专利名称：内源和非内源型人g蛋白偶联受体的制作方法
技术领域：
本发明涉及跨膜受体，在一些实施方案中涉及G蛋白偶联受体，在一些优选实施方案中涉及受到改变以建立或增强所述受体的组成型活性的内源GPCR。在一些实施方案中，使用组成型活化的GPCR直接鉴定候选化合物中具有治疗剂应用性的受体激动剂或反激动剂(inverse agonist)。
背景技术：
虽然人体内存在许多受体家族，但目前最丰富并且与治疗最相关的是G蛋白偶联受体(GPCR)家族。据估计，人类基因组中有约30,000-40,000个基因，估计其中约2％编码GPCR。已经鉴定其内源配体的受体(包括GPCR)称为“已知”受体，而未鉴定内源配体的受体称为“孤独”受体。
GPCR是发展医药产品的重要领域从100种已知GPCR中的约20种发展出全部处方药中约60％的药品。例如，在1999年，在头100个品牌的处方药中，下面药物与GPCR相互作用(圆括号内指所治疗的疾病和/或紊乱)Claritin(变态反应) Prozac(抑郁) Vasotec(高血压)Paxil(抑郁) Zoloft(抑郁) Zyprexa(精神病)Cozaar(高血压) Imitrex(偏头痛) Zantac(反流)Propulsid(反流病) Risperdal(精神分裂Serevent(哮喘)症)Pepcid(反流)Gaster(溃疡) Atrovent(支气管痉挛)Effexor(抑郁) Depakote(癫痫)Cardura(前列腺肥大)Allegra(变态反应) Lupron(前列腺癌) Zoladex(前列腺癌)Diprivan(感觉缺 BuSpar(焦虑) Ventolin(支气管痉失) 挛)Hytrin(高血压) Wellbutrin(抑郁) Zyrtec(鼻炎)Plavix(MI/中风) Toprol-XL(高血压) Tenormin(咽峡炎)Xalatan(青光眼) Singulair(哮喘) Diovan(高血压)Harnal(前列腺增生)
(Med Ad News 1999年数据)。
GPCR共同具有一个共有结构基序，该基序包含七个由22到24个疏水氨基酸组成的序列，这七个序列形成七个α螺旋，每个α螺旋都跨膜(用数字标示跨膜数，即跨膜-1(TM-1)、跨膜-2(TM-2)等)。所述跨膜螺旋由细胞膜外面或“外侧”的在跨膜-2和跨膜-3、跨膜-4和跨膜-5、以及跨膜-6和跨膜-7之间的氨基酸链连接(这些氨基酸链分别称为“胞外”区1、2和3(EC-1、EC-2和EC-3))。所述跨膜螺旋也由细胞膜里面或“内侧”的在跨膜-1和跨膜-2、跨膜-3和跨膜-4、以及跨膜-5和跨膜-6之间的氨基酸链连接(这些氨基酸链分别称为“胞内”区1、2和3(IC-1、IC-2和IC-3))。所述受体的“羧基”(“C”)末端在细胞内的胞内间隙，所述受体的“氨基”(“N”)末端在细胞外的胞外间隙。
一般地说，当内源配体结合所述受体时(通常称为所述受体的“活化”)，在胞内区发生构象改变，允许在所述胞内区和胞内“G-蛋白”间发生偶联。据报道，GPCR与G蛋白是“滥交的”，即GPCR能够与一种以上的G蛋白相互作用。见Kenakin，T.，43 Life Sciences 1095(1988)。虽然存在其它G蛋白，但目前已经鉴定的G蛋白是Gq、Gs、Gi、Gz和Go。与G蛋白偶联的配体活化的GPCR起始信号级联过程(称为“信号转导”)。在正常条件下，信号转导最终导致细胞活化或细胞抑制。虽然不希望受到理论的限制，但认为IC-3回环以及所述受体的羧基末端与所述G蛋白相互作用。
在生理条件下，GPCR存在于细胞膜上，处于两种不同构象间的平衡“失活”状态和“活性”状态。失活状态的受体不能进入信号转导途径以起始导致生物学反应的信号转导。改变所述受体构象到活性状态使得能够进入转导途径(通过G蛋白)并产生生物学反应。
可以通过配体或化合物如药物将受体稳定于活性状态。最近的发现提供了除配体或药物以外促进和稳定所述受体于活性构象的方法，所述最近的发现包括但不只限于修饰所述受体的氨基酸序列。这些方法通过刺激配体结合所述受体的效应，有效稳定所述受体于活性状态。通过所述独立于配体的方式获得的稳定称为“组成型受体活化”。
发明简述本文公开人GPCR的内源形式和非内源形式以及它们的应用。
本发明的一些实施方案涉及由SEQ.ID.NO.2的氨基酸序列编码的G蛋白偶联受体、所述受体的非内源组成型活化形式以及包含它们的宿主细胞。
本发明的一些实施方案涉及包含载体以及SEQ.ID.NO.1的cDNA的质粒，以及包含所述质粒的宿主细胞。
本发明的一些实施方案涉及由SEQ.ID.NO.4的氨基酸序列编码的G蛋白偶联受体、所述受体的非内源组成型活化形式以及包含它们的宿主细胞。
本发明的一些实施方案涉及包含载体以及SEQ.ID.NO.3的cDNA的质粒、所述质粒的非内源组成型活化形式、以及包含它们的宿主细胞。
本发明的一些实施方案涉及由SEQ.ID.NO.6的氨基酸序列编码的G蛋白偶联受体、所述受体的非内源组成型活化形式以及包含它们的宿主细胞。
本发明的一些实施方案涉及包含载体以及SEQ.ID.NO.5的cDNA的质粒，以及包含所述质粒的宿主细胞。
本发明的一些实施方案涉及由SEQ.ID.NO.8的氨基酸序列编码的G蛋白偶联受体、所述受体的非内源组成型活化形式以及包含它们的宿主细胞。
本发明的一些实施方案涉及包含载体以及SEQ.ID.NO.7的cDNA的质粒、所述质粒的非内源组成型活化形式、以及包含它们的宿主细胞。
本发明的一些实施方案涉及由SEQ.ID.NO.10的氨基酸序列编码的G蛋白偶联受体、所述受体的非内源组成型活化形式以及包含它们的宿主细胞。
本发明的一些实施方案涉及包含载体以及SEQ.ID.NO.9的cDNA的质粒，以及包含所述质粒的宿主细胞。
本发明的一些实施方案涉及由SEQ.ID.NO.12的氨基酸序列编码的G蛋白偶联受体、所述受体的非内源组成型活化形式以及包含它们的宿主细胞。
本发明的一些实施方案涉及包含载体以及SEQ.ID.NO.11的cDNA的质粒，以及包含所述质粒的宿主细胞。
本发明的一些实施方案涉及由SEQ.ID.NO.14的氨基酸序列编码的G蛋白偶联受体、所述受体的非内源组成型活化形式以及包含它们的宿主细胞。
本发明的一些实施方案涉及包含载体以及SEQ.ID.NO.13的cDNA的质粒，以及包含所述质粒的宿主细胞。
本发明的一些实施方案涉及由SEQ.ID.NO.16的氨基酸序列编码的G蛋白偶联受体、所述受体的非内源组成型活化形式以及包含它们的宿主细胞。
本发明的一些实施方案涉及包含载体以及SEQ.ID.NO.15的cDNA的质粒，以及包含所述质粒的宿主细胞。
本发明的一些实施方案涉及由SEQ.ID.NO.18的氨基酸序列编码的G蛋白偶联受体、所述受体的非内源组成型活化形式以及包含它们的宿主细胞。
本发明的一些实施方案涉及包含载体以及SEQ.ID.NO.17的cDNA的质粒，以及包含所述质粒的宿主细胞。
本发明的一些实施方案涉及由SEQ.ID.NO.20的氨基酸序列编码的G蛋白偶联受体、所述受体的非内源组成型活化形式以及包含它们的宿主细胞。
本发明的一些实施方案涉及包含载体以及SEQ.ID.NO.19的cDNA的质粒，以及包含所述质粒的宿主细胞。
附图简述
图1图示使用293细胞在测量肌醇磷酸(IP3)积累的第二信使测定中，RUP32、Gq(del)/Gi、与Gq(del)/Gi共转染的RUP32以及CMV(对照；表达载体)的活化。
图2图示内源形式RUP35和RUP36与对照(“CMV”)相比引起的第二信使IP3产生。
发明详述围绕受体发展的科学文献已经应用许多术语来命名对受体有各种效应的配体。为清楚和一致性，在整个本专利文件中将使用下面定义。当这些定义与这些术语的其它定义矛盾时，以下面定义为准激动剂应当指这样的物质(如配体、候选化合物)当所述物质结合受体时，活化细胞内反应或增加GTP与膜结合。在一些实施方案中，激动剂是那些以前未知当结合受体时活化细胞内反应或增加GTP结合膜的物质。
本文使用的氨基酸缩写在表A中陈述
表A
