专利名称：编码乙酰乳酸合酶基因的基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及编码乙酰乳酸合酶的基因，乙酰乳酸合酶是支链氨基酸生物合成途径中的一种限速酶。
背景技术：
乙酰乳酸合酶(下文称为“ALS”)是支链氨基酸例如亮氨酸、缬氨酸和异亮氨酸生物合成途径中的一种限速酶，被认为是植物生长的必需酶。另外，已知ALS存在于各种各样的高等植物中。另外，ALS存在于各种微生物例如酶母(酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、大肠杆菌(Escherichia coli)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurlum)中。
已知在大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌中存在三种类型的ALS同工酶。这些同工酶中的每种是一种由控制酶催化活性的大分子量催化亚基和通过结合支链氨基酸而作为调节蛋白起作用的小分子量调节亚基构成的异寡聚体(Chipman等，Biochim.Biophys.Acta.1385，401-419，1998)。催化亚基分别位于Ilv IH、Ilv GM和Ilv BN操纵子上。另一方面，酵母ALS是单酶，包含一个催化亚基和一个调节亚基，在细菌中的情况也是如此(Pang等，Biochemistry，38，5222-5231)。所述催化蛋白亚基位于基因座ILV2上。
在植物中，已知ALS包含催化亚基和调节亚基，在上述微生物中的情况也是如此(Hershey等，Plant Molecular Biology，40，795-806，1999)。例如，烟草(双子叶植物)中ALS的催化亚基由两个基因座-SuRA和SuRB编码(Lee等，EMBO J.7，1241-1248，1988)；玉米中ALS的催化亚基由两个基因座-als1和als2编码(Burr等，Trendsin Genetics7，55-61，1991；Lawrence等，Plant Mol.Biol.18，1185-1187，1992)。已完全测定了双子叶植物包括烟草、拟南芥属(Arabidopsis)、油菜、棉花、苍耳属(Xanthium)、苋属(Amaranthus)和地肤(Kochia)的编码催化亚基的基因的核苷酸序列(参见Chipman等，Biochim.Biophys.Acta.1385，401-419，1998和专利申请WO97/08327的PCT国际出版物的国内再版)。然而，玉米是其核苷酸序列已被完全确定的唯一单子叶植物。
已知除草剂例如磺脲除草剂、咪唑啉酮除草剂、三唑并嘧啶除草剂和嘧啶基羧基除草剂(下文称为“PC”除草剂)通过抑制ALS而抑制植物生长(Ray，Plant Physiol.75，827-831，1984；Shaner等，Plant Physiol.76，545-546，1984；Subramanian等，Plant Physiol.96，310-313，1991；Shimizu等，J.Pestic.Sci.19，59-67，1994)。
已知对这些除草剂具有抗性的植物含有一种编码ALS的基因，该基因包括在不同物种中保守的区域内诱导一个或两个氨基酸取代的一个或两个核苷酸取代。这种基因的实例包括编码对磺脲除草剂具有特异性抗性的ALS的基因(参见Kathleen等，EMBO J.7，1241-1248，1988；Mourad等，Planta，188，491-497，1992；Guttieri等，Weed Sci.43，175-178，1995；Bernasconi等，J.Biol.Chem.270，17381-17385，1995和日本专利申请特开昭63-71184号)；编码对咪唑啉酮除草剂具有特异性抗性的ALS的基因(Mourad等，Planta，188，491-497，1992；Lee等，FEBS Lett.452，341-345，1999和日本专利申请特开平5-227964号)；和编码对磺脲除草剂和咪唑啉酮除草剂两者均具有抗性的ALS的基因(参见Kathleen等，EMBO J.7，1241-1248，1988；Bemasconi等，J.Biol.Chem.270，17381-17385，1995；Hattori等，Mol.Gen.Genet.246，419-425，1995；Alison等，Plant Physiol.111，1353，1996；Rajasekarau等，Plant Sci.119，115-124，1996，日本专利申请特开昭63-71184号，日本专利申请特开平4-311392号和Bemasconi等，美国专利5633437，1997)。还已知显示抗磺脲除草剂和咪唑啉酮除草剂两者的ALS，显示对PC除草剂和三唑并嘧啶除草剂有交叉抗性(Bernasconi等，J.Biol.Chem.270，17381-17385，1995)。此外，已经尝试通过将具有显示特异性地抗磺脲除草剂的ALS的植物与具有显示特异性地抗咪唑啉酮除草剂的ALS的植物杂交，产生显示抗磺脲除草剂和咪唑啉酮除草剂两者的植物体(Mourad等，Mol.Gen.Genet，243，178-184，1994)。而且，已经尝试将编码ALS的基因人工改变成除草剂抗性基因(Ott等，J.Mol.Biol.263，359-368，1996，日本专利申请特开昭63-71184号，日本专利申请特开平5-227964号，日本专利申请特表平11-504213号)，致使已经发现单个氨基酸缺失可使ALS显示既抗磺脲除草剂又抗咪唑啉酮除草剂(日本专利申请特开平5-227964号)。
如上所述，对具有除草剂抗性的ALS和编码ALS的基因已经进行了积极的研究。然而，针对抗PC除草剂抗性和涉及对PC除草剂具有特异性抗性的突变型ALS基因尚未见报道。
发明概述本发明的目的是提供编码对PC除草剂显示极高抗性的ALS蛋白的基因、由所述基因编码的ALS蛋白、具有所述基因的重组载体、具有所述重组载体的转化体、具有所述基因的植物、培育所述植物的方法以及使用所述基因作为选择标记来选择转化细胞的方法。
作为进行透彻的研究以达到上述目的的结果，我们发现用某种氨基酸取代野生型ALS的某个氨基酸残基而从所述野生型ALS获得的突变型ALS对PC除草剂显示极高的抗性，从而完成了本发明。
(1)本发明是一种编码以下蛋白质(a)或(b)的基因(a)一种包含SEQ ID NO1的氨基酸序列的蛋白质；(b)一种包含从SEQ ID NO1的氨基酸序列由于取代、缺失或添加至少一个或多个氨基酸而获得的氨基酸序列的蛋白质，该蛋白质具有对嘧啶基羧基除草剂的抗性以及具有乙酰乳酸合酶活性。
(2)此外，本发明是一种由(1)的基因编码的乙酰乳酸合酶蛋白。
(3)此外，本发明是一种具有(1)的基因的重组载体。
(4)此外，本发明是一种具有(3)的重组载体的转化体。
(5)此外，本发明是一种具有(1)的基因并且对嘧啶基羧基除草剂具有抗性的植物。
(6)本发明是一种培育(5)的植物的方法，所述方法包括在嘧啶基羧基除草剂存在下培育所述植物。
(7)本发明是一种使用(1)的基因作为选择标记来选择具有该基因的转化细胞的方法。
附图简述
图1显示突变型ALS蛋白的氨基酸序列和野生型ALS蛋白的氨基酸序列之间的比较。
图2显示突变型ALS基因的核苷酸序列和野生型ALS基因的核苷酸序列之间的比较。
图3是显示抗性突变体对双草醚(bispyribac-sodium)敏感性的特征图。
图4是显示野生型对双草醚敏感性的特征图。
图5是显示野生型对氯磺隆(chlorsulfuron)敏感性的特征图。
图6是显示抗性突变体对氯磺隆敏感性的特征图。
图7是显示从野生型提取的粗制ALS蛋白的阴离子交换色谱的特征图。
图8是显示野生型ALS蛋白和突变蛋白对双草醚敏感性的特征图。
图9是显示野生型ALS蛋白和突变蛋白对氯磺隆敏感性的特征图。
图10是显示野生型ALS蛋白和突变蛋白对咪唑喹啉酸(imazaquin)敏感性的特征图。
图11显示水稻(Nippon-bare)EST和玉米ALS基因之间核苷酸序列的比较。
图12是显示实施例4中获得的粗制ALS对双草醚所观察到的敏感性的特征图。
图13是显示实施例4中获得的粗制ALS对氯磺隆所观察到的敏感性的特征图。
图14是显示实施例4中获得的粗制ALS对嘧草硫醚(pyrithiobac-sodium)所观察到的敏感性的特征图。
图15是显示实施例4中获得的粗制ALS对pyriminobac所观察到的敏感性的特征图。
图16是显示实施例4中获得的粗制ALS对苄嘧磺隆(bensulfuron-methyl)所观察到的敏感性的特征图。
图17是显示实施例4中获得的粗制ALS对乙基吡磺隆(pyrazosulfuron-ethyl)所观察到的敏感性的特征图。
图18是显示实施例4中获得的粗制ALS对唑吡嘧磺隆(imazosulfuron)所观察到的敏感性的特征图。
图19是显示实施例4中获得的粗制ALS对咪唑喹啉酸所观察到的敏感性的特征图。
图20是显示实施例4中获得的粗制ALS对咪唑烟酸(imazapyr)所观察到的敏感性的特征图。
图21是显示实施例4中获得的粗制野生型ALS、纯化野生型GST-ALS和野生型无GST ALS对双草醚所观察到的敏感性的特征图。
图22是显示实施例4中获得的粗制突变型ALS和纯化突变型GST-ALS对双草醚所观察到的敏感性的特征图。
图23是显示实施例4中获得的粗制突变型ALS和纯化突变型GST-ALS对氯磺隆所观察到的敏感性的特征图。
图24是显示实施例4中获得的粗制突变型ALS和纯化突变型GST-ALS对咪唑喹啉酸所观察到的敏感性的特征图。
图25显示产生仅具有W548L突变的ALS基因的构思。
图26是图25的续图，显示产生仅具有W548L突变的ALS基因的构思。
图27是显示实施例6(2)中获得的粗制ALS对双草醚所观察到的敏感性的特征图。
图28是显示实施例6(2)中获得的粗制ALS对氯磺隆所观察到的敏感性的特征图。
图29是显示实施例6(2)中获得的粗制ALS对咪唑喹啉酸所观察到的敏感性的特征图。
图30显示构建实施例7中构建的双元载体的构思。
图31是一张电泳照片，藉此证实在从大肠杆菌(E.coli)(JM109)的单个菌落中分离的质粒中有所述ALS基因插入片段，其中第1泳道表λHind III/100bp DNA标记，第2泳道表示来源于已经用保留突变型ALS基因的pMLH7133转化的大肠杆菌的质粒，第3泳道表示来源于已经用保留野生型ALS基因的pMLH7133转化的大肠杆菌的质粒，第4泳道表示保留GUS基因的pMLH7133(对照组)，箭头指示插入DNA。
