使用的是分解酶的特定活性。所用酶的量可由等式e(y-a/b)＝x给出，其中y是分子量的降低值(即ΔMW)，x是每500克果胶的酶的量(单位)。使用这个等式时，酶处理的时间为1小时，a和b是用所用酶在进行几次实验后确定的酶的特定常数。
酶处理三组不同的起始原料经受含PL制品的果胶的酶处理，浆液来自用HM提取的干果皮，用植物甲基酯酶处理并干燥果胶粉未。
源于用HM提取干果皮的浆液600千克干柠檬果皮加入到1700升离子交换水中，加热到70℃并搅拌2个小时，然后加入98升62％的HNO3并提取1个小时；接下来为了便于过滤，向提取物中加入100千克纸浆；所得制备液真空过滤并用硅藻土进行过滤(“空白过滤”)。过滤后的浆液在强阳离子交换柱(IRC120，Bayer公司)上进行离子交换，再蒸发到原体积的50％，结果以干重的重量/重量计，形成了浓度约3％到约5％的果胶。加入NH3(2％的溶液，用去离子水从25％的NH3稀释)调节pH值到5.5，并且加入适当量的PL。
酶反应一直进行到达到欲得的分子量为止。为了停止反应，加稀HNO3(10％v/v)将pH降低到2.5，并用加热套将温度从室温升温至80℃并保持10分钟。果胶按1∶3的比例在80％的2-丙醇中沉淀，挤压沉淀的果胶，并用60％的2-丙醇洗涤。挤压后果胶在70℃干燥16-20个小时。研磨干燥的样品，并用0.25毫米的试验筛过筛。
用PME处理浆液1,300千克干柠檬果皮加到25,500升离子交换水和126升62％的HNO3中，提取7个小时。为了便于过滤，向提取物中加入100千克纸浆，然后所得制备液被真空过滤，接着空白过滤。过滤的浆液在强阳离子交换柱(IRC 120)上进行离子交换，再蒸发到原体积的50％，结果以干重的重量/重量计，形成了浓度约3％到约5％的果胶，再冷却到45℃，并且加入2％的NH3调节pH到5.5。
加入适当量的植物PME，并让反应进行到获得了欲得的酯化度为止。欲得的酯化度由关系式y＝1.6x确定，其中，y是％DE的变化量(即Δ％DE)，x是每千克果胶中NH3的克数(克NH3/千克果胶)。反应中，通过自动滴定2％的NH3而使保持pH值不变。加入HNO3使pH为2.5并加热到80℃保持10分钟，使PME失活。冷却到室温后，用2％v/v的NH3溶液调节pH到5.5，并加入适当量的PL。酶的反应被进行到达到欲得的分子量为止。为了停止反应，加稀HNO3调节pH到2.5，并升温至80℃，保持10分钟。在果胶与丙醇的比例为1∶3的比例下，用80％的丙醇沉淀果胶。挤压沉淀的果胶，并用60％的2-丙醇洗涤。挤压后，果胶在70℃干燥16-20个小时。研磨干燥的样品，并用0.25毫米的试验筛过筛。
干燥的果胶粉未500克果胶在剧烈搅拌下溶于10升70℃的离子交换水中。果胶溶液冷却到室温，并用2％的NH3调节pH到5.5。再加入适当量的PL，并且酶的反应被进行到达到欲得的分子量为止。为了停止反应，加入稀HNO3调节pH到2.5，并升温至80℃，保持10分钟。在果胶与丙醇的比例为1∶3的比例下，用80％的丙醇沉淀果胶，挤压沉淀的果胶，并用60％的2-丙醇洗涤。挤压后，果胶在70℃干燥16-20个小时。研磨干燥的样品，并用0.25毫米的试验筛过筛。
结果表示如下实施例1-PLD
实施例2-PLA
实施例3-444L
实施例4-PTE
当用酶处理得到这些结果时，假定处理不改变起始果胶的％DE和％DB，用化学处理可以获得可比较的结果。特别地，任何借助β消除引起1，4-糖苷键链接裂解的化学反应，都可被用来产生性质可与上述酶处理所产生果胶相比的果胶。例如，用强碱试剂如NaOH处理果胶溶液，尽管溶液的pH值升高到7以上，却产生相似的结果。