拮抗剂应当指这样的物质(如配体、候选化合物)所述物质与激动剂竞争结合受体的同一位点，但不活化所述受体的活性形式所起始的细胞内反应，因此能够抑制激动剂的细胞内反应。拮抗剂不减少在缺乏激动剂时的基础细胞内反应。在一些实施方案中，拮抗剂是那些以前未知当结合受体时活化细胞内反应或增加GTP结合膜的物质。
候选化合物应当指应用筛选技术进行筛选的分子(例如但不限于化合物)。优选词组“候选化合物”不包括公众已知的选自以下的化合物以前根据间接鉴定方法确定的受体的反激动剂、激动剂或拮抗剂(“间接鉴定的化合物”)；更优选不包括以前已经确定在至少一种哺乳动物中具有治疗功效的间接鉴定的化合物；最优选不包括以前已经确定在人体内有治疗应用的间接鉴定的化合物。
组合物指包括至少一种成份的物质；“药用组合物”是组合物的一个例子。
化合物功效应当指与受体结合亲和力相比，化合物抑制或刺激受体功能的能力(即活化/抑制信号转导途径)的度量。检测化合物功效的示例性方法在本专利文件的实施例部分公开。
密码子应当指三个核苷酸(或核苷酸的等同物)的组合，所述核苷酸一般包括与磷酸基团偶联的核苷(腺苷(A)、鸟苷(G)、胞苷(C)、尿苷(U)和胸苷(T))，所述核苷酸的组合在翻译时编码一个氨基酸。
组成型活化的受体应当指受到组成型受体活化作用的受体。组成型活化的受体可以是内源或非内源的。
组成型受体活化应当指稳定所述受体于活性状态，所述稳定使用除以下方法以外的方法完成受体与配体或其化学等同物结合。
接触应当指不论在体外系统或体内系统中，使至少两个部分接近。
直接鉴定或直接鉴定的就词组“候选化合物”而言，应当指针对组成型活化的受体筛选候选化合物并评价所述化合物的功效，所述组成型活化的受体优选是组成型活化的孤独受体，最优选是组成型活化的G蛋白偶联细胞表面孤独受体。该词组在任何情况下都不应解释或理解为包括或包括于词组“间接鉴定”或“间接鉴定的”。
内源应当指哺乳动物天然产生的物质。内源就例如但不限于术语“受体”而言，应当指由哺乳动物(例如但不限于人)或病毒天然生产。与此不同，本文中的非内源应当指不是由哺乳动物(例如但不限于人)或病毒天然生产。例如但不限于此实例，当一种受体处于内源形式时并非组成型有活性，但经过操作后成为组成型有活性的受体，则所述受体最优选在本文中称为“非内源组成型活化的受体”。这两个术语都可以用于描述“体内”和“体外”系统。例如但不限于此实例，在筛选方法中，内源或非内源的受体可以指体外筛选系统。作为另一个例子但不限于此实例，当已经操作哺乳动物的基因组以包括非内源组成型活化的受体时，通过体内系统筛选候选化合物是可行的。
G蛋白偶联受体融合蛋白和GPCR融合蛋白在本文公开的上下文中，都指非内源蛋白，所述非内源蛋白包括与至少一种G蛋白、最好所述G蛋白的α亚单位(该亚单位是结合GTP的亚单位)融合的内源组成型活化的GPCR或非内源组成型活化的GPCR，所述G蛋白最好与天然偶联所述内源孤独GPCR的G蛋白同一类型。例如但不限于此实例，在内源状态，假如G蛋白“Gsα”是与GPCR偶联的主要G蛋白，那么基于特定GPCR的GPCR融合蛋白是包含与Gsα融合的GPCR的非内源蛋白；在一些情况下，如下文陈述，可以将非主要G蛋白与所述GPCR融合。所述G蛋白可以直接与所述组成型活化GPCR融合，或者在二者之间有间隔区。
宿主细胞应当指能够在其中加入质粒和/或载体的细胞。在原核宿主细胞的情况下，质粒通常在宿主细胞复制时作为自主分子复制(一般随后分离所述质粒以引入真核宿主细胞)；在真核宿主细胞的情况下，将质粒整合进所述宿主细胞的细胞DNA，以便当所述真核宿主细胞复制时，所述质粒复制。在一些实施方案中，所述宿主细胞是真核细胞，更优选是哺乳动物细胞，最优选选自293、293T和COS-7细胞。
间接鉴定或间接鉴定的指药物发现过程的传统方法，所述传统方法涉及鉴定特异性针对内源受体的内源配体，针对所述受体筛选候选化合物以确定那些干扰和/或竞争所述配体-受体相互作用的化合物，以及评价所述化合物影响与所述活化受体有关的至少一种第二信使途径的功效。
抑制就术语“反应”而言，应当指与不存在化合物的情况相比，所述化合物的存在降低或预防反应。
反激动剂应当指这样的物质(如配体、候选化合物)所述化合物结合所述受体的内源形式或所述受体的组成型活化形式，并抑制由所述受体的活化形式起始的基础细胞内反应，使其降到在不存在激动剂的情况下所观察到的正常基础活性水平以下，或者减少GTP结合膜。优选与不存在所述反激动剂的情况下的基础反应相比，存在所述反激动剂抑制所述基础细胞内反应至少30％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、最优选至少99％。
已知受体应当指这样的内源受体已经鉴定特异性针对所述受体的内源配体。
配体应当指特异性针对天然受体的分子。
突变的或突变就内源受体的核酸序列和/或氨基酸序列而言，应当指对所述内源序列作出的特定一个改变或多个改变，以便所述内源非组成型活化的受体表现所述受体的组成型活化。就特定序列的等同物而言，在以下情况下人受体的随后突变形式被认为是所述人受体第一个突变的等同物(a)人受体的随后突变形式的组成型活化水平基本与所述受体第一个突变表现的水平相同；和(b)所述受体的随后突变形式与所述受体的第一个突变之间的序列(氨基酸和/或核酸)同一性百分率是至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％和最优选至少99％。在一些实施方案中，考虑到本文公开的用于获得组成型活化的一些优选盒在所述GPCR的内源形式和非内源形式之间包括单氨基酸和/或密码子改变，优选序列同一性百分率应当至少98％。
非孤独受体应当指特异性针对已鉴定配体的内源天然分子，其中配体与受体的结合活化细胞内信号途径。
孤独受体应当指这样的内源受体未鉴定特异性针对所述受体的内源配体，或者所述配体是未知的。
药用组合物应当指包括至少一种活性成份的组合物，因此组合物适合在哺乳动物(例如但不限于人)中研究特定有效效果。本领域一般技术人员能够理解和评价根据技术人员的需要适于检测活性成份是否具有所需要的效果的技术。
质粒应当指载体和cDNA的组合。一般地说，将质粒引入宿主细胞以便复制所述cDNA和/或表达所述cDNA成为蛋白。
第二信使应当指作为受体活化结果而产生的细胞内反应。第二信使可以包括，例如，肌醇三磷酸(IP3)、二酰甘油(DAG)、环状AMP(cAMP)和环状GMP(cGMP)。可以测量第二信使反应以确定受体活化。此外，可以测量第二信使反应以直接鉴定候选化合物，所述候选化合物包括，例如，反激动剂、激动剂和拮抗剂。
信噪比应当指响应活化、增强或刺激而产生的信号，其中所述信号比在无活化、无增强或无刺激的情况下的背景噪音或基础水平强。
间隔区应当指位于基因(例如目的GPCR)最后一个密码子或最后一个氨基酸之后、但在目的G蛋白起始密码子或开始区之前的翻译的数个氨基酸，其中所述翻译的数个氨基酸符合读框地置于所述目的G蛋白的开始区内。可以根据技术人员的需要定制所述翻译的氨基酸的数量，该数量一般从约一个氨基酸、优选二个氨基酸、更优选三个氨基酸、更优选四个氨基酸、更优选五个氨基酸、更优选六个氨基酸、更优选七个氨基酸、更优选八个氨基酸、更优选九个氨基酸、更优选十个氨基酸、更优选十一个氨基酸、甚至更优选十二个氨基酸。
刺激就术语“反应”而言，应当指与不存在化合物的情况相比，所述化合物的存在增强反应。
实质上应当指结果在对照结果的40％以内、优选35％以内、更优选30％以内、更优选25％以内、更优选20％以内、更优选15％以内、更优选10％以内、更优选5％以内、更优选2％以内、最优选1％以内。例如，在受体功能性情况下，假如根据本文教导的方法或技术人员已知的相似方法测量，所转导的信号在对照信号产生的信号40％以内，则测试受体可能表现与对照受体实质上相似的结果。
载体就cDNA而言，应当指能够在其中加入至少一种cDNA并且本身能够掺入宿主细胞的环状DNA。
下面部分的顺序是为了陈述方便，不是并且不应解释为限制下面的公开内容或权利要求。