图32是一张电泳照片，显示用质粒DNA作为模板的PCR结果，其中第1泳道表示λHindIII/100bp DNA标记，第2泳道和第5泳道表示保留野生型ALS基因的pBI 121质粒(对照组)，第3泳道和第6泳道表示被认为保留突变型ALS基因的pMLH7133，第4泳道和第7泳道表示被认为保留野生型ALS基因的pMLH7133，箭头指示PCR产物。
图33是一张电泳照片，显示证明ALS基因插入方向的结果，其中第1泳道表示λHindIII/100bp DNA标记，第2泳道表示保留突变型ALS基因的pMLH7133，第3泳道表示保留野生型ALS基因的pMLH7133，第4泳道表示保留GUS基因的pMLH7133(对照组)，箭头指示PCR产物。
图34是一幅流程图，说明用土壤杆菌(Agrobacterium)转化水稻植株(Nippon-bare)的方法。
图35是一张照片，显示由愈伤组织正进行再分化的水稻植株(Nippon-bare)。
图36是显示用突变型ALS基因转化的水稻植株(Nippon-bare)愈伤组织的双草醚敏感性的特征图。
图37是显示野生型水稻植株(Nippon-bare)愈伤组织的双草醚敏感性的特征图。
图38是一张电泳照片，显示使用从转化愈伤组织制备的基因组DNA进行的PCR结果，其中第1泳道表示λHindIII/100bp DNA标记，第2-7泳道表示使用来源于不同愈伤组织的基因组DNA的相应PCR结果，箭头指示PCR产物。
图39是显示使用从转化愈伤组织制备的基因组DNA作为模板通过PCR产生的PCR产物测序结果的特征图，其中A表示使用有义引物(3-1-4)对氨基酸残基548周围进行分析的结果，B表示使用反义引物(ALS-Rsp2)对氨基酸残基548周围进行分析的结果，C表示使用有义引物(3-1-4)对氨基酸残基627周围进行分析的结果，D表示使用反义引物(ALS-Rsp2)对氨基酸残基627周围进行分析的结果。
图40是一张照片，显示用突变型ALS基因转化的水稻植株(Nippon-bare)的双草醚敏感性的测量结果，其中A表示用突变型ALS基因转化的水稻植株，而B表示用野生型ALS基因转化的水稻植株。
发明详述将给出对本发明更加详细的解释。
本发明的乙酰乳酸合酶蛋白(下文称为“突变型ALS蛋白”)可以通过使在水稻植株中表达的野生型ALS蛋白中的某个位点发生突变而获得。本发明突变型ALS蛋白的氨基酸序列以SEQ ID NO1表示。编码本发明ALS蛋白的基因的核苷酸序列以SEQ ID NO2表示。
所述突变型ALS蛋白通过色氨酸548被亮氨酸取代、丝氨酸627被异亮氨酸取代而从野生型ALS蛋白衍生。图1显示突变型ALS蛋白的氨基酸序列和野生型ALS蛋白的氨基酸序列的比较结果。在图1中，第1行的氨基酸序列表示突变型ALS蛋白，而第2行的氨基酸序列表示野生型ALS蛋白。
与编码野生型ALS蛋白的基因相比，编码突变型ALS蛋白的基因(SEQ ID NO2)含有取代，即编码色氨酸548的密码子被编码亮氨酸的密码子取代以及编码丝氨酸627的密码子被编码异亮氨酸的密码子取代。图2显示编码突变型ALS蛋白的基因的核苷酸序列和编码野生型ALS蛋白的基因的核苷酸序列的比较结果。在图2中，第1行的核苷酸序列表示突变型ALS蛋白，而第2行的核苷酸序列表示野生型ALS蛋白。
可以通过将如上所述的突变引入在日本型水稻变种Kinmaze基因组DNA中存在的编码野生型ALS蛋白的基因中，获得编码突变型ALS蛋白的基因。为了引入突变，可以使用已知的标准技术。例如，可以使用定点诱变。可以采用商业试剂盒例如Mutan-K(Takara Shuzo)、Gene Editor(Promega)或Exsite(Stratagene)进行定点诱变。
另外，在PC除草剂存在下通过培养对PC除草剂敏感的野生型培养细胞，然后选择出现并显示对所述PC除草剂有抗性的突变培养细胞，可以获得编码突变型ALS蛋白的基因。
首先，从对PC除草剂有抗性的突变培养细胞制备mRNA，合成cDNA，然后产生λgt 11噬菌体的cDNA文库(该文库被认为具有抗性特性杂合性)。然后，使用含有编码野生型ALS蛋白的基因的一部分的核酸探针[EST(Expression Sequence Tag(已表达序列标志)，Genband，DDBJ和EMBL登记号C72411)，得自日本型水稻变种Nippon-bare]，对所述文库进行筛选。接着，将所得的阳性克隆的插入DNA亚克隆到pBluescript II SK+中，以测定核苷酸序列。选择具有编码SEQ ID NO1的氨基酸序列的插入DNA的克隆，使得能够获得编码突变型ALS蛋白的基因。另外，将包含已掺入了编码突变型ALS蛋白的基因的pBluescript II SK+的质粒根据布达佩斯条约于2000年11月2日保藏于独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(Patent and Bio-Resource Center，National Institute of Advanced Industrial Science andTechnology)(Chuo-6，1-1-1，Higashi，Tsukuba-shi，Ibaraki，JAPAN)，作为pBluescript II SK+中的突变型ALS cDNA保藏(FERM BP-7348)。
与野生型ALS蛋白相比，所述突变型ALS蛋白不仅对PC除草剂具有良好的抗性，而且对磺脲除草剂和咪唑啉酮除草剂也具有良好的抗性。特别是，所述突变型ALS蛋白对PC除草剂具有高水平的抗性。这可以通过将编码突变型ALS蛋白的基因掺入到例如大肠杆菌的表达载体中，然后检查用所述表达载体转化的大肠杆菌对所述除草剂的敏感性来确定。
PC除草剂的实例包括由以下化学式1表示的双草醚、嘧草硫醚和pyriminobac。
双草醚 嘧草硫醚 pyriminobac
磺脲除草剂的实例包括由以下化学式2表示的氯磺隆、苄嘧磺隆、乙基吡磺隆和唑吡嘧磺隆。
氯磺隆苄嘧磺隆 乙基吡磺隆唑吡嘧磺隆咪唑啉酮除草剂的实例包括由以下化学式3表示的咪唑喹啉酸和咪唑烟酸。
咪唑喹啉酸 咪唑烟酸用编码突变型ALS蛋白的基因转化靶植物，可以给所述植物赋予对PC除草剂的抗性。可以用已知的标准技术来转化植物。例如，可以用根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)将外源基因导入靶植物细胞中。
更具体地讲，将编码突变型ALS蛋白的基因插入到含有土壤杆菌Ti质粒的T-DNA序列的双元载体中。将Ti质粒转化到大肠杆菌等中。然后，将由例如大肠杆菌复制的含有编码突变型ALS蛋白的基因的双元载体转化到含有辅助质粒的土壤杆菌中。用所述土壤杆菌感染靶植物，然后鉴定转化植物。当经鉴定的转化植物是培养细胞时，则可以用已知的标准技术，将所述植物细胞再生为完整的植株。
为了用编码突变型ALS蛋白的基因转化靶植物，可以用已知的标准技术直接导入所述基因。用含有编码突变型ALS蛋白的基因的表达载体转化的方法的实例包括聚乙二醇法、电穿孔法和粒子枪法(particlegun method)。
可以将编码突变型ALS蛋白的基因转化到任何类型的植物例如单子叶植物和双子叶植物中。用编码突变型ALS蛋白的基因转化的靶作物的实例包括水稻、玉米、小麦、大麦、大豆、棉花、油菜、甜菜和烟草。另外，草坪草、树等也可以通过导入编码突变型ALS蛋白的基因而被转化。
在任一上述情况下，用编码突变型ALS蛋白的基因转化植物可以给所述植物赋予对PC除草剂、磺脲除草剂和咪唑啉酮除草剂的抗性。
此外，编码突变型ALS蛋白的基因也可在植物转化实验中作为选择标记使用。例如为了用目标基因转化植物，可以将含有编码突变型ALS蛋白的基因和目标基因的载体导入植物细胞中，然后在PC除草剂存在下培养所述植物细胞。因此，在PC除草剂存在下存活下来的植物细胞指示其含有其中导入的编码突变型ALS蛋白的基因和目标基因。此外，目标基因和编码突变型ALS蛋白的基因是否掺入到植物细胞染色体中，可以先通过观察植物的表型，然后通过基因组DNA杂交或PCR检查基因组上的这些基因存在与否而得到证实。
实施例现在，通过以下实施例进一步描述本发明，但是本发明的技术范围不受这些实施例的限制。
实施例1抗PC除草剂的水稻(Kinmaze)培养细胞的产生除去水稻种子(变种；Kinmaze，学名Oryza sativa var.Kinmaze)的谷壳。将种子浸泡在70％乙醇中达5分钟，然后浸泡在约5％安替佛民中达20分钟，接着用无菌蒸馏水洗涤数次。然后，将种子在具有表1
所示组成的培养基上静止培养。
表1
在以上培养基组成中，2，4-D是合成植物生长素。为了制备所述培养基，首先，将具有以上组成的培养基置于1L号烧杯中，然后向烧杯中加入蒸馏水至1000ml。接着，将溶液调至pH 5.7，补充3g脱乙酰吉兰糖胶(Gelrite)。通过用微波炉加热使Gelrite充分溶解，然后用移液管向培养瓶中每次加入30ml混合物。随后，用三层铝箔封上培养瓶，然后在高压灭菌锅中于121℃15-20分钟加热灭菌。最后，让溶液冷却至室温，从而制备供静止培养上述种子用的培养基。
接着，从在培养基上诱导的愈伤组织中取出胚乳部分，然后进行传代培养。然后，将所得的愈伤组织的一部分传代培养，也就是说，每两周一次在补充1μM双草醚(一种PC除草剂)的液体培养基(培养基组成与表1中所示的组成相同，但不补充Gelrite)中连续培养。2-6周后，培养细胞开始凋亡。约2个月后，从其中大多数已经死亡和变成褐色的培养细胞群体中获得认为正在进行细胞分裂的多个不变色的细胞团。分离这些细胞团，进行培养，从而获得在2μM双草醚存在下可以增殖的多个细胞系。
随后，将所得的多个细胞系在双草醚浓度依次升高的情况下进行培养。结果，获得在100μM双草醚存在下可以增殖的细胞系。将双草醚抗性培养细胞(下文称为抗性突变体)在补充100μM双草醚的MS-2，4-D固体培养基上传代培养。取出一部分传代培养抗性突变体作为样品，将其加入到未补充双草醚的MS-2，4-D液体培养基中，然后以8-10天的循环进行悬浮细胞培养。
将约1.5g(湿重)抗性突变体移植到补充50ml MS-2，4-D液体培养基和适当浓度的双草醚的200ml锥形瓶中，然后在大约27℃下培养适当时间。定期测量愈伤组织的湿重。根据移植抗性突变体的湿重确定增加的相对量。另外，用不同的双草醚浓度进行三次实验，计算标准误差。图3显示双草醚浓度变化和抗性突变体第8天相对重量之间的关系。作为对照，用野生型(Kinmaze)进行相似的实验。图4显示双草醚浓度和第8天相对重量之间关系的测量结果。
