专利名称：检测及鉴别肠病毒的方法及其所用之引物及探针的制作方法
技术领域：
本发明揭示了核苷酸引物对在检测检体中肠病毒之存在与否中的应用。本发明亦揭示能够与肠病毒核酸之有义链或相关于该有义链之核酸进行特异性杂交反应之合成性核苷酸序列。本发明提供了检测肠病毒核酸在检体中存在与否的方法以及在检体中检测肠病毒之试剂盒。本发明特别提供检测及鉴别检体中肠病毒71型及/或柯萨奇病毒A16型的方法及试剂盒。
肠病毒属于小RNA病毒科(Picornaviridae)。该病毒科在成员数量上代表非常大的RNA病毒家族，但在病毒颗粒尺寸及复杂程度上俱为最小之一。肠病毒之病毒体包括由60个次单元所组成，每个次单元由四种蛋白质(VP1-VP4)以正二十面体对称方式围绕由单链正义RNA形成之基因体。肠病毒短暂栖于人类消化道，也可以从肠道后段或喉咙分离。人类来源之肠病毒包括小儿麻痹病毒(血清型1至3)，柯萨奇病毒A群(CAV，血清型1至22及24)及柯萨奇病毒B群(CBV，血清型1至6)，肠道细胞病变孤独病毒(血清型1至9，11至27及29至33)及肠病毒(血清型68-71)。人类肠病毒感染可导致大范围涉及神经，皮肤及粘膜，心脏及肌肉，眼，呼吸道及胃肠道疾病的急性症状，以及无明显特征之热病，广泛之婴儿疾病及糖尿病。在非小儿麻痹之肠病毒中，一些未分类之血清型所造成的感染特别在夏季及初秋盛行于一些国家及地区，例如肠病毒70型及71型。肠病毒71型曾由罹患脑膜炎、脑炎及类似小儿麻痹脊髓炎之麻痹患者身上分离，仍为世界上时而致命之中枢神经系统疾病之主要原因。再者，此型病毒在一些地区引起人类手足口疾病之爆发，例如在日本，瑞典及台湾。
肠病毒的一般诊断通常包括病毒收获及血清学试验。病毒的分离可包含自漱喉水、喉咙棉拭、粪便、直肠棉拭中分离病毒，有时可从脑脊髓液(在无菌性脑膜炎的情形)中分离病毒。将经分离之病毒样品接种至组织培养物或乳鼠(后者专门为柯萨奇病毒)中繁殖及鉴定。此种病毒收获程序每次耗费一至二星期才能完成。另外，亦需合格技术人员参与才得以完成。
血清学试验方面通常进行中和试验以检测对感染病毒具特异性之中和性抗体。对于一些肠道细胞病变孤独病毒而言，血球凝集抑制试验可指出血清型特异性感染。血清抗体亦能经由免疫荧光技术在盖玻片上使用被感染细胞培养物作为抗原来进行检测及滴定。然而，血清学试验难以用于评估，因为血清型的种类很多，除非所用的抗原是由特定个人分离或在典型临床疾病流行性爆发时分离。在所有的血清学试验中，熟习本技术之人员必须从结果读数去判断何者为决定值(cut-off values)。同时，在这些试验中所使用的抗原通常需要特别的技术及一段时间来制备以降低异质型反应或交叉反应的发生率。
病毒收获及血清学试验俱不能提供一个快速的诊断工具。然而，与肠病毒相关的急性症状可发展甚速，在有些案例中可能在数天内发展成为致命性。因此对于在实际上能快速且简易检测肠病毒的方法有殷切需求。
本发明涉及新的寡核苷酸对以用于检测肠病毒在检体中存在与否。本发明之具体引物对包括第一引物及第二引物，其可用于经由核酸扩增试验(如聚合酶链反应)快速诊断出与肠病毒相关之疾病或症状。
本发明令人惊异地发现一些核苷酸序列系相关于肠病毒核酸中的保守性区域。因此，本发明进而提供合成性核苷酸序列，其能够特异性与肠病毒核酸之有义链或相关于该有义链之核酸进行杂交。
在另一方面，本发明涉及一种检测肠病毒核酸在检体中存在与否的方法。本发明之方法包含(a)在一扩增方法中将该检体与本发明之一寡核苷酸引物对接触；及(b)经由检测扩增产物之存在与否以决定肠病毒之存在与否。
优选地，在本发明之方法中，该检体于扩增方法中可同时接触除了第一对引物以外之第二对本发明之寡核苷酸引物。在第二对中的引物与第一对中的引物不同。在第二对中的引物可具有与第一对中相对应引物不同之第一引物或第二引物。优选的是，第二对中的两个引物皆与第一对的引物不同。进而，该检体于扩增方法中可同时接触除了第一对及第二对引物以外之第三对本发明之寡核苷酸引物。同样的，在第三对中的引物与第一对或第二对中的引物皆不同。
在另一方面，本发明之方法可进而包含在一扩增方法中将该步骤(a)之产物与本发明之第二寡核苷酸引物对接触。第二对引物经选择而能在一扩增方法中用于扩增一序列，该序列相同于或被包含于使用第一对引物之扩增方法中可得到之序列。
在本发明方法之另一方面，可将在步骤(b)检测到的扩增产物与本发明之至少一个合成性核苷酸序列进行特异性杂交反应。
在另一方面，本发明相关于一种在检体中检测及鉴别肠病毒71型的方法。该方法包含(a)在一扩增方法中将该检体与本发明之至少一对寡核苷酸引物接触；(b)经由检测扩增产物之存在与否以决定肠病毒71型之存在与否；及(c)将在步骤(b)检测到的扩增产物与本发明之含有序列SEQ ID NO12或SEQ ID NO13之合成性核苷酸序列进行特异性杂交反应。优选的是，所检测到的扩增产物系与本发明之含有序列SEQ ID NO12及SEQ ID NO13之合成性核苷酸序列进行特异性杂交反应。
在另一方面，本发明涉及一种在检体中检测及鉴别柯萨奇病毒A16型的方法。该方法包含(a)在一扩增方法中将该检体与本发明之至少一对寡核苷酸引物接触；(b)经由检测扩增产物之存在与否以决定柯萨奇病毒A16型之存在与否；及(c)将在步骤(b)检测到的扩增产物与本发明之含有序列SEQ ID NO14或SEQ ID NO15之合成性核苷酸序列进行特异性杂交反应。优选的是，所检测到的扩增产物系与本发明之含有序列SEQ ID NO14及SEQ ID NO15之合成性核苷酸序列进行特异性杂交反应。