A.介绍受体的传统研究一般根据一个先验假设(基于历史)进行必须首先鉴定内源配体，然后进一步发现可能影响所述受体的拮抗剂和其它分子。甚至在首先已知拮抗剂的情况下，研究也立即延伸到寻找内源配体。甚至在发现组成型活化的受体后，该思维模式仍然在受体研究中持续。因此，以前没有认识到的是受体的活性状态对于发现所述受体的激动剂和反激动剂是最有用的。对于那些由过度活性的受体或活性不足的受体引起的疾病，治疗药物的需要是分别减少受体活性状态或增强受体活性的化合物，而不一定是内源配体的拮抗剂药物。这是因为减少或增强活性受体状态活性的化合物不一定与内源配体结合同一位点。因此，根据本发明教导的方法，任何寻找治疗化合物的研究应当从筛选对独立于配体的活性状态的化合物开始。
B.鉴定人GPCR人类基因组计划的实施已经鉴定位于人基因组内关于核酸序列的过多信息；在该努力过程中，可以获得遗传序列信息而不理解或认识任何特定基因组序列是否包含或可能包含翻译成人蛋白质的可读框信息。鉴定人基因组内核酸序列的几种方法在本领域内一般技术人员的能力范围内。例如但不限于此实例，本文公开的多种人GPCR是通过搜索GenBankTM数据库发现的。下面的表B列出我们已经发现的几种内源GPCR，以及与所公开的GPCR同源的其它GPCR。
表B
受体同一性用于获得所述受体在人体内作用的认识。随着本专利文件的进一步说明，将会讨论突变这些受体以建立这些受体的非内源组成型活化形式的技术。
本文公开的技术也可应用于本领域内已知的其它人GPCR，这对于本领域内技术人员是显而易见的。
C.筛选受体针对本文公开的GPCR的非内源组成型活化形式筛选候选化合物允许直接鉴定作用于细胞表面受体的候选化合物，而不要求应用所述受体的内源配体。人们使用常规的通常商业化可得的技术，能够确定本文公开的人GPCR的所述内源形式在体内表达和/或过量表达的部位。受体表达定位于特定组织使科学家能够确定所述受体的生理功能。也有可能使用这些技术确定与所述受体的表达和/或过量表达有关的相关疾病/紊乱状态；本专利文件公开这样的方法。此外，受体在疾病器官中的表达能够帮助人们确定所述受体临床相关性的重要性。
本文公开的组成型表达的GPCR基于距假定位于GPCR的TM6内的脯氨酸残基的距离；该算法技术在共同未决及共同转让的专利文件PCT申请号PCT/US99/23938中公开，该专利文件在2000年4月20日作为WO 00/22129公开，与本文列出的其它专利文件一起通过引用结合到本文中。所述算法技术不基于传统的序列“排列对比”，而是基于距前述TM6脯氨酸残基的特定距离(当然，或者是所述脯氨酸残基的内源组成型取代)。通过突变从该残基(假设位于所述受体的IC3区)开始的位于16氨基酸残基的氨基酸残基到最优选赖氨酸残基，可以组成型活化所述受体。可以在该位点的突变中使用其它氨基酸残基以达到该目的，这将在下文详细讨论。
D.鉴定和/或筛选疾病/紊乱如下文所述，可以通过本发明的方法鉴定所述非内源组成型活化GPCR的反激动剂和激动剂。所述反激动剂和激动剂是用作前驱化合物的理想候选物，用于寻找治疗与该受体有关的疾病的药物发现程序。因为能够直接鉴定针对所述GPCR的反激动剂并因此允许发展药用组合物，相应地寻找与所述GPCR相关的疾病和紊乱。将受体表达定位于特定组织为科学家提供分配所述受体生理功能的能力。例如，扫描疾病组织样品和正常组织样品中GPCR的存在目前不仅仅是学术运用，人们可以使用该方法鉴定针对特定GPCR的内源配体。可以对广泛范围的健康组织和疾病组织进行组织扫描。所述组织扫描为将特定受体与疾病和/或紊乱联系提供潜在的第一步。此外，在疾病器官中表达受体能够帮助人们确定所述受体临床相关性的重要性。
可以使用GPCR的DNA序列制造探针/引物。在一些优选实施方案中，使用所述DNA序列制造探针用于(a)针对组织mRNA进行斑点杂交分析，和/或(b)RT-PCR鉴定所述受体在组织样品中的表达。受体在源组织或疾病组织中的存在、或者所述受体在疾病组织中以比正常组织更高的浓度存在可以用于将定位与功能联系起来，指出所述受体的生理作用/功能，并创建治疗疗法，用于治疗包括但不限于与所述功能/作用相关的疾病。用该技术也可以将受体定位于器官的区。根据所述受体定位的特定组织的已知或假定作用/功能，可以推导所述受体的推定生理功能。例如但不限于此实例，在丘脑区域内定位/表达的蛋白与感觉运动处理和觉醒有关(见Goodman &Gilman’s，The Pharmacological Basis of Therapeutics，第9版，第465页(1996))。在海马或许旺细胞内表达的蛋白分别与学习和记忆以及外周神经的髓鞘形成有关(见Kandel，E.等，Essentials of Neural Scienceand Behavior分别在第657、680和28页(1995))。
E.筛选候选化合物1.GPCR类筛选测定技术当G蛋白受体组成型活化时，它结合G蛋白(如Gq、Gs、Gi、Gz、Go)并刺激GTP结合所述G蛋白。所述G蛋白随后作为GTP酶起作用，水解GTP成为GDP，由此所述受体在正常条件下失活。然而，组成型活化的受体继续转化GDP成为GTP。一种GTP的不可水解的类似物[35S]GTPγS可以用于监测表达组成型活化受体的膜的增强结合。据报道，[35S]GTPγS可用于在配体存在和不存在的情况下监测G蛋白偶联膜。在其它众所周知并且本领域内技术人员使用的例子中，该监测的一个例子由Traynor和Nahorski在1995年报道。该测定系统的应用一般是用于候选化合物的初步筛选，因为该系统可普遍应用于所有G蛋白偶联受体，包括与受体细胞内结构域相互作用的特定G蛋白。
2.特异性GPCR筛选测定技术一旦使用“类”G蛋白偶联受体测定(用于选择成为激动剂或反激动剂的化合物的测定)鉴定候选化合物，优选进行进一步的筛选，确认所述化合物在所述受体位点有相互作用。例如，通过所述“类”测定鉴定的化合物不一定结合所述受体，但可能仅使所述G蛋白从所述细胞内域上“解偶联”。
a.Gs、Gz和Gi。
Gs刺激腺苷酸环化酶。另一方面，Gi(以及Gz和Go)抑制腺苷酸环化酶。腺苷酸环化酶催化ATP到cAMP的转化；因此，偶联Gs蛋白的组成型活化GPCR与cAMP细胞内水平增加有关。另一方面，偶联GI(或Gz、Go)蛋白的组成型活化GPCR与cAMP细胞内水平降低有关。一般可见，”突触传递的间接机制”，第8章，From Neuron toBrain(第3版)Nichols，J.G.等编辑，Sinauer Associates，Inc.(1992)。因此，可以利用检测cAMP的测定确定候选化合物是否是例如所述受体的反激动剂(即所述化合物会降低cAMP的水平)。可以利用本领域内已知的测量cAMP的多种方法；最优选的方法依赖于应用基于ELISA模式的抗cAMP抗体。可以利用的其它类型测定是全细胞第二信使报道系统测定。基因启动子驱动特定基因编码的蛋白的表达。环状AMP通过如下机制驱动基因表达环状AMP促进cAMP反应性DNA结合蛋白或转录因子(CREB)的结合，所述cAMP反应性DNA结合蛋白或转录因子随后结合特定位点的启动子(cAMP反应元件)并驱动所述基因表达。可以构建报道系统，所述报道系统在报道基因(如β-半乳糖苷酶或萤光素酶)之前具有包含多个cAMP反应元件的启动子。因此，组成型活化Gs偶联的受体导致cAMP的积累，而cAMP的积累随后活化基因，导致所述报道基因的表达。随后使用标准生物化学测定(Chen等1995)检测报道蛋白如β-半乳糖苷酶或萤光素酶。
b.Go和Gq。
Gq和Go与磷脂酶C的活化有关，而磷脂酶C随后水解磷脂PIP2，释放两种细胞内信使二酰甘油(DAG)和肌醇1，4，5-三磷酸(IP3)。IP3积累的增加与Gq和Go相关受体的活化有关。一般可见，”突触传递的间接机制”，第8章，From Neuron to Brain(第3版)Nichols，J.G.等编辑Sinauer Associates，Inc.(1992)。可以利用检测IP3积累的测定来确定候选化合物是否是例如Gq和Go相关受体的反激动剂(即所述化合物降低IP3的水平)。也可以使用AP1报道测定检查Gq相关受体，其中依赖于Gq的磷脂酶导致包含AP1元件的基因活化；因此，活化的Gq相关受体将表现所述基因的表达增加，由此其反激动剂将表现所述基因表达的降低，而激动剂将表现所述表达的增加。可以获得这种检测的商业化测试。