如图4所示，野生型的生长在补充1nM双草醚的组中不受抑制，但在补充10nM或10nM以上双草醚的组中受到抑制。然而，如图3所示，抗性突变体的生长甚至在补充10μM双草醚的组中也几乎不受影响。
如上所述测定野生型和抗性突变体的生长率，只是用氯磺隆来代替双草醚。图5显示氯磺隆浓度变化和野生型第9天相对重量之间的关系。图6显示氯磺隆浓度变化和抗性突变体第9天相对重量之间的关系。
如图5所示，野生型的生长在加入1nM氯磺隆时受到抑制，表明野生型对氯磺隆比对双草醚的敏感性更高。然而，如图6所示，抗性突变体的生长在加入1μM氯磺隆时受到强抑制。对双草醚和氯磺隆的敏感性在野生型和抗性突变体两者间几乎没有变化，甚至经历较长的培养时间也是如此。野生型和抗性突变体的生长率几乎相同。
这些结果表明，所述抗性突变体具有对双草醚的特异性抗性。而且，与野生型相比，表明所述抗性突变体已改进对氯磺隆的抗性。
实施例2从抗性突变体中部分纯化的ALS酶的除草剂敏感性在本实施例中，从实施例1中获得的抗性突变体中部分纯化突变型ALS蛋白，然后检查所得的突变型ALS蛋白的除草剂敏感性。如下部分纯化突变型ALS蛋白。
首先，通过液体培养方法(不补充双草醚)制备200g或200g以上的抗性突变体，培养基的组成与表1中所示的组成相同，但是不含Gelrite。然后，使用Hiscotron，在体积3倍于组织体积的缓冲液1[100mM磷酸钾缓冲液(pH 7.5)，含有20％(v/v)甘油、0.5mM焦磷酸硫胺素(TPP)、10μM黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、0.5mM MgCl2和体积为组织体积的1/10的聚乙烯聚吡咯烷酮，将约150g抗性突变体匀浆。匀浆液通过尼龙网过滤，然后以15,000×g离心20分钟。向经离心的上清液中加入硫酸铵至50％饱和，然后让其在冰中静置约1小时。将混合物再次以15,000×g离心20分钟，然后将沉淀部分溶于约30ml缓冲液2[10mM Tris盐酸缓冲液(pH 7.5)，含有20％(v/v)甘油、0.5mMTPP和0.5mM MgCl2]中。将混合物再次以15,000×g离心20分钟，然后将上清液部分上样至Sephadex G-25(Amersham Pharmacia Biotec)上。收集通过该柱的约40ml流分作为粗制酶溶液。
接着，依照Bio-Rad Protein Assay手册的Bradford方法，测定所述粗制酶溶液的蛋白质浓度。然后将所述粗制酶溶液通过Whatman滤膜(Whatman)过滤，然后使用FPLC装置(Amersham Pharmacia Biotec)，将所述含适量蛋白的粗制酶溶液(10-15ml)上样至三个垂直连接的HiTrap Q柱(Amersham Pharmacia Biotec)上。用HiTrap Q吸附蛋白质组分后，用体积3-5倍于床体积的缓冲液-2洗出非吸附流分。然后，用体积10倍于床体积的洗脱液(150ml)洗脱吸附蛋白质组分。在此，通过将线性浓度梯度(0-0.4M)的KCl溶于缓冲液-2中，制备洗脱液。含有被洗脱的蛋白质组分的洗出物以各5ml分配到多个分装用试管中。此外，为了稳定在洗脱的蛋白质组分中所含有的ALS酶，向各个分装用试管中预先加入了0.5ml含20mM丙酮酸钠的缓冲液-2。
如下测定分配到各个分装用试管的洗脱流分中所含有的突变型ALS蛋白所产生的ALS活性。通过将待测量的洗脱流分与包含20mM丙酮酸钠、0.5mM TPP、0.5mM MgCl2、10μM FAD和20mM磷酸钾缓冲液(pH 7.5)的溶液混合，制备测定反应中所用的反应溶液。使用1ml该反应溶液。在加入待测量的洗脱流分后，让测定反应于30℃进行40-60分钟。然后，通过加入0.1ml 6N硫酸(或0.25N氢氧化钠)终止反应。
终止反应后，将反应溶液于60℃保温10分钟，从而使反应溶液中所含有的乙酰乳酸转化为乙偶姻。
然后，为了定量测定反应溶液中所含有的乙偶姻，向反应溶液中加入溶于2.5N氢氧化钠中的1ml 0.5％(w/v)肌酸和1ml 5％(w/v)α-萘酚，然后于37℃保温10分钟。然后通过对反应溶液吸光度(525 nm)的比色，对乙偶姻定量，从而评价ALS活性。另外，由于反应溶液含有少量的丙酮酸钠，因此用反应时间0作为对照。
结果，OD525nm的吸光度每0.2ml反应溶液高达约7。然而，当上述测定反应用氢氧化钠终止，并且检查由于除ALS活性以外的活性引起的乙偶姻产生活性时，接近80％的表观ALS活性来自不是由于突变型ALS蛋白的活性所致的直接乙偶姻产生活性。因此，采用阴离子交换树脂，通过FPLC，将突变型ALS蛋白和其它蛋白的乙偶姻产生活性分离开来。结果，如图7所示，检测到两个活性峰。
为了确定这两个活性峰的哪一个峰对应于突变型ALS蛋白，检查这两个峰的乙偶姻产生活性。因而发现较早出现的峰所示流分对应于突变型ALS蛋白。
应用含有突变型ALS蛋白的酶溶液，检查突变型ALS蛋白对双草醚、氯磺隆和咪唑喹啉酸的敏感性。通过以与在上述测定反应中相同的方式测定ALS活性，只是在加入酶溶液之前加入一定浓度的除草剂，评价对这些除草剂中每种的敏感性。为了进行比较，以同样的方式分离纯化野生型ALS蛋白，然后用于实验。另外，将双草醚制成水溶液，而将氯磺隆和咪唑喹啉酸制成丙酮溶液。反应混合物中丙酮的终浓度为1％。
图8显示ALS活性抑制率和双草醚浓度之间的关系。图9显示ALS活性抑制率和氯磺隆浓度之间的关系。图10显示ALS活性抑制率和咪唑喹啉酸浓度之间的关系。在图8-10中，连接白色方块的折线表示野生型ALS蛋白，连接黑色方块的折线表示突变型ALS蛋白。
依照概率单位分析，计算抑制ALS活性的50％的除草剂浓度(I50)，从而计算突变型ALS蛋白的I50与野生型ALS蛋白的I50之比。
表2显示该结果。
a)50％抑制的浓度b)根据表1中抑制活性计算I50(抗性突变体)/I50(野生型)如图8-10和表2中所示，当与野生型ALS蛋白相比时，突变型ALS蛋白甚至在所述除草剂存在下都显示相对高的ALS活性。尤其是，在突变型ALS蛋白和野生型ALS蛋白之间的最显著性差异是对双草醚除草剂的敏感性。也就是说，突变型ALS蛋白具有对双草醚的良好抗性。
实施例3突变型ALS基因的克隆如下制备克隆编码来自抗性突变体的突变型ALS蛋白的基因(突变型ALS基因)所用的探针。在该实施例中用作探针的部分cDNA来源于显示与玉米ALS基因有高度同源性的水稻(Nippon-bare)。
(1)来源于显示与玉米ALS基因有高度同源性的水稻(Nippon-bare)的部分cDNA核苷酸序列的测定作为由the Society for Techno-inmovation of Agriculture，Forestry andFisheries和National Institute of Agrobiological Sciences进行的the IneGenome Project(Ine基因组计划)的一部分，已经测定了水稻(Nippon-bare)cDNA的部分核苷酸序列，并且已经建立cDNA的部分核苷酸序列数据库。在该数据库中所含有的已知约350bp的核苷酸序列的cDNA克隆(登记号C72411)显示与玉米ALS基因有高度同源性。已对玉米ALS基因进行了全测序。
该cDNA克隆(登记号C72411)得自National Institute ofAgrobiological Sciences，如下测定核苷酸序列。在此，所述cDNA克隆包含插入到pBluescript II SK+中的ALS同系物基因，并且在大肠杆菌(E.coli)中能够自主复制。
首先，将保留所述ALS同系物的质粒载体转化到大肠杆菌DH5α中。将从平板中获得的白色菌落在液体中培养，然后用标准技术从细胞中提取质粒。由于已经将所述插入DNA插入在SalI和NotI(质粒载体中多克隆位点的限制性酶)之间，因此用这两种酶消化载体。通过琼脂糖电泳证实插入片段。然后，使用例如RNA酶A、PEG和LiCl，通过标准技术纯化所得的保留所述ALS同系物的质粒载体，然后采用引物和ABI BigDyeTerminator Cycle Sequencing Kit进行测序反应。PCR反应条件采用生产商的方案。此中所用的引物是M13引物和根据已测定的核苷酸序列设计的合成引物。通过乙醇沉淀纯化所得的PCR产物，然后用ABI PRISM 310测序仪测定其核苷酸序列。
已知保留所述ALS同系物的质粒载体含有长度为1.6kb的插入DNA。将所得的保留所述ALS同系物的质粒载体用限制性酶SalI和NotI消化，然后进行电泳。因此，检测出一条对应于pBluescript II SK+的约3kbp条带和一条对应于所述插入DNA片段的约1.6kbp条带(未显示)。测定所述插入DNA部分的完整的核苷酸序列，搜索其与玉米核苷酸序列的同源性。如图11所示，发现有84.7％同源性。由于测定ALS同系物是所述Nippon-bare变种ALS基因的部分cDNA，因此，将用SalI和NotI消化的所述插入DNA用作探针。此外，在图11中，第一行是所述Nippon-bare变种ALS基因的部分cDNA的核苷酸序列；第二行是玉米ALS基因的部分cDNA的核苷酸序列。
(2)从抗性突变体制备mRNA首先，将用液氮冷冻的抗性突变体用研钵和研棒压碎，然后用搅拌机充分捣碎30秒。将捣碎的粉末悬浮于提取缓冲液[(100mM Tris-HCl pH9.0、100mM NaCl、1wt％SDS、5mM EDTA)∶(β-巯基乙醇)∶(Tris饱和的苯酚)＝15∶3∶20]，然后充分搅拌。将该溶液以12,000×g离心15分钟，然后收集上清液。向上清液中加入200ml PCI[(Tris饱和的苯酚)∶(氯仿)∶(异戊醇)＝25∶24∶1]，于4℃振摇10分钟，以12,000×g离心15分钟，然后收集上清液。重复该程序两次。加入1/20体积的5M NaCl和2.2倍体积的乙醇至所得的上清液中，然后让混合物于-80℃静置30分钟。通过以12,000×g离心5分钟收集沉淀。将沉淀用70％乙醇洗涤，干燥，然后溶于10mM β-巯基乙醇溶液中。接着，将溶液以27,000×g离心10分钟，以除去不溶性部分。向溶液中加入1/4体积的10M LiCl，然后让其在冰上静置1小时。此外，将溶液以27,000×g离心10分钟，以收集沉淀，溶于4ml H2O中，然后测量260nm的吸光度，以测定RNA的浓度。加入1/20体积的5M NaCl和2.2倍体积的乙醇至溶液中，然后让其于-80℃静置30分钟。随后，将溶液以27,000×g离心10分钟，以收集沉淀，然后用70％乙醇洗涤，然后干燥。将所得的产物溶于适量的H2O中，以获得总RNA溶液。在此，于4℃进行离心。