在另一方面，本发明涉及一种在检体中检测及鉴别肠病毒71型及/或柯萨奇病毒A16型的方法。该方法包含(a)在一扩增方法中将该检体与本发明之至少一对寡核苷酸引物接触；(b)经由检测扩增产物之存在与否以决定肠病毒71型及/或柯萨奇病毒A16型之存在与否；及(c)将在步骤(b)检测到的扩增产物与本发明之至少一个含有序列SEQ IDNO12或SEQ ID NO13之合成性核苷酸序列及至少一个含有序列SEQ ID NO14或SEQ ID NO15之合成性核苷酸序列进行特异性杂交反应。优选的是，所检测到的扩增产物系与本发明之含有序列SEQID NO12、SEQ ID NO13、SEQ ID NO14及SEQ ID NO15之合成性核苷酸序列进行特异性杂交反应。
在另一方面，本发明提供在检体中检测肠病毒之试剂盒，其包含至少一对本发明寡核苷酸引物。优选的是，本发明之试剂盒包含超过一对之本发明寡核苷酸引物。在本发明另一方面，该试剂盒可进而包含至少一个本发明合成性核苷酸序列。
在另一方面，本发明提供在检体中检测及鉴别肠病毒71型之试剂盒，其包含至少一对本发明寡核苷酸引物及至少一个含有序列SEQID NO12或SEQ ID NO13之合成性核苷酸序列。优选的是，本发明之试剂盒包含超过一对之本发明寡核苷酸引物。在本发明优选的实施方案中，该试剂盒系包含含有序列SEQ ID NO12或SEQ ID NO13之合成性核苷酸序列。
在另一方面，本发明提供在检体中检测及鉴别柯萨奇病毒A16型之试剂盒，其包含至少一对本发明寡核苷酸引物及至少一个含有序列SEQ ID NO14或SEQ ID NO15之合成性核苷酸序列。优选的是，本发明之试剂盒包含超过一对之本发明寡核苷酸引物。在本发明优选的实施方案中，该试剂盒系包含含有序列SEQ ID NO14或SEQ IDNO15之合成性核苷酸序列。
在另一方面，本发明提供在检体中检测及鉴别肠病毒71型及/或柯萨奇病毒A16型之试剂盒，其包含至少一对本发明寡核苷酸引物，及至少一个含有序列SEQ ID NO12或SEQ ID NO13以及至少一个含有序列SEQ ID NO14或SEQ ID NO15之合成性核苷酸序列。优选的是，本发明之试剂盒包含超过一对之本发明寡核苷酸引物。在本发明优选的实施方案中，该试剂盒系包含含有序列SEQ ID NO12-15之合成性核苷酸序列。
图1之示意图显示相关于肠病毒71型之一部分cDNA序列，其中具有编号U22521之cDNA序列系得自GenBank资料库。在框中的序列相关于本发明之引物及探针，其分别以发明人所使用的命名予以标示。
图2为以不同引物之组合，利用聚合酶链反应扩增肠病毒71型核酸之电泳分析图。a至h行各使用之引物对为af1/r1，bf2/r1，cf3/r1，df5/r1，ef1/r2，ff2/r2，gf3/r1，hf5/r2。m为核酸大小标记，1至5分别为1∶600bp，2∶500bp，3∶400bp，4∶300bp，5∶200bp。
图3为肠病毒71型及柯萨奇病毒A16型之核酸经聚合酶链反应扩增后与肠病毒共通型探针(p1，p2，p3)杂交之结果。聚合酶链反应使用之引物配对为f5/r1，固定在尼龙膜探针之分部位置如下左边第一排之第2至4点p1，中间排之第2至4点p2，右边第一排之第2至4点p3；1和2肠病毒71型与柯萨奇病毒A16型核酸；3为不含核酸之对照组。
图4为肠病毒71型，柯萨奇病毒A16型及肠道细胞病变孤独病毒第3型之核酸分别经多重聚合酶链反应(multiplex PCR)扩增后，与肠病毒共通型探针(p1，p2，p3)及肠病毒71型，柯萨奇病毒A16型特异性探针(71-2，71-3，16-1，16-2)杂交之结果。聚合酶链反应使用之引物配对为fS/r1及f7/r4，固定在尼龙膜探针之分布位置如下将此6×6点阵十字等分为4个3×3的等分，其中左上方区块属肠病毒共通型探针区块，每一排各为3个探针之3重复，右上区块为肠病毒71型区，由两个特异性探针交错排列，左下区块为柯萨奇病毒A16型区，由两个特异性探针交错排列。
术语″特异性杂交″或″特异性杂交反应″意指寡核苷酸与目标序列之间的互补性杂交。术语″特异性″或″特异性地″意指该互补性杂交所显示之特异性，其允许在该寡核苷酸与该目标序列之间有少许错配但不会负面影响检测杂交信号之退火。
术语″检体″意指包括任何含有核酸之生物性物质之检体。优选地，术语″检体″意指包括全血，血清，尿液，唾液，脑脊髓液，精液，泪水，喉咙棉拭，直肠棉拭，排泄物等之生物性检体。
术语″扩增方法″意指扩增核酸序列之试验或方法。例如，该″扩增方法″包括聚合酶链反应(PCR)试验，连接酶链反应(LCR)试验，Qβ-复制酶扩增法，活体外转录法，活体外反转录法及自持性序列复制。
术语″高度严格条件″意指所选择之杂交条件就特定序列及既定的离子强度与pH值下约较热融点(Tm)低5℃。热融点温度时(在既定的离子强度与pH值下)50％之目标序列可与完全相配对之探针杂交。典型地，高度严格条件下，盐浓度在pH 7约为0.2M且温度至少高于60℃。
在此所用的碱基代号包括代表在天然DNA分子中可发现之天然来源嘌呤及嘧啶的代号(即，A，G，T及C)，以及熟习该项技术者在合成寡核苷酸所习知之代表混合碱基的代号(如R，Y，S，H)。关于本案说明书所使用的代号，A(或a)表示腺嘌呤，G(或g)表示鸟粪嘌呤，T(或t)表示胸腺嘧啶，C(或c)表示胞嘧啶，R(或r)表示腺嘌呤或鸟粪嘌呤，Y(或y)表示胸腺嘧啶或胞嘧啶，S(或s)表示鸟粪嘌呤或胞嘧啶，且H(或h)表示腺嘌呤，胸腺嘧啶或胞嘧啶。