3.GPCR融合蛋白应用内源组成型活化GPCR或非内源组成型活化GPCR进行筛选候选化合物以直接鉴定反激动剂造成一个有趣的筛选难题，因为根据定义，受体甚至在缺乏与其结合的内源配体时也是有活性的。因此，为了区分如在存在候选化合物情况下的非内源受体以及在不存在候选化合物情况下的非内源受体，这种区分的目的在于了解所述化合物是否是反激动剂或激动剂或对所述受体没有影响，优选利用能够增强所述区分的方法。优选方法是应用GPCR融合蛋白。
一般地说，一旦使用上文所述测定技术(以及其它的技术)确定非内源GPCR已经组成型活化，就有可能确定偶联所述内源GPCR的主要G蛋白。偶联所述G蛋白到所述GPCR提供能够评价的信号途径。在一些实施方案中，优选使用哺乳动物表达系统进行筛选，预期所述系统将在其中包括内源G蛋白。因此，根据定义，在所述系统中，所述非内源组成型活化GPCR将持续给出信号。在一些实施方案中，优选增强所述信号，以便在例如所述受体的反激动剂存在下，更有可能更容易地在筛选情况下区分与所述反激动剂接触的受体。
所述GPCR融合蛋白将增强与所述非内源GPCR偶联的G蛋白的功效。所述GPCR融合蛋白优选用于内源组成型活化GPCR或非内源组成型活化GPCR的筛选，因为所述方法增强在所述筛选技术中利用的信号。这对于获得有效的“信噪”比是重要的；筛选如本文公开的候选化合物优选所述信噪比。
构建用于表达GPCR融合蛋白的构建物在本领域内一般技术人员的能力范围内。商业化表达载体和系统提供适合研究者具体需要的各种方法。构建所述GPCR融合蛋白构建物的重要标准包括但不限于所述内源GPCR序列和所述G蛋白序列都符合读框(最好所述内源GPCR的序列在所述G蛋白序列上游)，并且所述GPCR的“终止”密码子缺失或受到取代，以便表达所述GPCR时也能够表达所述G蛋白。其它实施方案包括这样的构建物在所述构建物中所述内源GPCR序列和所述G蛋白序列不符合读框和/或所述“终止”密码子没有缺失或受到取代。所述GPCR可以直接连接所述G蛋白，或者在二者之间有间隔区残基(虽然残基数量可以容易地由本领域内技术人员确定，但最好不超过约12)。从方便的需要考虑，优选使用间隔区。偶联所述非内源GPCR的所述G蛋白已经在制造所述GPCR融合蛋白构建物前得到鉴定。因为仅有少数G蛋白得到鉴定，所以优选获取包含所述G蛋白序列的构建物(即通用G蛋白构建物(见实施例))以在其中插入内源GPCR序列；这使大规模筛选多种具有不同序列的不同内源GPCR的效率更高。
如上文所述，预期偶联Gi、Gz和Go的组成型活化GPCR抑制cAMP的形成，这使得基于这些GPCR类型的测定成为可能(即cAMP信号在活化时降低，因此使得直接鉴定如反激动剂(反激动剂将进一步降低该信号)成为可能)。如下文公开，我们已经确定对于这些类型受体，有可能创造不基于所述GPCR内源G蛋白的GPCR融合蛋白，以便建立可行的基于环化酶的测定。因此，例如，内源Gi偶联受体可以与Gs蛋白融合-所述融合构建物表达时“驱动”或“驱使”所述内源GPCR偶联如Gs而不是“天然”Gi蛋白，以便可以建立基于环化酶的测定。因此，对于Gi、Gz和Go偶联受体，在一些实施方案中，当使用GPCR融合蛋白并且所述测定基于对腺苷酸环化酶的检测时，优选使用Gs(或者刺激腺苷酸环化酶形成的等同G蛋白)建立所述融合构建物。
同等有效的是利用与Gs、Gi、Gz或Go蛋白融合的Gq蛋白的G蛋白融合构建物。在一些实施方案中，可以使用Gq蛋白获得优选的融合构建物，所述Gq蛋白缺失G蛋白α亚单位(“Gαq”)的头六(6)个氨基酸，并且Gαq的C末端的最后五(5)个氨基酸被目的G蛋白Gα的对应氨基酸取代。例如，融合构建物可以具有与Gi蛋白融合的Gq(缺失6个氨基酸)，产生“Gq/Gi融合构建物”。该融合构建物将驱使内源Gi偶联受体与其非内源G蛋白Gq偶联，以便可以测量第二信使(例如肌醇三磷酸或二酰甘油)以替代测量cAMP产生。
4.靶Gi偶联GPCR与信号增强剂Gs偶联GPCR的共转染(基于cAMP的测定)已知Gi偶联受体抑制腺苷酸环化酶，并因此降低cAMP产量的水平，这使得评价cAMP的水平成为可能。测量cAMP产量降低(在活化时主要偶联Gi的受体组成型活化的指标)的有效技术能够如下完成共转染信号增强剂和与Gi连接的GPCR，所述信号增强剂例如是活化时主要偶联Gs的非内源组成型活化受体(如下文公开的TSHR-A623I)。明显的是，可以根据cAMP产量的增加测定Gs偶联受体的组成型活化。Gi偶联受体的组成型活化导致cAMP产量减少。因此，所述共转染方法将有利地利用这些“对立”效应。例如共转染非内源组成型活化的Gs偶联受体(所述“信号增强剂”)以及所述内源Gi偶联受体(所述“靶受体”)，提供基础cAMP信号(即虽然所述Gi偶联受体会降低cAMP水平，但该“增加”对于组成型活化的Gs偶联信号增强剂建立的cAMP水平实质性增加是相对的)。然后通过共转染所述信号增强剂与所述靶受体的组成型活化形式，预期cAMP将由于所述Gi靶的活性增加(即降低cAMP)而相对于基础进一步降低。
然后可以使用基于cAMP的测定筛选候选化合物，其中相对于应用所述内源受体/G蛋白融合体有两个“改变”首先，相对所述Gi偶联的靶受体，将会产生“对立”效应，即所述Gi偶联靶受体的反激动剂会增加测量的cAMP信号，而所述Ci偶联靶受体的激动剂将降低该信号；第二，明显的是，应该独立评价使用该方法直接鉴定的候选化合物，以保证它们并不靶向所述信号增强受体(这可以在针对所述共转染受体进行筛选之前或之后完成)。
F.药物化学一般而言，但并不是在所有情况下，将通过组合化学技术产生化合物与直接鉴定候选化合物结合起来进行，由此随机制备用于所述分析的几千种化合物。一般地说，所述筛选将产生具有独特核心结构的化合物；此后，围绕优选核心结构对这些化合物进行其它化学修饰，进一步增强它们的药物特性。所述技术是本领域内技术人员已知的，并且将不在本专利文件中详细说明。
G.药用组合物可以将选出用于进一步发展的候选化合物使用本领域内技术人员众所周知的技术配制成药用组合物。合适的药学上可接受的载体是本领域内技术人员知道的；例如，见Remington’s PharmaceuticalSciences，第16版，1980，Mack Publishing Co.，(Osol等编辑)。
H.其它应用虽然本文公开的GPCR的非内源形式的优选应用是直接鉴定用作反激动剂或激动剂(最好用作药物)的候选化合物，但这些形式的GPCR有其它应用。例如，可以利用加入GPCR的体外系统和体内系统进一步阐明和了解这些受体在人体状况(正常或疾病)中的作用，以及了解当其应用于信号级联时组成型活化的作用。在一些实施方案中，优选所述内源受体是“孤独受体”，即未鉴定针对所述受体的内源配体。因此，在一些实施方案中，可以使用所述修饰的非内源GPCR了解内源受体在人体内的作用，然后因此鉴定内源配体。也可以使用所述内源配体进一步阐明已知受体以及通过所述受体转导信号的途径。特别是研究本专利文件后，所述公开受体的其它应用对于本领域内技术人员将变得明显。
实施例为阐明本发明提供下面的实施例，而不是限制本发明。虽然本文公开了具体的核酸序列和氨基酸序列，但本领域内一般技术人员能够对这些序列做小的修饰并获得与下文报道结果相同或基本相似的结果。从一种序列到另一种序列(如从大鼠受体到人受体或从人受体A到人受体B)应用或了解序列盒的传统方法一般建立在序列排列对比技术的基础上，使用所述技术排列对比所述序列，以确定共有区域。本文公开的突变方法并不依赖于该技术，而是建立在算法方法以及距人GPCR的TM6区内保守脯氨酸残基的位置距离。一旦掌握该方法，本领域内的技术人员就有能力对此做出小的修饰并获得与本文公开的结果实质上相同的结果(即组成型活化)。所述修饰方法被认为在本公开物的范围内。
实施例1内源性人GPCR1.鉴定人GPCR在搜索GenBankTM数据库信息的基础上鉴定所公开的内源性人GPCR。在搜索所述数据库时，鉴定得到下表(表C)所示的cDNA克隆表C
2.全长克隆a.hRUP28(Seq.Id.Nos.1&2)在应用GenBank数据信息的基础上鉴定公开的人RUP28。当搜索所述数据库时，鉴定出登记号AC073957的cDNA克隆，该克隆是来自染色体7的人基因组序列。