用以下方法从总RNA中分离纯化mRNA。加入相当于所提取的总RNA溶液体积的2×结合缓冲液(20mM Tris-HCl pH 7.5，10mMEDTA，1M NaCl)至所提取的总RNA溶液中。用1×结合缓冲液洗涤填充0.1g寡聚dT纤维素(Amersham Pharmacia Biotec)的柱子，然后将总RNA溶液上样至该柱上。用1×结合缓冲液洗涤该柱后，加入洗脱缓冲液(10mM Tris-HCl pH 7.5，5mM EDTA)，以一次0.5ml收集洗出物。将通过该柱的流分上样至另一寡dT纤维素(Amersham PharmaciaBiotec)柱上，以同样的方式处理。根据每个流分的吸光度计算洗脱mRNA的浓度后，加入1/10体积的10M LiCl和2.5倍体积的乙醇至产物中，然后让混合物于-80℃静置30分钟。接着，将混合物离心，将沉淀的级分干燥，溶于100μl H2O中。如此获得的mRNA通过蔗糖密度梯度离心进行大小分级分离。
将分离纯化的mRNA加到装有由25％蔗糖溶液和5％蔗糖溶液给出的密度梯度的离心管中，然后使用甩平式转子于4℃以27,000rpm超离心15小时。离心后，以密度梯度顺序以0.5ml收集各级分。测量各级分的吸光度，计算收集的mRNA的浓度，通过使用ECL试剂盒(ECL直接核酸标记和检测系统，Amersham Pharmacia Biotec)证实ALSmRNA的存在。使用以上(1)中制备的探针于42℃杂交16小时。杂交后，用试剂盒提供的原始洗涤缓冲液于42℃洗涤两次，每次5分钟，然后用2×SSC溶液于42℃洗涤一次，洗涤5分钟。用透明塑料膜包裹经洗涤的膜，将其浸入试剂盒提供的所附发光试剂中，然后对X光胶片曝光。
从抗性突变体提取约35mg总RNA，并且通过上述方法可以提取约4mg mRNA。此外，在蔗糖密度梯度离心中，发现预期阳性的级分的杂交阳性点。
当使用野生型时，除提取约7mg mRNA外，还提取了约95mg总RNA。当从野生型中提取mRNA时，使用上述方法，只是用野生型来代替抗性突变体。
(3)来源于抗性突变体的cDNA文库的构建采用2μg以上(2)中纯化的mRNA和cDNA合成试剂盒(AmershamPharmacia Biotec)，合成cDNA，致使构建一个来源于抗性突变体的cDNA文库。
首先，用试剂盒提供的RT酶进行逆转录反应；用试剂盒提供的T4 DNA聚合酶进行后续互补链延伸反应。在互补链延伸反应时，加入32p-dCTP以计算cDNA合成的收率。在加入接头后，通过体外包装方法将合成cDNA掺入到λ噬菌体中。
加入到cDNA中的接头是Eco Ri-Not I-Bam HI接头(TakaraShuzo)。加入50倍于cDNA摩尔浓度的接头至含有cDNA的溶液中。然后，加入T4 DNA连接酶(Pharmacia)至混合物中，然后于4℃进行连接反应过夜。采用AsahiPak GS 710柱(Asahi Chemical Industry Co.，Ltd.)，将反应溶液上样至HPLC，然后用波长260nm的紫外线监测洗出物。洗出物分别以0.5ml分级分离为25个流分。用Cerenkov计数器测定每个流分，收集3-4个高计数流分。用T4多核苷酸激酶(TakaraShuzo)将所述流分中所含有的接头5’末端磷酸化，然后加入λgt 11 EcoRI臂，进行连接反应。加入GigaPack Gold III(Stratagene)至溶液中，然后在室温下进行连接反应达2小时。反应后，加入200μl SM缓冲液和8μl氯仿至反应溶液中，从而制备噬菌体溶液。将该噬菌体溶液稀释10倍。用1μl经稀释的溶液感染大肠杆菌(Y-1088)，向其中加入0.7％上层琼脂，然后将该溶液接种到LB平板上。对4-8小时后在平板上出现的噬斑数进行计数，从而测定滴度。
约74ng来源于抗性突变体的cDNA的合成通过DE 81纸和Cerenkov计数的结果得以证实。载体与加入其中的接头连接后Cerenkov计数的结果揭示出，获得抗性突变体的约22ng含有其中插入的插入片段的λDNA。将λDNA包装成噬菌体，从而制备来源于抗性突变体细胞的cDNA文库。该文库溶液的滴度为16,600pfu/μl。
当按照上述方法用从野生型中提取的mRNA来制备cDNA文库时，合成约38ng来源于野生型的cDNA。此外，获得野生型的约5ng含有其中插入的插入片段的λDNA。此外，来源于野生型的cDNA文库溶液的滴度为18,160pfu/μl。
(4)含有所述ALS基因的cDNA的筛选为了在平板上形成约20,000个噬斑，将以上(3)中制备的文库溶液稀释，然后将平板上来源于野生型的噬菌体和来源于抗性突变体的噬菌体分别独立地接种到10个平板上。将噬斑转移至硝化纤维素膜(Schleicher & Schnell，PROTORAN BA85，孔径0.45μm)上。将该硝化纤维素膜浸入变性溶液(0.5M NaCl，1.5M NaCl)，然后浸入中和溶液(0.5M NaCl，0.5M Tris-HCl pH 7.5，1mM EDTA)约20秒。用滤纸除去硝化纤维素膜中过量的水，然后将硝化纤维素膜于80℃烘烤2小时。另外，当用Hybond-N+(Amersham Pharmacia Biotec)来代替硝化纤维素膜时可省去烘烤步骤，并且用0.4M NaOH进行固定化达20分钟。
用两种不同的方法一RI和非RI，将以上(1)中制备的插入DNA标记，然后用作探针DNA。用RI标记和杂交通过以下方法来进行。首先，将约200-500ng探针DNA热变性，然后用BcabEST DNA标记试剂盒(Takara Shuzo Co.，Ltd)标记。该标记反应后，加入试剂盒提供的缓冲液、随机引物和32p-dCTP。随后，加入BcaBEST，然后于65℃保温30分钟。随后，加入EDTA以终止反应。将反应溶液上样至硝化纤维素膜上，致使8片膜都含有约100ng探针。于42℃轻轻摇动下杂交过夜。杂交后，用2×SSC、0.1％SDS溶液洗涤膜三次，然后对BAS 2000成像分析仪(Fuji Photo Film Co.，Ltd.)的显象板曝光约1小时。曝光后，用所述成像分析仪检测阳性克隆。
用非RJ标记通过以下方法来进行。约200-500ng探针DNA热变性后，加入ECL直接DNA/RNA标记和检测系统(Amersham PharmaciaBiotec)中提供的DNA标记试剂(过氧化物酶)和戊二醛，然后于37℃保温。在这种情况下，将标记探针DNA上样至硝化纤维素膜上，致使8片膜都含有约100ng标记探针DNA。于42℃轻轻摇动下杂交过夜。杂交后，用原始洗涤缓冲液在室温下洗涤膜三次，每次10分钟，然后用2×SSC在室温下洗涤膜一次达10分钟。将膜浸入ECL试剂盒提供的发光溶液中，然后对X光胶片曝光30分钟至3小时。
用无菌牙签将通过杂交获得的阳性噬菌体(初次筛选)与上层琼脂一起刮下来，然后悬浮于200μl SM缓冲液中，从而获得噬菌体溶液。将每个克隆的噬菌体溶液适当地稀释，感染大肠杆菌菌株Y-1088，然后接种到LB平板上。用这些新制备的平板，同样进行杂交(第二次筛选)。将阳性噬斑悬浮于200μl SM缓冲液中，从而获得单个噬菌体。如果通过第二次筛选没有分离到单个噬菌体，则进行再次稀释，然后接种到LB平板上。随后，进行杂交(第三次筛选)，致使获得单个噬菌体。
接着，通过以下方法从单个噬菌体制备λDNA。将用竹签和牙签从阳性克隆噬斑收集的λ噬菌体接种到200μl含有5μl新宿主大肠杆菌(Y1088)悬浮液的2×YT培养基(含有10mM MgCl2和0.2％麦芽糖)中。让产物于42℃静置温育过夜。然后，将培养基再次接种到1ml含有25μl宿主大肠杆菌(Y1088)悬浮液的2×YT培养基(含有10mMMgCl2和0.2％麦芽糖)中，然后振荡培养过夜(这些步骤构成预培养过程)。将预培养溶液(10-50μl)接种到12ml含有10mM MgCl2和0.5ml大肠杆菌Y1088悬浮液的2×YT培养基中。然后，于42℃相对强振荡下温育过夜，直至裂解后浊度增加。培养后，加入50μl氯仿和1.2ml5M NaCl，然后于42℃振荡下保温10分钟。将产物以27,000×g离心10分钟，然后上清液转移至新的离心管中。加入5ml 50％PEG至上清液中，然后在冰上保温1小时或1小时以上。将产物以27,000×g离心10分钟，然后弃去上清液。接着，再次以27,000×g离心，然后弃去液体部分。将沉淀部分悬浮于300μl含有4μgDNA酶I、20μg RNA酶A和10mM MgCl2的30mM Tris盐酸缓冲液(pH 7.5)中。将悬浮液转移至1.5ml试管中。将悬浮液于37℃保温30分钟后，加入7.5μl 20％SDS、3μl蛋白酶K(10mg/ml)和12μl 0.5M EDTA至悬浮液中，然后于55℃再保温15分钟。随后，加入150μl苯酚至产物中，然后剧烈搅拌。然后用TOMY微量离心机MR-150(TOMY DIGITAL BIOLOGYCO.，LTD.)，将混合物以15,000rpm离心3分钟，收集水层。加入800μl乙醚(向其中已加入蒸馏水，以除去过氧化物)至所收集的水层中。剧烈搅拌混合物，然后以15,000rpm离心10秒，弃去乙醚层。重复乙醚抽提步骤后，用氮气除去在水层中残留的乙醚。加入30μl 5M NaCl和875μl乙醇至水层中，以便快速收集沉淀的λDNA。用约1ml 70％乙醇冲洗所收集的λDNA，然后减压干燥约1分钟，从而除去乙醇。将产物溶于20-50μl TE缓冲液(pH 8.0)中，从而制备λDNA溶液。
通过以下方法对所得的λDNA中的插入DNA进行亚克隆和测序。将所得的λDNA溶液(1μl)用Not I消化，以便切下插入DNA。反应溶液的组成(对于切割反应而言)按照限制性酶所附的手册。于37℃反应约2小时后，通过用1％琼脂糖凝胶电泳证实插入片段的大小。将含有插入DNA的λDNA(10-20μl)用Not I消化，以便切下插入DNA。用取样用琼脂糖凝胶分离插入DNA。从凝胶中切下相应的条带，然后用标准技术纯化插入DNA。将插入DNA在BAP处理(用来源于虾的碱性磷酸酶去磷酸化)后与载体以1∶1的摩尔比混合，随后用T4 DNA连接酶于16℃连接反应2小时或2小时以上。在此，由于将用Not I切割的插入DNA用作材料，因此对用Not I切割的载体进行BAP处理。连接后，将一部分溶液与感受态细胞(DH5α)混合，然后让其在冰上静置30分钟。接着，将混合物于42℃热激30秒，然后让其在冰上再静置2分钟。然后，加入SOC至混合物中，于37℃温育1小时，接种到LB培养基平板上，在该平板上先前均匀加入100μl 2×YT(含有50μg/ml氨苄青霉素)、30μl 3％X-Gal和3μl 1M IPTG的混合物，然后于37℃培养10小时或10小时以上。将转化白色菌落分别接种到2ml含有氨苄青霉素的LB培养基或2×YT培养基上，然后于37℃培养过夜。用标准技术从培养溶液制备质粒，并将其溶于H2O中。定量测定其DNA浓度，然后使质粒经过PCR反应以供测序。用上述方法进行PCR反应和测序。