此处，本发明的讨论只是针对某种具体的方法和物质。而枚举这些方法和物质仅是说明性的，这对本发明的范围内决不应形成任何限制。可以预计，本领域的熟练人员在不背离本发明范围的前提下，能够对此处提及的具体实施例进行变动或改进。
权利要求
1.一种果胶，其凝结度至少约10％、酯化度至少约55％且ΔCS不超过约100厘泊。
2.如权利要求1所述的果胶，其中，其ΔCS不超过约30厘泊。
3.如权利要求2所述的果胶，其中，其ΔCS不超过约20厘泊。
4.如权利要求3所述的果胶，其中，其ΔCS不超过约10厘泊。
5.如权利要求4所述的果胶，其中，其ΔCS不超过约5厘泊。
6.如权利要求5所述的果胶，其中，其ΔCS约为0厘泊。
7.如权利要求3所述的果胶，其中，其ΔCS在约0厘泊到约20厘泊之间。
8.如权利要求7所述的果胶，其中，其ΔCS在约0厘泊到约10厘泊之间。
9.如权利要求1所述的果胶，其中，其凝结度至少约20％。
10.如权利要求1所述的果胶，其中，其凝结度不超过约30％。
11.如权利要求10所述的果胶，其中，其凝结度在约15％到25％之间。
12.如权利要求1所述的果胶，其中，其酯化度至少约60％。
13.如权利要求12所述的果胶，其中，其酯化度至少约70％。
14.如权利要求13所述的果胶，其中，其酯化度至少约80％。
15.如权利要求1所述的果胶，其中，其酯化度在约55％到约80％之间。
16.如权利要求15所述的果胶，其中，其酯化度在约60％到约72％之间。
17.如权利要求1所述的果胶，其中，其分子量至少约40,000。
18.如权利要求17所述的果胶，其中，其分子量至少约50,000。
19.如权利要求18所述的果胶，其中，其分子量至少约70,000。
20.如权利要求19所述的果胶，其中，其分子量至少约200,000。
21.如权利要求17所述的果胶，其中，其分子量在约50,000到约200,000之间。
22.如权利要求21所述的果胶，其中，其分子量在约70,000到约90,000之间。
23.如权利要求1所述的果胶，其中，其凝结度在约10到15之间，酯化度在约70到75之间，并且ΔCS不超过约18。
24.如权利要求23所述的果胶，其中，其ΔCS不超过约14。
25.如权利要求24所述的果胶，其中，其ΔCS不超过约10。
26.如权利要求25所述的果胶，其中，其ΔCS不超过约6。
27.如权利要求23所述的果胶，其中，其ΔCS不超过约3。
28.如权利要求27所述的果胶，其中，其ΔCS不超过约2。
29.如权利要求28所述的果胶，其中，其ΔCS不超过约1。
30.一种制备果胶的方法，所述方法包含用果胶裂解酶处理凝结度至少约10％、酯化度至少约55％并且ΔCS大于0厘泊的起始果胶的步骤，其中，所述果胶裂解酶处于足以使加工后果胶的ΔCS低于所述起始果胶的ΔCS的处理条件下。
31.如权利要求30所述的方法，其中，所述起始果胶的凝结度至少约20％。
32.如权利要求31所述的方法，其中，所述起始果胶的凝结度不超过约30％。
33.如权利要求32所述的方法，其中，所述起始果胶的凝结度在约15％到25％之间。
34.如权利要求30所述的方法，其中，所述起始果胶的酯化度至少约55％。
35.如权利要求34所述的方法，其中，所述起始果胶的酯化度至少约70％。
36.如权利要求35所述的方法，其中，所述起始果胶的酯化度至少约80％。
37.如权利要求30所述的方法，其中，所述起始果胶的酯化度在约55％到80％之间。