本发明可用于检测衍生自肠病毒之核酸。本发明提供快速及灵敏的方法以检测衍生自肠病毒之核酸之存在与否。在本发明优选的实施方案中，本发明之方法为基于聚合酶链反应(PCR)之试验。在另一方面，本发明提供非常特异之PCR引物对，其可用于检测及/或确认特定肠病毒血清型，如肠病毒71型及柯萨奇病毒A16型。在另一方面，本发明提供特异性核苷酸序列，其能够与自使用本发明引物对之扩增方法可得到的核酸片段进行特异性杂交反应。
有一些扩增方法皆可使用，但基于PCR的方法为优选的。PCR方法在相关技艺中所知甚详，因此在此仅作简述。对于PCR方法及步骤程序的综览，可参考例如，U.S.专利Nos.4,683,195及4,683,202；4,965,188；及Innis等人所编著之PCR步骤程序″A Guide toMethods and Application″(Academic Press，Inc.，San Diego，CA.1990)。PCR反应剂及方法程序亦为商业化可得者。
因为肠病毒为RNA病毒，扩增方法的第一步为针对欲复制的区域制造DNA拷贝(cDNA)。反转录方法可以分开的方式进行，或以均质性反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)的方式进行，后者为用于扩增RNA之聚合酶链反应改良方法。适合将肠病毒核酸进行PCR扩增的方法见述于Romero及Rotbart之″Diagnostic Molecular BiologyPrinciples and Applications″pp.401-406，Persing等人编著(MayoFoundation，Rochester，MN 1993)；Rotbart等人U.S.专利No.5,075,212及Egger等人，J.Clin.Microbiol.331442-1447(1995)。
本发明提供新的寡核苷酸引物对以用于在检体中检测肠病毒存在与否。本发明之具体引物对包括第一引物及第二引物，其可用于经由核酸扩增试验(例如聚合酶链反应)快速诊断与肠病毒相关之疾病或症状。本发明之引物寻标至编码特定保守性区域之有义链或反义链。单一引物对或复数引物对之特定组合得到阵列式扩增产物，其可用于检测在检体中存在之肠病毒。在本发明优选的组合中，第一引物包含选自包括下列之群组之序列f1TTGTRCGCCTGTTTTA(SEQ ID NO1)，f2CAAGCACTTCTGTHHCCCCGG(SEQ ID NO2)，f3TACTTCGAGAARCCYAGTA(SEQ ID NO3)，f5AAGAGYCTATTGAGCTA(SEQ ID NO4)及f7GGI TGG TRS TGG AAR TTI CC(SEQ ID NO5)。
第二引物包含选自包括下列之群组之序列R1CACYGGATGGCCAATCCAA(SEQ ID NO6)，R2ATTGTCACCATAAGCAGCCA(SEQ ID NO7)，及R4AR RTT IAT CCA YTG RTG IGG(SEQ ID NO8)。
本发明引物之序列相关于如
图1所示在框中之习知肠病毒cDNA序列。设计这些引物时，对相关病毒cDNA序列进行碱基修正以增进引物退火之效率并扩大使用这些引物可检测之序列歧异范围。
包含本发明序列SEQ ID NOs5及8之引物相关于肠病毒基因体之编码区域。相关于肠病毒基因体之编码区域之引物系意欲涵盖包含与序列SEQ ID NOs5及8有关之简并性序列之引物。上列序列SEQ IDNOs5及8系根据该等序列所相关的密码子而以适当的三联体(triplet)方式示意性描绘。
在本发明中，更优选之组合包含一对或多对下列引物F1(SEQ ID NO1)/r1(SEQ ID NO6)；f2(SEQ ID NO2)/r1(SEQ ID NO6)；F3(SEQ ID NO3)/r1(SEQ ID NO6)；f5(SEQ ID NO4)/r1(SEQ ID NO6)；F1(SEQ ID NO1)/r2(SEQ ID NO7)；f2(SEQ ID NO2)/r2(SEQ ID NO7)；F3(SEQ ID NO3)/r2(SEQ ID NO7)；f5(SEQ ID NO4)/r2(SEQ ID NO7)；及F7(SEQ ID NO5)/r2(SEQ ID NO7)。
在本发明优选的方面，引物对f7(SEQ ID NO5)/r4(SEQ ID NO8)特别适用于扩增方法中侦侧肠病毒71型(EV71)及柯萨奇病毒A16型(Cox A16)。
根据
图1，熟习该项技术者可了解如何选择适合检测及/或扩增肠病毒基因体中所欲片段之至少一对本发明引物，并因此容易决定欲使用之本发明引物对。如
图1所示，当第一引物包含序列SEQ ID NO5或其简并性序列则第二引物应包含序列SEQ ID NO8或其简并性序列。
为了经由PCR去扩增在检体中之目标核酸序列，该序列必须能够与扩增系统中元件接触(accessible)。通常，此接触性经由将核酸自该检体中分离而予以确认。在相关技艺中已知相异之自生物性检体中抽取核酸之技术，特别是核糖核酸。或者，若该检体系相当易于破坏，则核酸经由PCR技术扩增前毋需纯化。亦即若该检体包括细胞(特别是外周血淋巴细胞或单核细胞)，细胞内成份之溶解及分散可经由将细胞悬浮于低张性溶液中而轻易达成。