因此，通过上述实验获得约2.2kb的非全长的所述ALS cDNA。由于在距该DNA 5’一侧约250bp的位置存在一个Sma I位点，因此通过以下方法制备一种新探针。用宿主大肠杆菌JM109扩增含有所述约2.2kbp的pBluescript II SK+，然后采自动分离系统(KURABO PI-100)提取质粒。用Sma I直接消化该质粒。通过1％琼脂糖电泳分离并纯化所产生的约250bp片段，然后计算浓度，从而制备探针。使用该探针，再次通过使用RI的上述方法对文库进行筛选。从如此获得的单个噬菌体制备λDNA，用Eco RI消化λDNA溶液(1μl)，然后通过电泳证实其大小，然后在硝化纤维素膜上固定化。电泳后，将凝胶浸入含有1.5MNaCl的0.5M NaOH溶液中，然后轻轻摇动15分钟。然后凝胶用水洗涤，浸入含有3M NaCl的0.5M Tris-HCl(pH 7.5)中，然后振摇下中和约15分钟。将约5层厚的工业用滤纸叠在一起以制成底座。将该基底座置于覆盖在不锈钢片上的20×SSC中。随后，将经中和的凝胶、膜(已经切成一定大小，先浸入蒸馏水达10分钟中，然后再浸入20×SSC中达10分钟)和两叠滤纸按顺序放在底座上，在其上再放置厚度为3-4cm纸巾。先将玻璃板，再将一个轻的重物放在产物上，然后转印约5分钟。在凝胶和膜之间证实没有截留的气泡后，进行转印约10分钟。转印后，将膜用透射仪进行UV处理，然后于80℃烘烤约15-30分钟。烘烤后，与用32p标记的以上250bp探针DNA进行杂交(杂交缓冲液组成5×SSPE、0.5％SDS、5×Denharlts、鲑精(solum sperm)DNA、50％甲酰胺)。将杂交带的放射性转移至显象板中，用BAS-2000分析结果。在杂交阳性的插入片段中，大量的制备显示大小相对大的那些插入片段，然后将其亚克隆(FERM BP-7348)到已用Eco RI消化的pBluescriptII SK+中，然后通过上述方法用BAP处理。将产物转化到大肠杆菌(JM105)中。所得的转化体进行液体培养，然后用标准技术制备质粒。因而可用上述方法测定核苷酸序列。
结果，可以获得含有全长突变型ALS基因的cDNA。所述cDNA的核苷酸序列示于SEQ ID NO2中。此外，可以从来源于野生型的cDNA文库获得一种类型的含有全长ALS基因的cDNA。图1显示突变型ALS基因和野生型ALS基因之间同源性比较的结果。
实施例4突变型ALS蛋白的表达将实施例3(4)中获得的质粒用Eco RI消化，切下含有野生型ALS基因的cDNA和含有突变型ALS基因的cDNA，然后将其分别掺入到pGEX表达载体中。含有野生型ALS基因的cDNA具有一个比起始密码子长47个核苷酸的5’非翻译区，并将其掺入到pGEX-2T的Eco RI位点中。此外，含有突变型ALS基因的cDNA含有一个比起始密码子长31个核苷酸的5’非翻译区，并将其掺入到pGEX-4T-3的Eco RI位点中。
将这些载体分别转化到大肠杆菌(JM105)中。将通过转化获得的菌落进行液体培养，然后提取质粒，然后根据限制性酶切模式和测序证实插入DNA的插入方向。对其中插入DNA的方向是按预期的克隆分别进行选择，然后在2ml含有氨苄青霉素的LB培养基中于27℃振荡培养。使用1ml该预培养溶液，在50ml或250ml含有氨苄青霉素的LB培养基中进行培养。培养过夜后，加入1mM IPTG，然后诱导GST融合蛋白的表达达3-4小时。
表3显示在加入IPTG后进行培养3-4小时后测定ALS活性的结果。
表3
如表3所示，具有野生型ALS基因的大肠杆菌和具有突变型ALS基因的大肠杆菌均显示其比活是不含质粒的对照组的比活的约3-4倍。在加入IPTG后将转化大肠杆菌培养3-4小时，然后于-80℃贮存。用转化大肠杆菌纯化GST ALS融合蛋白。
通过以下方法从大肠杆菌分离和纯化ALS。首先，将于-80℃贮存的转化大肠杆菌沉淀悬浮于ALS提取缓冲液(含30％甘油和0.5mMMgCl2的磷酸钾缓冲液(pH 7.5))中。具体地说，加入2.5ml缓冲液至从50ml培养溶液获得的沉淀中。将悬浮液进行超声处理(Heat Systems-Ultrasonics，Sonicator W-225R，微芯片(micro chip)，输出控制(outputcontrol)8，约1秒间隔，两次(每次40秒))，并且以15000×g于4℃离心20分钟，从而获得作为粗制酶溶液的上清液。
通过以下方法从所述粗制酶溶液中纯化GST ALS融合蛋白(下文称为GST-ALS)。将从沉淀(得自250ml培养溶液)中制备的粗制酶溶液(12.5ml)上样至谷胱甘肽sepharose 4B亲和柱(Amersham PharmaciaBiotec，床体积，约1ml，该柱先前已用10ml 1×PBS(0.14M NaCl，2.7mM KCl，10.1mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4pH7.3平衡))上。然后用10ml 1×PBS洗涤该柱，然后吸附的GST-ALS用2ml 10mM谷胱甘肽溶液洗脱(4次)。测量各个流分的GST活性和ALS活性，然后收集具有高活性的流分。另外，由于当使用ALS提取缓冲液时，上述柱的吸附率低，因此也进行以下实验用1×PBS提取酶，让其吸附至上述柱。按照上述方法进行ALS活性的测量和蛋白质的定量。通过使用1-氯-2，4-二硝基苯(第二个名称简称为2，4-二氯硝基苯(CDNB))作为底物的方法进行GST活性的测量。使用3ml反应溶液和一种反应组成(1mMCDNB，1mM谷胱甘肽(还原型)，酶溶液，100mM磷酸钾缓冲液(pH6.5))。在加入酶溶液后，于30℃进行增加的340nm吸光度的速率测定。以浓缩100倍的乙醇溶液制备CDNB，然后将其加入到反应溶液中。
明显检测不吸附到上述亲和柱上的活性(ALS活性和GST活性)。然而，在用第一次和第二次谷胱甘肽洗脱洗脱出的流分中检测出吸附到亲和柱的活性中的大部分。合并得自第一次和第二次洗脱中的那些流分，以制备纯化GST-ALS。
测定用凝血酶蛋白酶(25单位)于4℃消化过夜的GST-ALS作为不含GST的ALS。表4显示用粗制酶溶液和上述亲和柱在色谱分离后以及在凝血酶蛋白酶处理后的ALS活性、蛋白量和比活。
表4
所制备的ALS酶含有来源于大肠杆菌的ALS活性。然而，如表5所示，由于来源于大肠杆菌的ALS活性由ALS同工酶I产生，因此它可以通过加入1mM缬氨酸几乎完全被抑制。
表5
*该实验进行两次。
实施例5突变型ALS蛋白的除草剂敏感性用实施例4中获得的粗制酶溶液，检查突变型ALS蛋白的除草剂敏感性。以与实施例2中所述的方法相同的方法进行除草剂敏感性试验。在所述除草剂敏感性试验中，用三种除草剂-双草醚、嘧草硫醚和pyriminobac作为PC除草剂；用四种药物-氯磺隆、苄嘧磺隆、乙基吡磺隆和唑吡嘧磺隆作为磺脲除草剂；而用两种药物-咪唑喹啉酸和咪唑烟酸作为咪唑啉酮除草剂。
在加入突变型ALS蛋白之前，向反应溶液中加入含有一定浓度的这些除草剂的溶液(双草醚和嘧草硫醚是水溶液，其它的为丙酮溶液)。丙酮的终浓度为1％。另外，由于得自在大肠杆菌中表达的水稻cDNA的ALS蛋白对缬氨酸不敏感(Kil等，J.Biochem.Mol.Biol.31 287-295，1998)，因此在其中来源于大肠杆菌的ALS活性为缬氨酸所抑制的条件下进行除草剂敏感性试验。
图12显示当使用双草醚时所得的敏感性。图13显示当使用氯磺隆时所得的敏感性。如图12所示，野生型ALS活性为双草醚所抑制，而突变型ALS活性根本不受抑制。如图13所示，对于氯磺隆，与野生型ALS蛋白的活性相比，突变型ALS蛋白对一定浓度保持较高水平的其活性，然而，当与双草醚的情况相比时，突变型ALS蛋白的抗性为中等水平。
图14显示当使用嘧草硫醚作为除草剂时所得的敏感性；图15显示当使用pyriminobac作为除草剂时所得的敏感性；图16显示当使用苄嘧磺隆作为除草剂时所得的敏感性；图17显示当使用乙基吡磺隆作为除草剂时所得的敏感性；图18显示当使用唑吡嘧磺隆作为除草剂时所得的敏感性；图19显示当使用咪唑喹啉酸作为除草剂时所得的敏感性；图20显示当使用咪唑烟酸作为除草剂时所得的敏感性。在图12-20的折线图中，连接黑色三角的折线表示含有野生型ALS蛋白的粗制酶溶液，而连接黑色方块的折线表示含有突变型ALS蛋白的粗制酶溶液。
如图14-20所示，突变型ALS蛋白对每种所述除草剂都有良好的抗性，其抗性优于野生型ALS蛋白的抗性。特别是突变型ALS蛋白对PC除草剂有良好的抗性。图12、14和15的进一步比较表明，突变型ALS蛋白对PC除草剂中的双草醚的抗性最佳。
由于这些结果可以被认为与实施例2的结果有关联，因此提示实施例2中改进对基于PC的除草剂的抗性的因子是所述突变型ALS基因。
此外，用实施例4中制备的纯化GST-ALS和游离ALS进行除草剂敏感性试验。图21显示表明野生型ALS蛋白对双草醚抗性的结果。图22显示表明突变型ALS蛋白对双草醚抗性的结果。另外，图23显示表明突变型ALS蛋白对氯磺隆抗性的结果。图24显示表明突变型ALS蛋白对咪唑喹啉酸抗性的结果。其结果示于图21-24中的除草剂敏感性试验在不加缬氨酸的情况下进行。此外，在图21的折线图中，连接黑色三角的折线表示含有野生型ALS蛋白的粗制酶溶液；连接黑色方块的折线表示野生型GST-ALS；而连接黑色圆形的折线表示游离ALS蛋白。在图22-24的折线图中，连接黑色三角的折线表示含有突变型ALS蛋白的粗制酶溶液；而连接黑色方块的折线表示突变型GST-ALS。
如图21-24所示，纯化GST-ALS也显示与当使用粗制酶溶液的情况相似的除草剂敏感性。
实施例6突变型ALS基因中的突变部分和药物敏感性之间的关系如图1所示，实施例3(4)中确定的突变型ALS基因中的突变部分是W548L突变和S627I突变，在W548L突变中，野生型位置548的色氨酸(W)已突变为赖氨酸(L)，在S627I突变中，野生型位置627的丝氨酸(S)已突变为异亮氨酸(I)。为了研究这些突变对除草剂敏感性的影响，制备仅含有W548L突变或S627I突变任一种的突变型ALS基因，并且检查具有任一种突变的ALS蛋白的除草剂敏感性。