38.如权利要求37所述的方法，其中，所述起始果胶的酯化度在约60％到72％之间。
39.如权利要求30所述的方法，其中，所述起始果胶的ΔCS至少约20。
40.如权利要求39所述的方法，其中，所述起始果胶的ΔCS至少约200。
41.如权利要求40所述的方法，其中，所述起始果胶的ΔCS至少约300。
42.如权利要求41所述的方法，其中，所述起始果胶的ΔCS至少约500。
43.如权利要求30所述的方法，其中，所述加工后果胶的ΔCS不超过约20厘泊。
44.如权利要求43所述的方法，其中，所述加工后果胶的ΔCS不超过约10厘泊。
45.如权利要求44所述的方法，其中，所述加工后果胶的ΔCS不超过约5厘泊。
46.如权利要求45所述的方法，其中，所述加工后果胶的ΔCS约为0厘泊。
47.如权利要求30所述的方法，其中，所述加工后果胶的ΔCS在约0厘泊到约20厘泊之间。
48.如权利要求47所述的方法，其中，所述加工后果胶的ΔCS在约0厘泊到约10厘泊之间。
49.如权利要求30所述的方法，其中，所述起始果胶的分子量不超过约240,000。
50.如权利要求49所述的方法，其中，所述起始果胶的分子量不超过约150,000。
51.如权利要求49所述的过程，其中，所述起始果胶的分子量约为100,000。
52.一种由权利要求30所述方法制备的果胶。
53.一种制备果胶的方法，所述方法包含以下的步骤a)、用植物果胶甲基酯酶处理凝结度至少约10％、酯化度至少约70％并且ΔCS大于0厘泊的果胶，其中，所述植物果胶甲基酯酶处于足以产生凝结度至少约10％、酯化度至少约55％并且ΔCS大于0厘泊的脱脂果胶的条件下；b)、用果胶裂解酶处理脱脂果胶，其中果胶裂解酶用量处于足以产生凝结度至少约10％并且ΔCS仅约20厘泊的果胶的条件下。
54.一种由权利要求53所述方法制备的果胶。
55.一种可食用组合物，包括凝结度至少约10％、酯化度至少约55％并且ΔCS不超过约100厘泊的果胶。
56.如权利要求55所述的可食用组合物，其进一步包括酪蛋白。
57.如权利要求56所述的可食用组合物，其中，所述可食用组合物是一种饮料。
58.如权利要求57所述的可食用组合物，其中，所述饮料是一种酸性乳类饮品。
59.如权利要求55所述的可食用组合物，其中，所述果胶的ΔCS不超过约20厘泊。
60.如权利要求55所述的可食用组合物，其中，所述果胶的凝结度在约15％到约25％之间。
61.如权利要求55所述的可食用组合物，其中，所述果胶的酯化度在约60％到约72％之间。
62.如权利要求55所述的可食用组合物，其中，所述果胶的分子量在约70,000到约90,000之间。
63.一种增加可食用组合物贮备稳定性的方法，所述方法包括用凝结度至少约10％、酯化度至少约55％并且ΔCS不超过约100厘泊的果胶配制所述的可食用组合物。
全文摘要
本发明涉及一种凝结度至少约10%、酯化度至少约55%、△CS不超过约100厘泊的果胶。该果胶的制备方法包括用果胶裂解酶处理凝结度至少约10%、酯化度至少约55%并且△CS大于0厘泊的起始果胶的步骤,其中,果胶裂解酶处于足以产生加工后果胶的△CS值低于起始果胶的条件下。本发明还涉及包含上述果胶的可食用组合物和一种增加用上述果胶配制可食用组合物以提高贮备稳定性的方法。
文档编号A23C9/137GK1352653SQ00805933
公开日2002年6月5日 申请日期2000年3月23日 优先权日1999年3月31日
发明者卡林·迈耶·汉森, 弗莱明·莫勒 申请人:Cp凯尔科药物学科学院