每个PCR循环的第一步系有关将引物延长作用所得之核酸双链加以分离。当双链分离后，PCR中下一步系有关将已分离之核酸链与目标序列两侧之引物进行杂交(即退火)。该引物随后被延长而形成目标序列之互补性拷贝。为了成功的PCR扩增，考虑每个引物沿著双链序列进行杂交的位置来设计该引物，使得从一引物合成所得的延伸产物自模板分离后，作为另一引物之延伸作用的模板。变性，杂交，及延长之循环依需要重覆多次以获得扩增核酸之需要份量。
在PCR方法之优选实施方案中，链分离之达成系经由将反应物加热至充分高的温度达充分时间，造成双链之变性但不会造成聚合酶不可逆之变性。在PCR中引物对之模板依赖性延长作用系经由聚合性物质在适量之四种脱氧核糖核苷三磷酸(典型上为dATP，dGTP，dCTP及dTTP)存在下于包含合适盐类，金属离子及pH缓冲系统之培育液体内进行催化而成。合适的聚合性物质为已知可催化模板依赖性DNA合成之酶。在本发明中，引物延长作用之最初模板典型上为RNA。适于自RNA模板合成cDNA之反转录酶(RTs)为习知的。
PCR最通常以自动化方法使用热稳定酶进行。在此方法中，反应混合物的温度自动经由变性范围、引物退火范围及延长反应范围进行循环。
如上所述，本发明之优选实施方案并含RT-PCR扩增反应。然而，熟习该项技术者将认知到目标序列在检体中的扩增可用任何习知方法完成，如连接酶链反应(LCR)，Qβ-复制酶扩增，活体外转录，及子持性序列复制，以上皆可提供充份的扩增。
本发明方法所生产之被扩增片段(″扩增产物″)之大小典型上足以决定肠病毒之存在与否。因此，在本发明之一些实施方案中，在检体中所产出之被扩增片段之大小区分(例如凝胶电泳分析)可用于决定在检体中肠病毒之存在与否。此典型上经由将含有已知核酸之对照组以和用于扩增目标检体所用者相同的引物进行扩增。根据习知方法将被扩增的序列在琼脂糖凝胶上电泳并以溴化乙锭标示后，将检体及对照组之条带型态进行比较。检体结果与对照组比较出现之相异或额外的条带指出肠病毒之存在。
为了确定PCR扩增结果之正确性，可以在一扩增方法中使用一对以上的引物。在本发明之方法中，彼此不同的引物对可以同时或先后使用。在一个扩增方法中同时使用本发明一对以上引物之情形下，一对引物与另一对引物的不同可为第一个引物或第二个引物，或第一个引物或第二个引物皆有不同。在另一种情形，若在一扩增方法中连续使用本发明之两对引物，第二对引物能用于扩增之序列，相等于使用第一对引物在扩增方法中推想可获得之序列或在该可获得序列范围之内。根据
图1，实施者可以经由轻易决定同时使用或先后使用之一对以上的引物来进行本发明方法。
或者，本发明之扩增产物可使用对目标核酸具特异性之寡核苷酸探针进行检测。探针通常选自对单一目标序列具有特异性之肠病毒基因体区域。
序列特异性探针杂交反应为一种习知甚详之在检体中检测所欲核酸之方法。在充分严格之杂交反应条件下，探针仅与实质上互补性序列发生特异性杂交反应。杂交反应条件的严格性可以放宽以容忍不同程度之序列错配。被扩增产物之检测使用此序列特异性杂交反应以确定检测到正确之被扩增目标，藉此减少因来自其他生物或其他污染序列之相似性序列存在之故造成伪阳性的机会。
本发明令人惊异地发现一些核苷酸序列相关于肠病毒核酸之保守性区域。因此，本发明进而提供该等合成性核苷酸序列，其能够与肠病毒核酸之有义链或相关于该有义链之核酸(如使用该有义链作为模板之扩增反应之产物)进行特异性杂交反应。这些合成性核苷酸序列有利于在肠病毒杂交反应试验中作为探针。优选的是，该等合成性核苷酸序列系选自包括下列之群组p1TCCTCCGGCCCCTGAATGCGGCTAATC(SEQ ID NO9)，p2TGTCGTAACGSGCAASTCYGYRGCGGAACCGAC(SEQ ID NO10)，p3TACTTTGGGTGTCCGTGTTTCHTTTTAT(SEQ ID NO11)，71-2C TTA TAA GCA GAC TCA ACC CGG TGC TGA TG(SEQ ID NO12)，71-3TGG CAT TCC AAT ATC ACA ATT AAC AGT G(SEQ ID NO13)，16-1CTC GGC ACT ATC GCA GGA GGG ACC GGG AAT(SEQ ID NO14)及16-2C CTA CGC CAC TAC ACA GCC TGG TCA GGT TG
(SEQ ID NO15)。
本发明之合成性核苷酸序列相关于如
图1所示框中的习知肠病毒cDNA序列。本发明包含序列SEQ ID NOs12-15之核苷酸序列相关于肠病毒基因体之编码区域。相关于肠病毒基因体之编码区域之核苷酸序列系意欲涵盖包含与序列SEQ ID NOs12-15有关之简并性序列之核苷酸序列。上列序列SEQ ID NOs12-15系根据该等序列所相关的密码子而以适当的三联体方式示意性描绘。
根据
图1，熟习该项技术者可了解如何选择至少一本发明核苷酸序列，其在使用本发明引物之杂交反应试验中作为探针，并因此容易决定欲使用之本发明探针。如
图1所示，当包含序列SEQ ID NO8或其简并性序列之第二引物不用于扩增时，则该核苷酸序列应不包含任何序列SEQ ID Nos12-15或其简并性序列。进而，当包含序列SEQID NO5或其简并性序列之第一引物不用于扩增时，则该核苷酸序列应不包含任何序列SEQ ID Nos9-11或其简并性序列。