(1)突变基因的制备如图25和26所示，制备例如仅具有W548L突变的突变型ALS基因(下文称为“W548L突变型ALS基因”)。首先，用名为ALS-Rsp6的有义引物(5’-CATCACCAACCACCTCTT-3’SEQ ID NO3)和名为ALS-RspF的反义引物(5’-ACACGGACTGCAGGAATA-3’SEQ ID NO4)以及用保留双点突变型ALS基因的pBluescript II SK+(FERM BP-7348)作为模板，进行PCR，从而扩增具有W548L突变但不具有S627I突变的DNA片段(图25)。同时，用名为ALS-RspE的有义引物(5’-TTACAAGGCGAATAGGGC-3’SEQ ID NO5)和M13R反义引物(5’-GGAAACAGCTATGACCATG-3’SEQ ID NO6)以及用保留野生型ALS基因的pBluescript II SK+作为模板，扩增含有在位置627编码丝氨酸的区域的DNA片段(图25)。
接着，通过采用SPR方法(基因制备方法自身聚合酶反应，其中两个单链DNA在序列相互对应的末端部分结合，相互利用DNA为模板，DNA聚合酶复制DNA，形成双链DNA)，通过将两个DNA片段连接在一起，从两个DNA片段获得一个大的DNA片段(图26)。所得的DNA片段用Acc I和Eco RI消化，从而获得Acc I-Eco RI片段。在含有其中掺入的野生型ALS基因的pGEX-2T质粒(pGEX-2T-wALS)在Acc I位点消化后，用Eco RI于37℃部分消化1分钟，从而获得pGEX-2T质粒的部分片段(图26)。然后，将Acc I-Eco RI片段和pGEX-2T质粒的所述部分片段连接在一起，产生具有W548L突变型ALS基因的质粒。
另外，按照制备以上W548L突变型ALS基因的方法，可以获得仅具有S627I突变的突变型ALS基因(下文称为“S627I突变型ALS基因”)。也就是说，以与上述W548L突变型ALS基因所用方法相同的方法，可以获得S627I突变型ALS基因，只是在用pBluescript II SK+(FERM BP-7348)作为模板进行PCR时，用ALS-RspE和M13R作为引物，而在用保留野生型ALS基因的pBluescript II SK+作为模板进行PCR时，用ALS-Rsp6和ALS-RspF作为引物。
将具有W548L突变型ALS基因的质粒和具有S627I突变型ALS基因的质粒分别转化到大肠杆菌菌株JM109中。对所得的大肠杆菌菌落进行ALS基因的全测序，致使可以证实W548L突变的单点突变和S627I突变的单点突变。
(2)各个突变蛋白的除草剂抗性将具有W548L突变型ALS基因的质粒或具有S627I突变型ALS基因的质粒转化到大肠杆菌菌株JM109中。对从转化获得的菌落进行液体培养，以与实施例4和实施例5中所述方法相同的方法诱导GST诱导蛋白的表达，制备粗制酶溶液，然后在1mM缬氨酸存在下检查ALS的除草剂敏感性。
图27显示使用双草醚的结果。图28和图29显示使用氯磺隆和咪唑喹啉酸的结果。如图27所示，对于双草醚，W548L突变和S627I突变的每个单点突变都赋予针对双草醚的抗性，并且在仅W548L突变的单点突变中的抗性程度高于在仅S627I突变的单点突变中的抗性程度。
然而，显示在这些单点突变中的抗性程度都比实施例5中所示的双点突变的抗性程度要低若干数量级。换句话说，W548L突变和S627I突变的共存导致对双草醚的显著强的抗性，根据单独的或者W548L突变或者S627I突变的情况不能预见这一点。
当使用氯磺隆时(图28)，单独的W548L突变赋予对氯磺隆的抗性，但单独的S627I突变没有赋予明显的抗性。另外，单独的W548L突变以及W548L突变和S627I突变两者一起对氯磺隆抗性程度的比较揭示出，它们有相同的抗性程度。此外，当使用咪唑喹啉酸时(图29)，结果与双草醚的结果相似。然而，在该实施例中所使用的浓度范围内，尚不能证实增加的抗性是由于两个突变共存所致的延增效应。
如上所述，显示此时发现的一个新S627I突变显著增强由于W548L突变所致的双草醚抗性。总之，具有W548L突变和S627I突变的ALS基因是赋予对双草醚特异性高抗性的基因。
实施例7转化植物的产生用实施例3(4)中测定的突变型ALS基因转化水稻植物(Nippon-bare)，然后检查转化水稻植物的双草醚抗性。
(1)其中掺入突变型ALS基因的双元质粒的构建将实施例3(4)中获得的突变型ALS基因掺入双元载体pMLH7133(Mitsuhara等，Plant Cell Physiol.37 49-59，1996)中，该载体已开发用于水稻植物的转化。
首先，如图30所示，利用多克隆位点的限制性酶切割位点和接头的切割位点，切下在pBluescript II SK+(FERM BP-7348)中掺入的突变型ALS基因(用Sac I消化和用Bam HI部分消化)。然后，pMLH7133用Sac I和Ban HI消化。切下pMLH7133中的GUS区，然后将pMLH7133线性化。将含有突变型ALS基因的DNA片段和其形状为直链的pMLH7133连接在一起，从而获得pMLH7133-ALS。
将所得的pMLH7133-ALS转化到大肠杆菌菌株JM105中。将所得的单个菌落进行液体培养，然后制备质粒。通过用Sac I和Bam HI消化所制备的质粒，证实所述插入片段的存在与否(图31)，以便选出具有突变型ALS基因的克隆。用显示含有所述插入片段的质粒作为模板并且用提供特异性扩增突变型ALS基因的至少一部分的两个引物组，进行PCR。此中所用的引物组是ALS-Rsp1有义引物(5’-GCTCTGCTACAACAGAGCACA-3’SEQ ID NO7)和4-83-3反义引物(5’-GCTTTGCCAACATACAG-3’SEQ ID NO8)的引物组以及3-1-4有义引物(5’-AGGTGTCACAGTTGTTG-3’SEQ ID NO9)和3-1-1反义引物(5’-GCATCTTCTTGAATGGCG-3’SEQ ID NO10)的引物组。因此，检测到特异性片段条带(图32)，表明在所述pMLH7133载体中掺入了实施例3(4)获得的突变型ALS基因。
此外，通过PCR证实突变型ALS基因是否已被正常掺入，以确定所述插入片段的插入方向和测定其序列。如下所述通过PCR证实所述插入片段的插入方向。pMLH7133-ALS用Eco RI完全消化，从而取出TNOS部分并线性化。用所述产物作为模板以及用上述ALS-Res1和4-83-3引物组以及3-1-4和3-1-1引物组，进行PCR。结果(图33)，在预定位置证实有PCR产物的条带，表明突变型ALS基因以正向插入。如果突变型ALS基因以反向插入，则不可能检测到PCR产物，由于突变型ALS基因部分通过Eco RI消化从pMLH7133-ALS中被切下来，因此没有DNA片段得到扩增。
同时，用所制备的pMLH7133-ALS作为突变型ALS基因5’一侧和pMLH7133连接区的模板，进行测序。另外，由于pMLH7133-ALS导致在大肠杆菌中拷贝数低，因此，通过碱SDS法从体积20倍于标准体积的培养溶液(相当于2ml培养溶液×20)进行制备。因此，显示突变型ALS基因已以正向插入。
(2)将双元载体导入土壤杆菌(Agrobacterium)中将以上(1)中获得的双元载体(pMLH7133-ALS)如下导入土壤杆菌中。将贮藏于-80℃的根癌土壤杆菌EHA105感受态细胞在冰上解冻，然后使用。加入pMLH7133-ALS至含有根癌土壤杆菌EHA105感受态细胞的溶液中，让其在冰中静置15分钟，然后于37℃热激5分钟。然后，让混合物在冰中静置2分钟，向其中加入1ml SOC液体培养基，然后于28℃轻轻振荡2-4小时。接着，进行离心，弃去大部分上清液。将经沉淀的细胞悬浮于剩余的上清液中。将悬浮液涂布到含有卡那霉素和潮霉素各50ppm的LB平板上，然后于28℃温育2-3天，从而获得单菌落。
(3)用导入了pMLH7133-ALS的土壤杆菌转化水稻植物用无菌微型刮刀刮下1/2匙(2)中获得的土壤杆菌，然后在30ml补充10mg/l乙酰丁香酮的表6中所示的AAM培养基(Falcon试管)中充分悬浮。
表6MgSO4-7H2O 250CaCl2-2H2O 150NaH2PO4-2H2O 150KCl3000Fe-EDTA 40 MnSO4-6H2O 10ZnSO4-7H2O 2 CuSO4-5H2O 0.025CoCl2-6H2O 0.025 K1 0.75H3BO3 Na2MoO4-2H2O0.25肌醇 100烟酸 1盐酸吡哆醇 1 盐酸硫胺素 10水解酪蛋白氨基酸 500甘氨酸 7.5L-精氨酸 176.7 L-谷氨酰胺 900L-天冬氨酸 300蔗糖 68.5葡萄糖 36pH 5.2(数字按mg/l表示)用巴氏吸管进行充分吸打，致使不含土壤杆菌块。将所得的悬浮液置于9cm Schale中。
将由种子(Nippon-bare)诱导的并且在表7所示的N6D培养基中预培养的愈伤组织置于不锈钢网(或茶滤过器)中。然后将含有愈伤组织的网在土壤杆菌悬浮液中浸渍1.5-2分钟。此时，浸渍网，致使愈伤组织完全浸入所述细菌溶液中，然后用刮刀轻轻搅拌。随后，将不锈钢网置于无菌滤纸上，以除去过量的细菌溶液。将如此处理的愈伤组织置于如表8所示的2N6AS固体培养基(10mg/l乙酰丁香酮，16个愈伤组织/培养皿)，用手术胶布密封，于28℃避光条件下培养2-3天，直至一薄层细胞覆盖愈伤组织(由于细胞生长所致)。
表7CHU粉末 1包肌醇 100烟酸 0.5盐酸吡哆醇 0.5盐酸硫胺素 12，4-D 2水解酪蛋白氨基酸 300甘氨酸 2脯氨酸 2827蔗糖 30000gelrite 4000羧苄青霉素 500潮霉素 50pH 5.8(数字按mg/l表示)
表8CHU粉末 1包肌醇100烟酸0.5盐酸吡哆醇 0.5盐酸硫胺素 12，4-D 2水解酪蛋白氨基酸300甘氨酸 2蔗糖30g葡萄糖 10ggelrite 4000乙酰丁香酮 10pH 5.2(数字按mg/l表示)在由于共培养3天一薄层细胞覆盖愈伤组织后，用以下方法洗涤愈伤组织，以除去所述土壤杆菌。将如上所述处理的愈伤组织置于不锈钢网(或茶滤过器)，然后将含有愈伤组织的网浸渍在N6D液体培养基(含有500mg/l羧苄青霉素)中。连续进行培养皿的交换，直至培养基不再混浊为止。通过该处理洗去附在愈伤组织上的土壤杆菌。然后，将该网置于无菌滤纸上，以除去过量的水分。将愈伤组织置于N6D固体培养基(含有500mg/l羧苄青霉素和50mg/l潮霉素)，然后在光照条件下于28℃培养2-3周。另外，在该步骤后土壤杆菌再增殖时，以相同的方法进行洗涤，然后将愈伤组织置于新鲜培养基上。