使用成人肝Marathon-ReadyTMcDNA(Clontech)作为模板，用下列引物通过PCR克隆全长RUP285′-CAGAGCTCTGGTGGCCACCTCTGTCC-3′(SEQ.ID.NO.21；有义链，5′的起始密码子)，5′-CTGCGTCCACCAGAGTCACGTCTCC-3′(SEQ.ID.NO.22；反义链，3′的终止密码子)。
使用AdvantageTMcDNA聚合酶(Clontech)在50μl反应物中按下面循环进行扩增，其中步骤2到4重复35次95℃5分钟；94℃30秒钟；58℃30秒钟；72℃1分钟30秒；和72℃7分钟。
从1％琼脂糖凝胶分离出一个1.16kb的PCR片段，克隆进pCRII-TOPO载体(Invitrogen)，使用ABI Big染料终止试剂盒(P.E.Biosystems)测序。见SEQ.ID.NO.1的核酸序列和SEQ.ID.NO.2推定的氨基酸序列。
b.hRUP29(Seq.Id.Nos.3&4)在应用GenBank数据信息的基础上鉴定公开的人RUP29。当搜索所述数据库时，鉴定出登记号AC0083865的cDNA克隆，该克隆是来自染色体7的人基因组序列。
使用人基因组DNA作为模板，用下列引物通过PCR克隆全长RUP295′-GTATGCCTGGCCACAATACCTCCAGG-3′(SEQ.ID.NO.23；有义链，包含起始密码子)，5′-GTTTGTGGCTAACGGCACAAAACACAATTCC-3′(SEQ.ID.NO.24；反义链，包含终止密码子)。
使用TaqPlusPrecision DNA聚合酶(Stratagene)在50μl反应物中按下面循环进行扩增，其中步骤2到4重复35次95℃5分钟；94℃30秒钟；54℃30秒钟；72℃1分钟30秒；和72℃7分钟。
从1％琼脂糖凝胶分离出一个930bp的PCR片段，克隆进pCRII-TOPO载体(Invitrogen)，使用ABI Big染料终止试剂盒(P.EBiosystems)测序。
使用人白细胞和卵巢Marathon-ReadyTMcDNA(Clontech)快速扩增cDNA末端(RACE)，确定RUP29 cDNA的精确5′末端。使用具有下面序列的RUP29特异性引物(1)5′-GGTACCACAATGACAATCACCAGCGTCC-3′(SEQ.ID.NO.25)和AP1引物(Clontech)进行第一轮PCR反应，具有下面序列的RUP29特异性引物(2)5′-GGAACGTGAGGTACATGTGGATGTGCAGC-3′(SEQ.ID.NO.26)和AP2引物(Clontech)进行第二轮PCR反应。分离所述RACE反应的产物，克隆进pCRII-TOPO载体(Invitrogen)并测序。见SEQ.ID.NO.3的核酸序列和SEQ.ID.NO.4的推定氨基酸序列。
c.hRUP30(Seq.Id.Nos.5&6)在应用GenBank数据信息的基础上鉴定公开的人RUP30。当搜索所述数据库时，鉴定出登记号AC055863的cDNA克隆，该克隆是来自染色体17的人基因组序列。
如下通过5′RACE-PCR克隆全长RUP30使用人胰腺Marathon-ReadyTMcDNA(Clontech)作为模板，用下面寡核苷酸5′-GCAGTGTAGCGGTCAACCGTGAGCAGG-3′(SEQ.ID.NO.27；有义链，包含起始密码子)和AP1引物(Clontech)进行第一轮RT-PCR，使用寡核苷酸5′-TGAGCAGGATGGCGATCCAGACTGAGGCGTGG-3′(SEQ.ID.NO.28；反义链，包含终止密码子)和AP2引物(Clontech)进行第二轮PCR。将通过所述5′RACE-PCR产生的DNA片段克隆进pCRII-TOPO载体(Invitrogen)，使用SP6/T7引物(Stratagene)测序。
根据所述5′RACE产物的序列，使用人胰腺Marathon-ReadyTMcDNA(Clontech)作为模板，用下面引物通过RT-PCR克隆全长RUP305′-GAGGTACAGCTGGCGATGCTGACAG-3′(SEQ.ID.NO.29；有义链，ATG为起始密码子)，5′-GTGGCCATGAGCCACCCTGAGCTCC-3′(SEQ.ID.NO.30；反义链，3′的终止密码子)。
使用Taq DNA聚合酶(Stratagene)在50μl反应物中按下面循环进行扩增，其中步骤2到4重复35次94℃40秒钟；94℃20秒钟；64℃20秒钟；72℃2分钟；和72℃5分钟。
从1％琼脂糖凝胶分离出一个1.2kp的PCR片段，克隆进pCRII-TOPO载体(Invitrogen)，使用ABI Big染料终止试剂盒(P.E.Biosystems)测序几个克隆。见SEQ.ID.NO.5的核酸序列和SEQ.ID.NO.6的推定氨基酸序列。
d.hRUP31(Seq.Id.Nos.7&8)在应用GenBank数据信息的基础上鉴定公开的人RUP31。当搜索所述数据库时，鉴定出登记号AL356214的cDNA克隆，该克隆是来自染色体10的人基因组序列。
使用人乳腺Marathon-ReadyTMcDNA(Clontech)作为模板，用下列引物通过RT-PCR克隆全长RUP315′-GGAATGTCCACTGAATGCGCGCGG-3′(SEQ.ID.NO.31；有义链，包含起始密码子)，5′-AGCTCGCCAGGTGTGAGAAACTCGG-3′(SEQ.ID.NO.32；反义链，3′的终止密码子)。
使用AdvantageTMcDNA聚合酶(Clontech)在50μl反应物中按下面循环进行扩增，其中步骤2到4重复35次94℃40秒钟；94℃20秒钟；66℃20秒钟；72℃1分钟30秒；和72℃5分钟。
从1％琼脂糖凝胶分离出一个1.1kb的PCR片段，克隆进pCRII-TOPO载体(Invitrogen)，使用ABI Big染料终止试剂盒(P.E.Biosystems)测序。见SEQ.ID.NO.7的核酸序列和SEQ.ID.NO.8推定的氨基酸序列。
e.hRUP32(Seq.Id.Nos.9&10)在应用GenBank数据信息的基础上鉴定公开的人RUP32。当搜索所述数据库时，鉴定出登记号AL513524的cDNA克隆，该克隆是来自染色体6的人基因组序列。
使用人基因组DNA(Clontech)作为模板，用下列引物通过PCR克隆全长RUP325′-GCGTTATGAGCAGCAATTCATCCCTGCTGG-3′(SEQ.ID.NO.33；有义链，包含起始密码子)，5′-GTATCCTGAACTTCGTCTATACAACTGC-3′(SEQ.ID.NO.34；反义链)。
使用TaqPlusPrecision DNA聚合酶(Stratagene)按下面循环进行扩增，其中步骤2到4重复35次94℃3分钟；94℃20秒钟；58℃20秒钟；72℃1分钟30秒；和72℃7分钟。
从1％琼脂糖凝胶分离出一个1.06kb的PCR片段，克隆进pCRII-TOPO载体(Invitrogen)，使用ABI Big染料终止试剂盒(P.E.Biosystems)测序。见SEQ.ID.NO.9的核酸序列和SEQ.ID.NO.10推定的氨基酸序列。
f.hRUP33(Seq.Id.Nos.11&12)在应用GenBank数据信息的基础上鉴定公开的人RUP33。当搜索所述数据库时，鉴定出登记号AL513524的cDNA克隆，该克隆是来自染色体6的人基因组序列。
使用人基因组DNA(Clontech)作为模板，用下列引物通过PCR克隆全长RUP335′-CCCTCAGGAATGATGCCCTTTTGCCACAA-3′(SEQ.ID.NO.35；有义链，包含起始密码子)，
5′-ATCCATGTGGTTGGTGCATGTGGTTCGT-3′(SEQ.ID.NO.36；反义链)。
使用TaqPlusPrecision DNA聚合酶(Stratagene)按下面循环进行扩增，其中步骤2到4重复35次94℃3分钟；94℃20秒钟；56℃20秒钟；72℃1分钟30秒；和72℃7分钟。
从1％琼脂糖凝胶分离出一个1.1kb的PCR片段，克隆进pCRII-TOPO载体(Invitrogen)，使用ABI Big染料终止试剂盒(P.E.Biosystems)测序。见SEQ.ID.NO.11的核酸序列和SEQ.ID.NO.12推定的氨基酸序列。