相关技艺中已对一些杂交反应模式习知甚详，这些杂交反应模式包括但不限于溶液相，固体相，混合相或原位杂交反应试验。在溶液(或液体)相杂交反应中，目标核酸与探针或引物之间自由在反应混合物中进行交互反应。在固体相杂交反应试验中，将目标或探针连接于固体支持物上，而处于能够在溶液中与互补性核酸进行。示范性固体相模式包含Southern杂交反应，斑点法及类似方法。杂交反应之检测可于固体支持物上进行，如微滴板，滤膜(如硝基纤维)或微球体(小珠)或一晶片及任何可行的杂交反应缓冲液系统。
杂交反应复合物之检测系根据习知甚详之技术进行检测，且此习知检测并非本发明之重要部份。能够特异性与一目标进行杂交之核酸探针之标记(labeling)可用任何一种典型上用于检测被杂交之核酸存在之方法进行。
常见检测的方法系使用放射自显影，其使用以3H，125I，35S，14C，32P或类似物进行标记之探针。放射活性同位素之选择依研究的偏好而定，而这种偏好又视合成的容易程度而定。杂交反应之检测可于固体支持物上进行，如微滴板，滤膜(如硝基纤维)或微球体(小珠)或一晶片及任何可行的杂交反应缓冲液系统。
其他的标记包含配体(ligand)，其系与以荧光团(fluorophore)，化学发光剂或酶标记之抗配体(antiligand)或抗体结合。或者，探针可直接与如荧光团，化学发光剂或酶之标记进行缀合结合。标记方式的选择取决于所需之灵敏度，与探针缀合结合之容易性，安定性需求及可用的仪器而定。
本发明探针及引物可使用传统习知方法进行合成及标记。作为探针及引物之寡核苷酸可根据Beaucage，S.L.及Caruthers，M.H.(1981，Tetrahedron Letts.，22(20)1859-1862)首先描述之固体相亚胺基磷酸酯三酯方法使用自动化合成仪进行化学合成，如Needham-VanDevanter，D.R.等人在1984，Nucleic Acid Res.，126159-6168中所述。寡核苷酸之纯化或可经由天然丙烯酰胺凝胶电泳法或经由阴离子-交换树脂HPLC进行，如Pearson，J.D.及Regnier，F.E.在1983，J.Chrom.，255137-149中所述者。
上述引物及试验系用于检测检体中的肠病毒，诊断肠病毒相关疾病及症状及确定特定症状或症状组合与特定肠病毒存在之间的关联性(或切断此种关联)。诊断上的应用可用病史及受试个体的特征加以补充及确认。经由本发明方法诊断之肠病毒疾病，症候群及症状包含所有在本文及科学文献中已报告与肠病毒相关之疾病，症候群及症状，特别包含无菌性脑膜炎，肠病毒糖尿病，肠病毒结膜炎，急性软弱性麻庳，急性良性心包炎，发疹，内皮疹，扩张性心肌病变，口足病，慢性疲惫症状，热病及上呼吸道感染。肠病毒感染及其与症候群的关联性之检测使得发展疫苗及治疗方法成为可能。
本发明亦提供试剂盒，其为多容器单位而包括用于实施本发明方法之成份。有利的试剂盒可包括用于检测意欲目标核酸之探针。在一些情况下，该探针可固著于合适的支持膜上。该试剂盒将亦可包含本发明所提供之引物。该试剂盒中其他选择性成份包含，例如，反转录酶或聚合酶，基质核苷三磷酸，用于标记的物质(例如，当标记物为生物素时，含抗生物素蛋白(avidin)-酶缀合物及酶底物及发色原)及用于反转录，PCR，或杂交反应之合适缓冲液。除了上述成份以外，该试剂盒亦可包含进行本发明方法之指示。
在本发明说明中所引述之文献均以参考资料的方式并入本案。
本发明其他的特征及优点将可明显见于下列优选实施方案及权利要求书。
下列实施例用于示范说明本发明。这些实施例不以任何方式意欲限制本发明之范围，但用于指示如何实施本发明的材料及方法。
实施例1肠病毒之检测1.1.病毒所使用的59个肠病毒样本(见表1)或自临床收集之检体中分离或得自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。肠病毒经由中和试验使用汇合之免疫血清加以鉴定，接著以单型中和性多克隆抗体确认其血清型。如结果所示，59个样本包括不同的肠病毒血清型(见表1)。病毒于MRC5单层细胞培养物中繁殖。
1.2.抽取RNA病毒RNA系经由将总核酸自经感染单层细胞培养物之离心沉淀物分离而得。约4-6×106个细胞(每毫升)于溶解缓冲液(50mMNaCl，20mM Tris HCl(pH 7.5)，50 mM EDTA，1％十二烷基硫酸钠)中溶解，以酚-氯仿萃取三次并以氯仿萃取一次，且随后自2.5M含乙醇之乙酸铵中沉淀。将核酸离心沉淀物以75％乙醇清洗，进行乾燥并悬浮于100微升之无菌蒸馏水中。RNA制备物被贮于-80℃。
1.3.PCR扩增试验扩增试验之第一步为合成将被扩增之肠病毒RNA基因体部分之DNA拷贝(cDNA)(即反转录步骤)。经由聚合酶链反应进行之反转录作用于20μl之反应混合物(1μl之总RNA，20 mM Tris-HCl(pH8.4)，50mM KCl，5mM MgCl2，10mM DTT，各为0.5mM之dATP，dCTP，dGTP及dTTP，以及50纳克之随意六元体)中进行。将检体培育于65℃5分钟，随后置于冰上1分钟。加入50单位之反转录酶并将该混合物于42℃培育50分钟。该反应藉由在70℃培育15分钟而终止。所得的cDNA产物被贮于-20℃。