通过在光照条件下于28℃培养2-3周进行选择后，将愈伤组织以9个愈伤组织/培养皿移植到再分化培养基(含有250mg/l羧苄青霉素和50mg/l潮霉素)上，然后在光照条件下于28℃培养2-3周。当叶、茎和根部分分别分化1cm或更长时，将愈伤组织以2-3个愈伤组织/培养皿移植到无激素培养基(含有50mg/l潮霉素)上。随后，当所得的植物体繁殖足以覆盖培养皿时，将植株盘载到培养土(bon sol)中，让其适应。移植时，将附在根上的培养基在水中全部洗去。图34显示上述步骤的流程。
进行上述盆栽的同时，将尚未再分化的愈伤组织部分(9个愈伤组织)(图35)在固体培养基上传代培养，以产生实施例1中所用的双草醚抗性愈伤组织。所述固体培养基含有10μM双草醚。因而，9个愈伤组织中的6个正常生长。将正常生长并且显示双草醚抗性的6个愈伤组织中的1个进行液体培养，然后详细检查对双草醚的药物敏感性。因此，如图36所示，所述愈伤组织显示的双草醚抗性几乎与双点突变基因来源的双草醚抗性Sr系相同。此外，如图37所示，野生型水稻植株(Nippon-bare)的愈伤组织显示双草醚敏感性。因此，在含有10μM双草醚的固体培养基上生长的6个愈伤组织都显示具有强双草醚抗性。
用DNeasy Plant Kit(QIAGEN)，从这些双草醚抗性愈伤组织制备基因组DNA。然后，用基因组DNA作为模板，用其间邻接所述双点突变部分的有义引物(3-1-4SEQ ID NO9)和反义引物(4-83-3SEQ IDNO8)的引物组，进行PCR。因而，如图38所示，正如所预期的，扩增了一种DNA片段。纯化所扩增的DNA片段，然后检查其核苷酸序列(用引物(3-1-4SEQ ID NO9)读出有义链；而用引物(ALS-Rsp25’-AGTCCTGCCATCACCATCCAG-3’SEQ ID NO11)读出反义链)。
图39A和图39B显示分析编码ALS蛋白的位置548的氨基酸的核苷酸周围的核苷酸序列的结果。图39C和图39D显示分析编码ALS蛋白的位置627的氨基酸的核苷酸周围的核苷酸序列的结果。如图39A-D所示，对于这些系的双点突变而言，发现野生型和突变体的异源序列。因此，表明突变型ALS基因掺入所述基因组中。另外，9个愈伤组织中的3个在10μM双草醚存在下生长不太好。然而，认为这是由于所导入的双点突变ALS基因的低表达量引起的。
在盆栽的80株潮霉素抗性转化水稻植株中，在5叶期正常生长的那些水稻植株有27株已导入突变型ALS基因的植株，且有46株已导入野生型ALS基因的植株。含有其中导入的野生型ALS基因的植株往往比其中含有突变型ALS基因的那些植株生长更健壮。此时，对4株含有其中导入的突变型ALS基因的植株和5株含有其中导入的野生型ALS基因的植株进行适当选择，并且将补充0.2％表面活性剂K的1kg a.i./ha双草醚盐喷洒到叶和茎上。喷洒后约40天进行生长调查的结果示于图40中。在图40中，植株A的长度约90cm。
如图40所示，含有其中导入的突变型ALS基因的单株的生长几乎正常(A)，并且表明所述植株具有双草醚抗性。用DNeasy Plant Kit(QIAGEN)，从双草醚抗性转化水稻植株制备基因组DNA。然后，用基因组DNA作为模板，用其间邻接双点突变部分的有义引物(3-1-4SEQ ID NO9)和反义引物(4-83-3SEQ ID NO8)的引物组，进行PCR。以与上述愈伤组织相同的方式检查所得的DNA片段的核苷酸序列。因此，证实了在所述转化水稻植株中存在双点突变。
本文引用的所有出版物、专利和专利申请通过引用全部结合到本文中。
本发明的效应如上文详细描述的，本发明可以提供编码ALS酶的ALS基因，所述ALS酶对所有抑制ALS的除草剂都有良好的抗性并且显示对PC除草剂有极高水平的抗性。
序列表<110>组合化学工业株式会社(KUMIAI CHEMICAL INDUSTRY CO.，LTD)<120>编码乙酰乳酸合成酶的基因<130>PH-1273PCT<150>JP 2000-362630<151>2000-11-29<160>11<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>644<212>PRT<213>Oryza sativa var.Kinmaze<400>1Met Ala Thr Thr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Leu Ser Ala Ala Ala1 5 10 15Thr Ala Lys Thr Gly Arg Lys Asn His Gln Arg His His Val Leu Pro20 25 30Ala Arg Gly Arg Val Gly Ala Ala Ala Val Arg Cys Ser Ala Val Ser35 40 45Pro Val Thr Pro Pro Ser Pro Ala Pro Pro Ala Thr Pro Leu Arg Pro50 55 60Trp Gly Pro Ala Glu Pro Arg Lys Gly Ala Asp Ile Leu Val Glu Ala65 70 75 80Leu Glu Arg Cys Gly Val Ser Asp Val Phe Ala Tyr Pro Gly Gly Ala85 90 95Ser Met Glu Ile His Gln Ala Leu Thr Arg Ser Pro Val Ile Thr Asn100 105 110
His Leu Phe Arg His Glu Gln Gly Glu Ala Phe Ala Ala Ser Gly Tyr115 120 125Ala Arg Ala Ser Gly Arg Val Gly Val Cys Val Ala Thr Ser GlyPro130 135 140Gly Ala Thr Asn Leu Val Ser Ala Leu Ala Asp Ala Leu Leu Asp Ser145 150 155 160Val Pro Met Val Ala Ile Thr Gly Gln Val Pro Arg Arg Met Ile Gly165 170 175Thr Asp Ala Phe Gln Glu Thr Pro Ile Val Glu Val Thr Arg Ser Ile180 185 190Thr Lys His Asn Tyr Leu Val Leu Asp Val Glu Asp Ile Pro Arg Val195 200 205Ile Gln Glu Ala Phe Phe Leu Ala Ser Ser Gly Arg Pro Gly Pro Val210 215 220Leu Val Asp Ile Pro Lys Asp Ile Gln Gln Gln Met Ala Val Pro Val225 230 235 240Trp Asp Thr Ser Met Asn Leu Pro Gly Tyr Ile Ala Arg Leu Pro Lys245 250 255Pro Pro Ala Thr Glu Leu Leu Glu Gln Val Leu Arg Leu Val Gly Glu260 265 270Ser Arg Arg Pro Ile Leu Tyr Val Gly Gly Gly Cys Ser Ala Ser Gly275 280 285Asp Glu Leu Arg Trp Phe Val Glu Leu Thr Gly Ile Pro Val Thr Thr290 295 300Thr Leu Met Gly Leu Gly Asn Phe Pro Ser Asp Asp Pro Leu Ser Leu305 310 315 320Arg Met Leu Gly Met His Gly Thr Val Tyr Ala Asn Tyr Ala Val Asp325 330 335
Lys Ala Asp Leu Leu Leu Ala Phe Gly Val Arg Phe Asp Asp Arg Val340 345 350Thr Gly Lys Ile Glu Ala Phe Ala Ser Arg Ala Lys Ile Val His Ile355 360 365Asp Ile Asp Pro Ala Glu Ile Gly Lys Asn Lys Gln Pro His Val Ser370 375 380Ile Cys Ala Asp Val Lys Leu Ala Leu Gln Gly Leu Asn Ala Leu Leu385 390 395 400Gln Gln Ser Thr Thr Lys Thr Ser Ser Asp Phe Ser Ala Trp His Asn405 410 415Glu Leu Asp Gln Gln Lys Arg Glu Phe Pro Leu Gly Tyr Lys Thr Phe420 425 430Gly Glu Glu Ile Pro Pro Gln Tyr Ala Ile Gln Val Leu Asp Glu Leu435 440 445Thr Lys Gly Glu Ala Ile Ile Ala Thr Gly Val Gly Gln His Gln Met450 455 460Trp Ala Ala Gln Tyr Tyr Thr Tyr Lys Arg Pro Arg Gln Trp Leu Ser465 470 475 480Ser Ala Gly Leu Gly Ala Met Gly Phe Gly Leu Pro Ala Ala Ala Gly485 490 495Ala Ser Val Ala Asn Pro Gly Val Thr Val Val Asp Ile Asp Gly Asp500 505 510Gly Ser Phe Leu Met Asn Ile Gln Glu Leu Ala Leu Ile Arg Ile Glu515 520 525Asn Leu Pro Val Lys Val Met Val Leu Asn Asn Gln His Leu Gly Met530 535 540Val Val Gln Leu Glu Asp Arg Phe Tyr Lys Ala Asn Arg Ala His Thr545 550 555 560