g.hRUP32(Seq.Id.Nos.13&14)在应用GenBank数据信息的基础上鉴定公开的人RUP34。当搜索所述数据库时，鉴定出登记号AL513524的cDNA克隆，该克隆是来自染色体6的人基因组序列。
使用人基因组DNA(Clontech)作为模板，用下列引物通过PCR克隆全长RUP325′-AAACAACAAACAGCAGAACCATGACCAGC-3′(SEQ.ID.NO.37；有义链，包含起始密码子)，5′-ACATAGAGACAAGTGACATGTGTGAACCAC-3′(SEQ.ID.NO.38；反义链)。
使用TaqPlusPrecision DNA聚合酶(Stratagene)按下面循环进行扩增，其中步骤2到4重复35次94℃3分钟；94℃20秒钟；60℃20秒钟；72℃1分钟30秒；和72℃7分钟。
从1％琼脂糖凝胶分离出一个1.27kb的PCR片段，克隆进pCRII-TOPO载体(Invitrogen)，使用ABI Big染料终止试剂盒(P.E.Biosystems)测序。见SEQ.ID.NO.13的核酸序列和SEQ.ID.NO.14推定的氨基酸序列。
h.hRUP35(Seq.Id.Nos.15&16)在应用GenBank数据信息的基础上鉴定公开的人RUP35。当搜索所述数据库时，鉴定出登记号AC021089的cDNA克隆，该克隆是来自染色体16的人基因组序列。
使用人胎儿脑Marathon-ReadyTMcDNA(Clontech)作为模板，通过5′RACE-PCR确定RUP35的5′序列。用寡核苷酸5′-GGTATGAGACCGTGTGGTACTTGAGC-3′(SEQ.ID.NO.39；有义链)和AP1引物(Clontech)进行第一轮RT-PCR，使用寡核苷酸5′-GTGGCAGACAGCGATATACTGTCAATGG-3′(SEQ.ID.NO.40；反义链)和AP2引物(Clontech)进行第二轮PCR。将通过所述5′RACE-PCR产生的DNA片段克隆进pCRII-TOPO载体(Invitrogen)，使用SP6/T7引物(Stratagene)测序。
根据所述5′RACE产物的序列，使用人脑Marathon-ReadyTMcDNA(Clontech)作为模板，用下面引物通过RT-PCR克隆全长RUP305′-GCGCTCATGGAGCACACGCACGCCCAC-3′(SEQ.ID.NO.41；有义链，ATG是起始密码子)，5′-GAGGCAGTAGTTGCCACACCTATGG-3′(SEQ.ID.NO.42；反义链，3′的终止密码子)。使用AdvantageTMcDNA聚合酶(Clontech)，在100μl反应物中按下面循环进行扩增，其中步骤2到4重复45次95℃2分钟；95℃20秒钟；60℃20秒钟；72℃1分钟30秒；和72℃5分钟。
从1％琼脂糖凝胶分离出一个1.0kp的PCR片段，克隆进pCRII-TOPO载体(Invitrogen)，使用ABI Big染料终止试剂盒(P.E.Biosystems)测序。见SEQ.ID.NO.15的核酸序列和SEQ.ID.NO.16的推定氨基酸序列。
i.hRUP36(Seq.Id.Nos.17&18)在应用GenBank数据信息的基础上鉴定公开的人RUP36。当搜索所述数据库时，鉴定出登记号AC090099的cDNA克隆，该克隆是来自染色体11的人基因组序列。
使用人基因组DNA(Clontech)作为模板，用下列引物通过PCR克隆全长RUP365′-CATCTGGTTTGTGTTCCCAGGGGCACCAG-3′(SEQ.ID.NO.43；义链，5′的起始密码子)，5′-GACAGTGTTGCTCTCAAAGTCCCGTCTGACTG-3′(SEQ.ID.NO.44；反义链，3′的终止密码子)。使用TaqPlusPrecisionDNA聚合酶(Stratagene)在50μl反应物中按下面循环进行扩增，其中步骤2到4重复30次95℃，5分钟；95℃30秒钟；70℃30秒钟；72℃1分钟30秒；和72℃7分钟。
从1％琼脂糖凝胶分离出一个1.0kb的PCR片段，克隆进pCRII-TOPO载体(Invitrogen)，使用ABI Big染料终止试剂盒(P.E.Biosystems)测序。见SEQ.ID.NO.17的核酸序列和SEQ.ID.NO.18推定的氨基酸序列。
j.hRUP37(Seq.Id.Nos.19&20)在应用GenBank数据信息的基础上鉴定公开的人RUP37。当搜索所述数据库时，鉴定出登记号AC090099的cDNA克隆，该克隆是来自染色体11的人基因组序列。
使用人基因组DNA(Clontech)作为模板，用下列引物通过PCR克隆全长RUP375′-CTGTTTCCAGGGTCATCAGACTGGG-3′(SEQ.ID.NO.45；有义链)，5′-GCAGCATTGCTCTCAAAGTCCTGTCTG-3′(SEQ.ID.NO.46；反义链)。使用TaqPlusPrecision DNA聚合酶(Stratagene)按下面循环进行扩增，其中步骤2到4重复35次95℃5分钟；95℃30秒钟；62℃30秒钟；72℃1分钟30秒；和72℃7分钟。
从1％琼脂糖凝胶分离出一个969碱基对的PCR片段，克隆进pCRII-TOPO载体(Invitrogen)，使用ABI Big染料终止试剂盒(P.E.Biosystems)测序。见SEQ.ID.NO.19的核酸序列和SEQ.ID.NO.20推定的氨基酸序列。
实施例2制备非内源组成型活化的GPCR本领域内技术人员能够选择用于突变核酸序列的技术。下文是用于生产上文公开的几种人GPCR的非内源形式的方法。下文公开的突变基于算法方法，由此距保守脯氨酸(或因此内源保守取代)残基开始的第16个氨基酸(位于所述GPCR的IC3区内)优选突变为丙氨酸、组氨酸、精氨酸或赖氨酸残基，最优选突变为赖氨酸残基。
1.Transformer Site-DirectedTM诱变可以使用例如Transformer Site-DirectedTM诱变试剂盒(Clontech)，按照生产商的指导，从人GPCR制备非内源性人GPCR。在一些实施方案中，使用两种诱变引物，最好是一种产生赖氨酸突变的赖氨酸诱变寡核苷酸以及一种选择标记寡核苷酸。为方便，以标准形式(表D)标出加入所述人GPCR的密码子突变表D
实施例3受体表达虽然本领域内技术人员可以使用多种细胞表达蛋白，但优选利用哺乳动物细胞。主要原因在于实用性，即虽然利用例如酵母细胞表达GPCR是可能的，但这在方法中引入不包含哺乳动物系统进化出的受体偶联、遗传机制和分泌途径(在酵母的情况下确实不包括这些)的非哺乳动物细胞，因此，在非哺乳动物细胞内获得的结果虽然可能是有用的，但更优选使用哺乳动物细胞获得的结果。在哺乳动物细胞中，虽然可以根据技术人员的需要选择所利用的特定哺乳动物细胞，但尤其优选COS-7、293和293T细胞。
a.瞬间转染第一天，接种293细胞，6×106细胞/10cm碟。第二天，制备两个反应管(每管含一碟的用量)管A在0.5ml无血清DMEM(GibcoBRL)中含4μg DNA(如pCMV载体；携带受体cDNA的pCMV载体等)；管B在0.5ml无血清DMEM中含24μl脂质转染胺试剂(GibcoBRL)。颠倒几次，混合管A和管B，然后在室温下温育30-45分钟。该混合物称为“转染混合物”。用1XPBS洗涤接种的293细胞，然后加入5ml无血清DMEM。在细胞中加入1ml所述转染混合物，然后在37℃/5％CO2温育4小时。吸走除去所述转染混合物，随后加入10ml DMEM/10％胎牛血清。在37℃/5％CO2温育细胞。温育48小时后，收获细胞用于分析。