经由PCR之DNA扩增作用于25μl反应混合物[12μl之cDNA，20mM Tris-HCl(pH8.0)，0.1mM EDTA，1mM DTT，1.0％triton X-100，50％甘油，1.5mM MgCl2，各150μM之dATP，dCTP，dGTP及dTTP，各10pmol之各具体引物及2.5 U之Taq DNA聚合酶]中进行。在扩增反应中所使用的引物对为包含下列序列之引物f1(SEQ ID NO1)/r1(SEQ ID NO6)，f2(SEQ ID NO2)/r1(SEQ ID NO6)，f3(SEQ ID NO3)/r1(SEQ ID NO6)；f5(SEQ ID NO4)/r1(SEQ ID NO6)，f1(SEQ ID NO1)/r2(SEQ ID NO7)，f2(SEQ ID NO2)/r2(SEQ ID NO7)，f3(SEQ ID NO3)/r2(SEQ ID NO7)及f5(SEQ ID NO4)/r2(SEQ ID NO7)。
引物r1及r2以生物素在5′端标记供后续检测步骤使用。每个扩增反应进行40个温度循环(于94℃变性4分钟，于55℃进行引物对退火1分钟，及于72℃延长1分钟)。
1.4.DNA产物之分离将PCR产物之少量(每个10μl)于1.5％琼脂糖凝胶于0.5×TBE缓冲液(0.045M Tris-硼酸盐，0.001M EDTA)中于100伏特下进行电泳30分钟。电泳后，将凝胶染以溴化乙锭并于UV光源下观察。所有病毒样本使用本发明引物之扩增反应于UV光源下观察皆显示阳性结果。使用引物对f5/r1针对59个病毒样本进行之PCR扩增数据示于表1。表1
以不同引物之组合，利用聚合酶链反应扩增肠病毒71型核酸之电泳分析图示于图2。a至h行各使用之引物对为af1/r1，bf2/r1，cf3/r1，df5/r1，ef1/r2，f:f2/r2，gf3/r1，hf5/r2。m为核酸大小标记，1至5分别为1∶600bp，2∶500bp，3∶400bp，4∶300bp，5∶200bp。
上述结果证明本发明引物，可广泛用于检测肠病毒之核酸存在与否，藉此诊断肠病毒之存在与否。
1.5.杂交反应分析将三个肠病毒特异性探针(p1，p2及p3)用于检测经扩增之DNA片段，其分别包含序列SEQ ID NO9，SEQ ID NO10及SEQ IDNO11。
将探针进行加热以变性(95℃，5分钟)并快速于冰上骤冷2分钟，接著将这些探针(每个10μM)固著于尼龙膜(来自BoehringerManngeim)上。三个探针(每个1μl)被施用及曝露于紫外线幅射(254nm，0.15J/cm2)之下。
将生物素标记之PCR产物(每个8μl)在95℃加热5分钟进行变性并于冰上骤冷2分钟，并加入杂交反应溶液[5x标准柠檬酸盐(SSC)，0.1％(w/v)N-月桂酰基肉豆蔻酸，0.1％(w/v)十二烷基硫酸钠(SDS)，1x封闭缓冲液(来自Boehringer Manngeim，20ml/100cm2)]中。含有PCR产物之杂交反应溶液随后与尼龙膜及经标记之探针共同培育。于50℃培育1小时以后，将该等膜于室温使用清洗缓冲液(2×SSC及0.1％SDS)清洗五次，随后加入链亲和素碱性磷酸(2μl/20ml 1×封闭缓冲液)。将膜置于室温下30分钟并于室温下以顺丁烯二酸缓冲液(0.1M顺丁烯二酸，0.15M NaCl，pH7.5)清洗五次。将膜于检测缓冲液(0.1M Tris-HCl；0.1M NaCl；50mM MgCl2，pH9.5)中平衡5分钟并与新鲜制备之颜色-基质溶液(45μl NBT溶液混合35μl X-磷酸溶液)，并用检测缓冲液加到10毫升)在黑暗中培育10分钟。最后将膜以1×TE缓冲液清洗以终止反应并于室温下晾干。将杂交反应信号进行检测及记录。结果示于表2。表2
肠病毒71型及柯萨奇病毒A16型之核酸经聚合酶链反应扩增后与肠病毒共通型探针(p1，p2，p3)杂交之结果示于图3。聚合酶链反应使用之引物配对为f5／r1，固定在尼龙膜探针之分部位置如下最上面一列及最下面一列为杂交对照组，使用之探针为猪流产及呼吸综合症病毒(Dorcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)ORF 7的一段核酸序列，由于杂交液中含有与此探针互补之核酸序列，故杂交反应顺利完成时，此两列会有信号产生。左边第一排之第2至4点探针p1，中间排之第2至4点探针p2，右边第一排之第2至4点探针p3。1及2肠病毒71型与柯萨奇病毒A16型于杂交对照点及肠病毒共通型探针位置均有信号。3为不含核酸之对照组，仅于杂交对照探针有信号。
实施例2检测及鉴别肠病毒71型(EV71)与柯萨奇病毒A16型(CoxA16)2.1.PCR扩增试验RNA抽取及反转录步骤在实例1中所述之相同条件下进行。在此试验中所使用的PCR引物为包含序列f7(SEQ ID NO5)/r4(SEQ IDNO8)之引物对。
PCR反应混合物及温度循环条件如实例1中所述加以调整。
2.2.杂交反应试验用于检测EV71之探针为含有序列SEQ ID NO12(71-2)及SEQ IDNO13(71-3)之探针。用于检测Cox A16之探针为含有序列SEQ IDNO14(16-1)及SEQ ID NO15(16-2)之探针。杂交反应试验如实例1中所述条件进行。
结果显示使用引物对f7/r4及探针71-2与71-3之本发明方法能特异性检测及鉴别EV71及非-EV71肠病毒。结果显示使用引物对f7/r4及探针16-1与16-2之本发明方法能特异性检测及鉴别Cox A16及非-Cox A16肠病毒。