Tyr Leu Gly Asn Pro Glu Cys Glu Ser Glu Ile Tyr Pro Asp Phe Val565 570 575Thr Ile Ala Lys Gly Phe Asn Ile Pro Ala Val Arg Val Thr Lys Lys580 585 590Ser Glu Val Arg Ala Ala Ile Lys Lys Met Leu Glu Thr Pro Gly Pro595 600 605Tyr Leu Leu Asp Ile Ile Val Pro His Gln Glu His Val Leu Pro Met610 615 620Ile Pro Ile Gly Gly Ala Phe Lys Asp Met Ile Leu Asp Gly Asp Gly625 630 635 640Arg Thr Val Tyr<210>2<211>2279<212>DNA<213>Oryza sativa var.Kinmaze<400>2ctcgccgccg ccgccgccgc caccacccac catggctacg accgccgcgg ccgcggccgc 60cgccctgtcc gccgccgcga cggccaagac cggccgtaag aaccaccagc gacaccacgt 120ccttcccgct cgaggccggg tgggggcggc ggcggtcagg tgctcggcgg tgtccccggt 180caccccgccg tccccggcgc cgccggccac gccgctccgg ccgtgggggc cggccgagcc 240ccgcaagggc gcggacatcc tcgtggaggc gctggagcgg tgcggcgtca gcgacgtgtt 300cgcctacccg ggcggcgcgt ccatggagat ccaccaggcg ctgacgcgct ccccggtcat 360caccaaccac ctcttccgcc acgagcaggg cgaggcgttc gcggcgtccg ggtacgcgcg 420cgcgtccggc cgcgtcgggg tctgcgtcgc cacctccggc cccggggcaa ccaacctcgt 480gtccgcgctc gccgacgcgc tgctcgactc cgtcccgatg gtcgccatca cgggccaggt 540cccccgccgc atgatcggca ccgacgcctt ccaggagacg cccatagtcg aggtcacccg 600ctccatcacc aagcacaatt accttgtcct tgatgtggag gacatccccc gcgtcataca 660ggaagccttc ttcctcgcgt cctcgggccg tcctggcccg gtgctggtcg acatccccaa 720ggacatccag cagcagatgg ccgtgccggt ctgggacacc tcgatgaatc taccagggta 780catcgcacgc ctgcccaagc cacccgcgac agaattgctt gagcaggtct tgcgtctggt 840Dtggcgagtca cggcgcccga ttctctatgt cggtggtggc tgctctgcat ctggtgacga 900attgcgctgg tttgttgagc tgactggtat cccagttaca accactctga tgggcctcgg 960
caatttcccc agtgacgacc cgttgtccct gcgcatgctt gggatgcatg gcacggtgta 1020cgcaaattat gccgtggata aggctgacct gttgcttgcg tttggtgtgc ggtttgatga 1080tcgtgtgaca gggaaaattg aggcttttgc aagcagggcc aagattgtgc acattgacat 1140tgatccagca gagattggaa agaacaagca accacatgtg tcaatttgcg cagatgttaa 1200gcttgcttta cagggcttga atgctctgct acaacagagc acaacaaaga caagttctga 1260ttttagtgca tggcacaatg agttggacca gcagaagagg gagtttcctc tggggtacaa 1320aacttttggt gaagagatcc caccgcaata tgccattcag gtgctggatg agctgacgaa 1380aggtgaggca atcatcgcta ctggtgttgg gcagcaccag atgtgggcgg cacaatatta 1440cacctacaag cggccacggc agtggctgtc ttcggctggt ctgggcgcaa tgggatttgg 1500gctgcctgct gcagctggtg cttctgtggc taacccaggt gtcacagttg ttgatattga 1560tggggatggt agcttcctca tgaacattca ggagctggca ttgatccgca ttgagaacct 1620ccctgtgaag gtgatggtgt tgaacaacca acatttgggt atggtggtgc aattggagga 1680taggttttac aaggcgaata gggcgcatac atacttgggc aacccggaat gtgagagcga 1740gatatatcca gattttgtga ctattgctaa ggggttcaat attcctgcag tccgtgtaac 1800aaagaagagt gaagtccgtg ccgccatcaa gaagatgctc gagactccag ggccatactt 1860gttggatatc atcgtcccgc accaggagca tgtgctgcct atgatcccaa ttgggggcgc 1920attcaaggac atgatcctgg atggtgatgg caggactgtg tattaatcta taatctgtat 1980gttggcaaag caccagcccg gcctatgttt gacctgaatg acccataaag agtggtatgc 2040ctatgatgtt tgtatgtgct ctatcaataa ctaaggtgtc aactatgaac catatgctct 2100tctgttttac ttgtttgatg tgcttggcat ggtaatccta attagcttcc tgctgtctag 2160gtttgtagtg tgttgttttc tgtaggcata tgcatcacaa gatatcatgt aagtttcttg 2220tcctacatat caataataag agaataaagt acttctatgt aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 2279<210>3<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>3CATCACCAAC CACCTCTT 18<210>4<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>4ACACGGACTG CAGGAATA 18<210>5<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>5TTACAAGGCG AATAGGGC 18<210>6<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>6GGAAACAGCT ATGACCATG19<210>7<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>7GCTCTGCTAC AACAGAGCAC A 21
<210>8<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>8GCTTTGCCAA CATACAG 17<210>9<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>9AGGTGTCACA GTTGTTG 17<210>10<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>10GCATCTTCTT GAATGGCG 18<210>11<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>11AGTCCTGCCA TCACCATCCA G 2权利要求
1.一种编码以下蛋白质(a)或(b)的基因(a)一种包含SEQ ID NO1的氨基酸序列的蛋白质；(b)一种包含从SEQ ID NO1的氨基酸序列通过取代、缺失或添加至少一个或多个氨基酸而获得的氨基酸序列、对嘧啶基羧基除草剂具有抗性以及具有乙酰乳酸合酶活性的蛋白质。
2.一种乙酰乳酸合酶蛋白，所述乙酰乳酸合酶蛋白由权利要求1的基因编码。
3.一种重组载体，所述重组载体具有权利要求1的基因。
4.一种转化体，所述转化体具有权利要求3的重组载体。
5.一种植物，所述植物具有权利要求1的基因并且对嘧啶基羧基除草剂具有抗性。
6.一种培育权利要求5的植物的方法，所述方法包括在嘧啶基羧基除草剂的存在下培育所述植物。
7.一种应用权利要求1的基因作为选择标记来选择具有所述基因的转化细胞的方法。
全文摘要
一种编码针对基于PC的除草剂显示极高抗性的ALS蛋白的基因。即一种编码以下蛋白质(a)或(b)的基因。(a)一种包含SEQ ID NO1所示的氨基酸序列的蛋白质。(b)一种包含从SEQ ID NO1所示的氨基酸序列通过取代、缺失或添加至少一个氨基酸而获得的氨基酸序列并且对嘧啶基羧基除草剂具有抗性以及具有乙酰乳酸合酶活性的蛋白质。
文档编号C12N15/60GK1487998SQ01822268
公开日2004年4月7日 申请日期2001年11月16日 优先权日2000年11月29日
发明者清水力, 中山礎, 永山孝三, 福田笃德, 田中喜之, 角康一郎, 三, 之, 德, 郎 申请人:组合化学工业株式会社, 独立行政法人农业生物资源研究所