b.稳定的细胞系将约12×106293细胞接种到15cm组织培养板，在含10％胎牛血清和百分之一丙酮酸钠、L-谷氨酸和抗生素的DME High Glucose培养基中培养。接种293细胞二十四小时后(达到约80％汇合)，用12μg DNA转染所述细胞。将所述12μg DNA与60μl脂质转染胺试剂和2mL无血清DME High Glucose培养基混合。从所述平板吸走除去所述培养基，用无血清培养基洗所述细胞一次。将所述DNA、脂质转染胺试剂和培养基混合物以及10mL无血清培养基加入所述平板。在37℃温育四到五小时后，洗走除去所述培养基，然后加入25ml含血清的培养基。转染后二十四小时，再次吸走除去培养基，然后加入含血清的新鲜培养基。转染后四十八小时，吸走除去培养基，然后加入含终浓度500μg/mL遗传霉素(G418药物)的含血清培养基。然后选择转染细胞中含G418抗性基因的阳性转染细胞。选择过程中每四到五天更换一次培养基。选择过程中，培养细胞产生稳定的集合体，或传代以选择稳定的克隆。
实施例4确定非内源GPCR组成型活性的测定可以使用各种方法评价非内源性人GPCR的组成型活性。下面是说明性的；本领域内技术人员能够确定最适合技术人员需要的那些技术。
1.膜结合测定[35S]GTPγS测定当G蛋白偶联受体由于配体结合或组成型活化而处于活性状态时，所述受体偶联G蛋白，刺激GDP释放以及GTP随后结合所述G蛋白。所述G蛋白受体复合物α亚单位作为GTP酶起作用，缓慢水解GTP成为GDP，一般在此之后所述受体失活。组成型活化的受体继续转换GTP与GDP。可以利用GTP的不可水解类似物[35S]GTPγS证明[35S]GTPγS增强与膜表达的组成型活化受体的结合。使用[35S]GTPγS结合来测量组成型活化的好处包括但不限于以下(i)它可普遍应用于所有G蛋白偶联受体；(b)它接近膜表面，这使它较不可能拾起(pick-up)影响细胞内级联反应的分子。
所述测定利用G蛋白偶联受体刺激[35S]GTPγS结合表达相关受体的膜。因此，所述测定可以用于直接鉴定方法中，筛选针对组成型活化的G蛋白偶联受体的候选化合物。所述测定是通用的，可应用于所有G蛋白偶联受体的药物发现。
所述[35S]GTPγS测定在下面组合物中温育1小时20mM HEPES和1到约20mM MgCl2(虽然优选20mM，但为针对优化结果而调整该量)pH7.4、含约0.3到约1.2nM[35S]GTPγS的结合缓冲液(虽然优选1.2，但可以为优化结果而调整该量)和12.5到75μg膜蛋白(如表达所述Gs融合蛋白的293细胞；可以为优化而调整该量)以及10μMGDP(可以为优化改变量)。随后加入麦胚凝集素珠(25μl；Amersham)，所述混合物在室温下继续温育30分钟。所述管随后在室温下于1500xg离心5分钟，然后用闪烁计数器计数。
2.腺苷酸环化酶改造设计用于基于细胞测定的Flash PlateTM腺苷酸环化酶试剂盒(New England Nuclear；Cat.No.SMP004A)，将其用于粗质膜。FlashPlate孔可以包含闪烁包被物，所述包被物也包含识别cAMP的特异性抗体。通过与放射性cAMP示踪物直接竞争与所述cAMP抗体的结合，定量在孔内产生的cAMP。下面是测量表达所述受体的全细胞内cAMP水平变化的方法的简短描述。
瞬间转染约二十四小时后收获转染细胞。小心地吸出并弃去培养基。在每碟细胞中温和加入10ml PBS，然后小心吸出。每平板加入1ml Sigma细胞解离缓冲液和3ml PBS。用移液管将细胞吸出平板，将所述细胞悬浮液收集入50ml圆锥形离心管。细胞在室温下于1,100rpm离心5分钟。小心地重悬浮细胞沉淀于合适体积的PBS(约3ml/平板)。然后使用血细胞仪计数细胞，补充加入PBS，获得足够数量的细胞(达到约50μl/孔的终体积)。
按照厂家指导制备和维持cAMP标准和检测缓冲液(在11ml检测缓冲液内含1μCi示踪物[125I cAMP(50μl)])。新鲜制备用于筛选的测定缓冲液，所述测定缓冲液含50μl刺激缓冲液、3μl测试化合物(12μM最终测定浓度)和50μl细胞，将所述测定缓冲液保存在冰上直到使用。在合适孔内加入50μl cAMP标准，然后在H-11和H12孔加入50μl PBSA，开始测定。在所有孔内加入50μl刺激缓冲液。使用能够分配3μl化合物溶液的加样工具(pin tool)，在合适孔内加入DMSO(或选定候选化合物)，达到12μM测定化合物的终浓度和100μl总测定体积。然后在孔内加入细胞，在室温下温育60分钟。然后在孔内加入100μl含示踪cAMP的检测混合物。继续温育平板2小时，然后使用Wallac MicroBetaTM闪烁计数器计数。每块测定平板都制作标准cAMP曲线，根据所述标准cAMP曲线外推cAMP/孔的值。
3.用于Gi偶联靶GPCR的基于细胞的cAMPTSHR是Gs偶联GPCR，在活化时引起cAMP积累。通过突变氨基酸残基623(即将丙氨酸残基改变为异亮氨酸残基)组成型活化TSHR。预期Gi偶联受体抑制腺苷酸环化酶，并因此降低cAMP产量水平，这使得测定cAMP水平成为可能。测量cAMP产量降低(Gi偶联受体组成型活化的指标)的有效技术是共转染作为“信号增强剂”的最优选非内源组成型活化TSHR(TSHR-A623I)(或内源组成型活化Gs偶联受体)以及Gi连接的靶GPCR，建立基础cAMP水平。在创造所述Gi偶联受体的非内源形式后，使用所述靶GPCR的该非内源形式与所述信号增强剂共转染，可以使用所述物质进行筛选。当使用cAMP测定时，可以使用该方法有效产生信号；最好使用该方法针对Gi偶联受体直接鉴定候选化合物。注意到对于Gi偶联GPCR，当使用该方法时，所述靶GPCR的反激动剂增加cAMP信号，而激动剂降低cAMP信号。
第一天，接种2×104293细胞/孔。第二天，制备两个反应管(每管含一碟的用量)管A如下制备混合转染进哺乳动物细胞的每种受体2ug DNA，在1.2ml无血清DMEM(Irvine Scientific，Irvine，CA)中总量含4μg DNA(如pCMV载体；携带突变THSR(TSHR-A623I)的pCMV载体；TSHR-A623I和GPCR等)；管B如下制备在1.2ml无血清DMEM中混合120μl脂质转染胺试剂(Gibco BRL)。颠倒几次，混合管A和管B，然后在室温下温育30-45分钟。该混合物称为“转染混合物”。用1XPBS洗涤接种的293细胞，然后加入10ml无血清DMEM。在细胞中加入2.4ml所述转染混合物，然后在37℃/5％CO2温育4小时。吸走除去所述转染混合物，随后加入25mlDMEM/10％胎牛血清。在37℃/5％CO2温育细胞。温育24小时后，收获细胞用于分析。
可以根据技术人员需要，改造设计用于基于细胞测定的FlashPlateTM腺苷酸环化酶试剂盒(New England Nuclear；Cat.No.SMP004A)，将其用于粗质膜。Flash Plate孔可以包含闪烁包被物，所述包被物也包含识别cAMP的特异性抗体。通过与放射性cAMP示踪物直接竞争与所述cAMP抗体的结合，定量在孔内产生的cAMP。下面是测量表达所述受体的全细胞内cAMP水平变化的方法的简短描述。
瞬间转染约二十四小时后收获转染细胞。小心地吸出并弃去培养基。在每碟细胞中温和加入10ml PBS，然后小心吸出。每平板加入1ml Sigma细胞解离缓冲液和3ml PBS。用移液管将细胞吸出平板，将所述细胞悬浮液收集入50ml圆锥形离心管。细胞在室温下于1,100rpm离心5分钟。小心地重悬浮细胞沉淀于合适体积的PBS(约3ml/平板)。然后使用血细胞仪计数细胞，补充加入PBS，获得足够数量的细胞(达到约50μl/孔的终体积)。
按照厂家指导制备和维持cAMP标准和检测缓冲液(在11ml检测缓冲液内含1μCi示踪物[125I cAMP(50μl)])。新鲜制备用于筛选的测定缓冲液，所述测定缓冲液含50μl刺激缓冲液、3μl测试化合物(12μM最终测定浓度)和50μl细胞，将所述测定缓冲液保存在冰上直到使用。在合适孔内加入50μl cAMP标准，然后在H-11和H12孔加入50μl PBSA，开始测定。在所有孔内加入50μl刺激缓冲液。使用能够分配3μl化合物溶液的加样工具，在合适孔内加入选定化合物(如TSH)，达到12μM测定化合物的终浓度和100μl总测定体积。然后在孔内加入细胞，在室温下温育60分钟。然后在孔内加入100μl含示踪cAMP的检测混合物。继续温育平板2小时，然后使用WallacMicroBeta闪烁计数器计数。每块测定平板都制作标准cAMP曲线，根据所述标准cAMP曲线外推cAMP/孔的值。