实施例3检测及鉴别EV71，Cox A16，非-EV71肠病毒及非-CoxA16肠病毒之试剂盒使用本发明之试剂盒同时对EV71及Cox A16进行检测。该试剂盒提供材料及步骤程序使得实施者能够进行多重PCR试验。病毒RNA抽取及反转录步骤在实施例1中所述之相同条件下进行。多重PCR于25μl反应混合物(每单位含有12μl之cDNA，50mM Tris-HCl(pH8.3)，70mM KCl，2.5mM MgCl2，各为200μM之dATP，dCTP，dGTP及dTTP，10pmol之引物f5/r1，20pmol之引物f7/r4及3U之Taq DNA聚合酶)中进行。每个扩增反应进行40个温度循环(于94℃变性4分钟，于55℃进行引物对退火1分钟，及于72℃延长1分钟)。经该多重PCR扩增后，所得之PCR产物与固著探针之膜(p1，p2及p3针对肠病毒，71-2及71-3专一针对EV71，且16-1及16-2专一针对Cox A16)共同培育。杂交反应试验的所有条件均与实例1中所述者相同。结果显示该试剂盒(提供包括多重PCR及多重杂交反应检测之系统)可检测及鉴别EV71，Cox A16，非-EV71肠病毒及非-Cox A16肠病毒。使用本发明不同探针之杂交反应试验数据示于表3。表3
肠病毒71型，柯萨奇病毒A16型及ECHO病毒第3型之核酸分别经多重聚合酶链反应(multiplex PCR)扩增后，与肠病毒共通型探针(p1，p2，p3)及肠病毒71型，柯萨奇病毒A16型特异性探针(71-2，71-3，16-1及16-2)杂交之结果示于图4。聚合酶链反应使用之引物配对为f5/r1及f7/r4，固定在尼龙膜探针之分部位置如下此为6×6点分部的探针点阵，以十字将此6×6点阵等分为4个3×3的等分，其中左上方区块属肠病毒共通型探针区块，每一排各为3个探针之3重复，右上区块为肠病毒71型区，由两个特异性探针交错排列，左下区块为柯萨奇病毒A16型区，由两个特异性探针交错排列。1共通型与肠病毒71型探针位置均有信号；2共通型与柯萨奇病毒A16型探针位置均有信号；3只有共通型区域探针有信号。
根据本发明可作之不同修正及变化对于熟习该项技术者而言均显然不会偏离本发明的范围与精神。虽然本发明已叙述特定的偏好实施方案，必须了解的是本发明不应被不当地限制于该等特定实施方案上。事实上，在实施本发明之已述模式方面，对于熟习该项技术者而言显而易知之不同修正亦被涵盖于下列申请专利范围之内。
权利要求
1.一用于在检体中检测肠病毒存在与否之寡核苷酸引物对，其中该对引物中第一引物包含下列任一序列SEQ ID NO1TTGTRCGCCTGTTTTA，SEQ ID NO2CAAGCACTTCTGTHHCCCCGG，SEQ ID NO3TACTTCGAGAARCCYAGTA，SEQ ID NO4AAGAGYCTATTGAGCTA，或SEQ ID NO5GGITGGTRSTGGAARTTICC，或SEQ ID No5之简并性序列；且该对引物中第二引物包含下列任一序列SEQ ID NO6CACYGGATGGCCAATCCAA，SEQ ID NO7ATTGTCACCATAAGCAGCCA，或SEQ ID NO8ARRTTIATCCAYTGRTGIGG，或SEQ ID No8之简并性序列，其条件为，当第一引物包含序列SEQ ID NO5或其简并性序列，则第二引物包含序列SEQ ID NO8或其简并性序列。
2.根据权利要求1之引物对，其包含选自包括下列之群组之序列SEQ ID NO1/SEQ ID NO6；SEQ ID NO2/SEQ ID NO6；SEQ IDNO3/SEQ ID NO6；SEQ ID NO4/SEQ ID NO6；SEQ ID NO1/SEQ IDNO7；SEQ ID NO2/SEQ ID NO7；SEQ ID NO3/SEQ ID NO7；SEQ IDNO4/SEQ ID NO7；及SEQ ID NO5/SEQ ID NO8。
3.根据权利要求1之引物对，其为SEQ ID NO5/SEQ ID NO8。
4.根据权利要求3之引物对，其用于检测肠病毒71型(EV71)或柯萨奇病毒A16(Cox A16)。
5.一合成性核苷酸序列，其包含任一选自下列群组之序列SEQ ID NO9TCCTCCGGCCCCTGAATGCGGCTAATC，SEQ ID NO10TGTCGTAACGSGCAASTCYGYRGCGGAACCGAC，SEQ ID NO11TACTTTGGGTGTCCGTGTTTCHTTTTAT，SEQ ID NO12CTTATAAGCAGACTCAACCCGGTGCTGATG，SEQ ID NO13TGGCATTCCAATATCACAATTAACAGTG，SEQ ID NO14CTCGGCACTATCGCAGGAGGGACCGGGAAT及SEQ ID NO15CCTACGCCACTACACAGCCTGGTCAGGTTG，及SEQ ID NO12-15中任一之简并性序列，其能够与肠病毒核酸之有义链或相关于该有义链之核酸进行特异性杂交。
6.一种检测肠病毒核酸在检体中存在与否的方法，其包含下列步骤(a)在一扩增方法中将该检体与根据权利要求1之寡核苷酸引物对接触；及(b)经由检测扩增产物之存在与否而决定肠病毒之存在与否。
7.根据权利要求6之方法，其中在步骤(a)，该检体于一扩增方法中同时与第二对根据权利要求1之寡核苷酸引物接触，且该第二对引物相异于第一对引物。
8.根据权利要求7之方法，其中在第二对引物中的第一引物相异于第一对引物中的第一引物。
9.根据权利要求7之方法，其中在第二对引物中的第二引物相异于第一对引物中的第二引物。
10.根据权利要求7之方法，其中第二对引物中的两个引物相异于第一对引物中的两个引物。
11.根据权利要求7之方法，其中在步骤(a)，该检体于一扩增方法中同时与第三对根据权利要求1之寡核苷酸引物接触，且该第三对引物相异于第一对及第二对引物。
12.根据权利要求6之方法，其进而包含将步骤(a)之产物于一扩增方法中同时与第二对根据权利要求1之寡核苷酸引物接触，其中第二对引物能用于扩增之序列，相等于使用第一对引物在扩增方法中可获得之序列或在该可获得序列范围之内。
13.根据权利要求6之方法，其中将被检测到的扩增产物进一步与至少一根据权利要求5之合成性核苷酸序列进行特异性杂交反应，其条件为，当包含序列SEQ ID NO8或其简并性序列之第二引物不用于扩增时，则该核苷酸序列应不包含任何序列SEQ ID NO12-15或其简并性序列；当包含序列SEQ ID NO5或其简并性序列之第一引物不用于扩增时，则该核苷酸序列应不包含任何序列SEQ IDNO9-11或其简并性序列。
14.根据权利要求13之方法，其中杂交反应系于高度严格条件下进行。
15.一种检测及鉴别检体中肠病毒71型的方法，其包含(a)在一扩增方法中将该检体与根据权利要求1之寡核苷酸引物对接触，条件为第二引物系包含序列SEQ ID NO8或其简并性序列；(b)经由检测扩增产物之存在与否而决定肠病毒71型之存在与否；及(c)将所检测到的扩增产物与至少一个包含序列SEQ ID NO12或SEQ ID NO13之合成性核苷酸序列进行特异性杂交反应。
16.根据权利要求15之方法，其中，在步骤(c)中，扩增产物系与分别包含序列SEQ ID NO12及SEQ ID NO13之合成性核苷酸序列进行特异性杂交反应。
17.一种检测及鉴别检体中柯萨奇病毒A16型的方法，其包含(a)在一扩增方法中将该检体与根据权利要求1之寡核苷酸引物对接触，条件为第二引物系包含序列SEQ ID NO8或其简并性序列；(b)经由检测扩增产物之存在与否而决定柯萨奇病毒A16型之存在与否；及(c)将所检测到的扩增产物与至少一个包含序列SEQ ID NO14或SEQ ID NO15之合成性核苷酸序列进行特异性杂交反应。
18.根据权利要求17之方法，其中，在步骤(c)中，扩增产物系与分别包含序列SEQ ID NO14及SEQ ID NO15之合成性核苷酸序列进行特异性杂交反应。
19.一种检测及鉴别检体中肠病毒71型及/或柯萨奇病毒A16型的方法，其包含(a)在一扩增方法中将该检体与根据权利要求1之寡核苷酸引物对接触，条件为第二引物系包含序列SEQ ID NO8或其简并性序列；(b)经由检测扩增产物之存在与否而决定肠病毒71型及/或柯萨奇病毒A16型之存在与否；及(c)将所检测到的扩增产物与至少一个包含序列SEQ ID NO12或SEQ ID NO13之合成性核苷酸序列以及至少一个包含序列SEQ IDNO14或SEQ ID NO15之合成性核苷酸序列进行特异性杂交反应。
20.根据权利要求19之方法，其中，在步骤(c)中，扩增产物系与分别包含序列SEQ ID NO12，SEQ ID NO13，SEQ ID NO14及SEQID NO15之合成性核苷酸序列进行特异性杂交反应。
21.一种在检体中检测肠病毒之试剂盒，其包含至少一对根据权利要求1之寡核苷酸引物，其条件为，当第一引物包含序列SEQ IDNO5或其简并性序列时，则第二引物包含序列SEQ ID NO8或其简并性序列。
22.根据权利要求21之试剂盒，其包含多于一对根据权利要求1之寡核苷酸引物。
23.根据权利要求21之试剂盒，其包含至少一根据权利要求5之合成性核苷酸序列，其条件为，当包含序列SEQ ID NO8或其简并性序列之第二引物不用于扩增时，则该核苷酸序列应不包含任何序列SEQ ID NO12-15或其简并性序列；当包含序列SEQ ID NO5或其简并性序列之第一引物不用于扩增时，则该核苷酸序列应不包含任何序列SEQ IDNO9-11或其简并性序列。
24.一种检测及鉴别检体中肠病毒71型的试剂盒，其包含至少一对根据权利要求1之寡核苷酸引物，条件为第二引物系包含序列SEQ ID NO8或其简并性序列；及至少一个包含序列SEQ ID NO12或SEQ ID NO13之合成性核苷酸序列。
25.一种检测及鉴别检体中柯萨奇病毒A16型的试剂盒，其包含至少一对根据权利要求1之寡核苷酸引物，条件为第二引物系包含序列SEQ ID NO8或其简并性序列；及至少一个包含序列SEQ ID NO14或SEQ ID NO15之合成性核苷酸序列。
26.一种检测及鉴别检体中肠病毒71型及/或柯萨奇病毒A16型的方法，其包含至少一对根据权利要求1之寡核苷酸引物，条件为第二引物系包含序列SEQ ID NO8或其简并性序列；至少一个包含序列SEQ ID NO12或SEQ ID NO13之合成性核苷酸序列以及至少一个包含序列SEQ ID NO14或SEQ ID NO15之合成性核苷酸序列。
全文摘要
本发明揭示了核苷酸引物对在检测检体中肠病毒之存在与否中的应用。本发明亦揭示能够与肠病毒核酸之有义链或相关于该有义链之核酸进行特异性杂交反应之合成性核苷酸序列。本发明提供了检测肠病毒核酸在检体中存在与否的方法以及在检体中检测肠病毒之试剂盒。本发明特别提供检测及鉴别检体中肠病毒71型及/或柯萨奇病毒A16型的方法及试剂盒。
文档编号C12Q1/68GK1366066SQ0110062
公开日2002年8月28日 申请日期2001年1月15日 优先权日2001年1月15日
发明者李泔泓, 白启宏, 曾杨源, 王意雯, 王献煌 申请人:晶宇生物科技实业股份有限公司