4.基于报道物的测定a.CRE-LUC报道物测定(Gs-偶联受体)将293细胞和293T细胞以每孔2×104细胞的密度接种在96孔板上，第二天按照生产厂家的指导用脂质转染胺试剂(BRL)进行转染。如下制备用于每6孔转染的DNA/脂质混合物将在100μl DMEM内的260ng质粒DNA与100μl DMEM内的2μl脂质温和混合(所述260ng质粒DNA包含200ng 8xCRE-Luc报道质粒、50ng含内源报道物或非内源报道物的pCMV或单独的pCMV、以及10ng GPRS表达质粒(在pcDNA3(Invitrogen)内的GPRS)。如下制备所述8XCRE-Luc报道质粒将大鼠促生长素抑制素启动子(-71/+51)克隆进pβgal-Basic质粒(Clontech)的BglV-HindIII位点，获得载体SRIF-β-gal。由腺病毒模板AdpCF126CCRE8(见7 Human Gene Therapy 1883(1996))通过PCR获得cAMP反应元件的八个(8)拷贝，克隆进SRIF-β-gal载体的Kpn-BglV位点，产生8xCRE-β-gal报道载体。用得自pGL3-基础载体(Promega)HindIII-BamHI位点的萤光素酶基因取代8xCRE-β-gal报道载体的β-半乳糖苷酶基因，产生8xCRE-Luc报道质粒。在室温下温育30分钟后，用400μl DMEM稀释所述DNA/脂质混合物，每孔加入100μl所述稀释物。在细胞培养箱内温育4小时后，每孔加入100μl含10％FCS的DMEM。第二天所述转染细胞更换到200μl/孔含10％FCS的DMEM。八小时后，用PBS洗孔一次，然后更换为100μl/孔不含酚红的DMEM。第二天使用LucLiteTM报道基因测定试剂盒(Packard)根据生产商的指导测定萤光素酶活性，在1450 MicroBetaTM闪烁发光计数器(Wallac)上读数。
b.AP1报道测定(Gq结合受体)检测Gq刺激作用的方法是基于如下已知特性依赖于Gq的磷脂酶C引起在启动子中含AP1元件的基因活化。可以利用PathdetectTMAP-1顺式报道系统(Stratagene，目录号219073)，采用上文关于CREB报道测定陈述的方法，只是磷酸钙沉淀的成分是410ng pAP1-Luc、80ng pCMV-受体表达质粒和20ng CMV-SEAP。
c.SRF-LUC报道测定(Gq结合受体)检测Gq刺激的方法是基于如下已知特性依赖于Gq的磷脂酶C引起在启动子中含血清反应因子的基因活化。可以利用PathdetectTMSRF-Luc报道系统(Stratagene)，在如COS7细胞内测定Gq偶联活性。使用Mammalian TransfectionTM试剂盒(Stratagene，目录号200285)，根据生产商的指导，用所述系统的质粒成分以及编码内源或非内源GPCR的指定表达质粒转染细胞。简要地说，按照生产商的指导在磷酸钙沉淀内混合410ng SRF-Luc、80ng pCMV-受体表达质粒和20ngCMV-SEAP(分泌型碱性磷酸酶表达质粒；测量培养基内转染细胞与对照相比的碱性磷酸酶活性，检查样品间转染效率的差异)。将一半所述沉淀平均分配到96孔板的3个孔，在无血清培养基内与所述细胞保持接触24小时。最后5小时，根据指示，用1μl血管紧张肽温育细胞。然后裂解细胞，使用LucliteTM试剂盒(Packard，目录号6016911)和“Trilux 1450 Microbeta”液体闪烁发光计数器(Wallac)，按照生产商的指导测定萤光素酶活性。使用GraphPad PrismTM2.0a(GraphPadSoftware Inc.)分析数据。
d.细胞内IP3积累测定(Gq结合受体)第1天，将包含所述受体(内源和/或非内源)的细胞接种到24孔板上，一般是1×105细胞/孔(可以优化该值)。第2天，如下转染细胞首先混合50μl无血清DMEM/孔内的0.25ug DNA和50μl无血清DMEM/孔内的2μl脂质转染胺。温和混合所述溶液，然后在室温下温育15-30分钟。随后用0.5ml PBS和400μl无血清培养基洗涤细胞，然后与转染培养基混合并加入所述细胞。所述细胞在37℃/5％CO2温育3-4小时，然后除去所述转染培养基，更换为1ml/孔常规培养基。第3天，用3H-肌醇标记细胞。简要地说，除去所述培养基，用0.5ml PBS洗涤细胞。然后每孔加入0.5ml无肌醇/无血清培养基(GIBCO BRL)和0.25μCi3H-肌醇，将细胞在37℃/5％CO2温育过夜16-18小时。第4天，用0.5ml PBS洗涤细胞，加入0.45ml测定培养基，或加入0.4ml测定培养基以及50μl 10x ketanserin(ket)达到10μM的终浓度，所述0.45ml测定培养基含无肌醇/无血清培养基、10μMpargyline、10mM氯化锂。所述细胞随后在37℃温育30分钟。用0.5ml PBS洗涤细胞，每孔加入200μl新鲜冰冷的终止溶液(1M KOH；18mM硼酸钠；3.8mM EDTA)。所述溶液在冰上保持5-10分钟(或直到细胞裂解)，然后加入200μl新鲜冰冷的中和溶液(7.5％HCL)中和。随后将所述裂解物转移到1.5ml微量离心管，每管加入1ml氯仿/甲醇(1∶2)。涡流振荡所述溶液15秒钟，将上层相加载到Biorad AG1-X8TM阴离子交换树脂(100-200目)。首先用水以1∶1.25 W/V洗所述树脂，然后将0.9ml上层相加载到柱上。用10ml 5mM肌醇和10ml 5mM硼酸钠/60mM甲酸钠洗柱。用2ml 0.1M甲酸/1M甲酸铵将肌醇三磷酸洗脱入含10ml闪烁混合物的闪烁小管。如下再生柱子用10ml0.1M甲酸/3M甲酸铵洗涤，用双蒸水清洗两次，然后4℃下保存于水中。
参考图1。在图1中，用下面蛋白转染293细胞六氨基酸缺失的Gq蛋白“Gq(del)”；与Gi蛋白融合的Gq蛋白“Gq(del)/Gi”；内源RUP32；和具有Gq(del)的RUP32(“RUP32+Gq(del)/Gi”)。根据测量RUP32与Gq(del)/Gi共转染的IP3积累，这些数据指出RUP32并不与Gq蛋白内源偶联。然而，当RUP32与Gq(del)/Gi融合蛋白共转染时，RUP32不得不与Gq蛋白偶联。RUP27+Gq(del)/Gi与内源RUP32相比IP3积累增加约九(9)倍。该数据表明所述Gq(del)/Gi融合构建物可以与GPCR共转染，并可用于筛选激动剂或反激动剂。
参见图2。在图2中，用RUP35和RUP36受体转染293细胞，并与对照pCMV相比。这些数据指出RUP35和RUP36都是内源组成型活化的。RUP35与pCMV相比细胞内磷酸肌醇增加约六(6)倍，RUP36与pCMV相比增加约四(4)倍。
实施例5制备融合蛋白a.GPCRGs融合构建物可以如下完成组成型活化GPCR-G蛋白融合构建物的设计工程化大鼠G蛋白Gsα(长形式；Itoh，H.等，83 PNAS 3776(1986))的5′末端和3′末端，在其上包括HindIII(5′-AAGCTT-3′)序列。确认正确序列(包括侧翼HindIII序列)后，通过使用pcDNA3.1(-)(Invitrogen，目录号V795-20)的HindIII限制位点进行亚克隆，将所述完整序列穿梭进所述载体。亚克隆进pcDNA3.1(-)后，确认所述Gsα序列的正确取向。然后确认在HindIII序列包含所述大鼠Gsα基因的修饰pcDNA3.1(-)；该载体以后用作“通用”Gsα蛋白载体。所述pcDNA3.1(-)载体在HindIII位点上游包含多种众所周知的限制位点，因此有利地提供在所述Gs蛋白上游插入内源组成型有活性GPCR的编码序列的能力。可以利用同样方法制造其它“通用”G蛋白载体，当然也可以利用技术人员已知的其它商业化载体或专利载体。在一些实施方案中，重要的标准是所述GPCR的序列在所述G蛋白序列的上游并且与所述G蛋白序列符合读框。
所述G蛋白和所述GPCR间限制位点内的间隔区是可选的。有义引物和反义引物分别包括XbaI和EcoRV限制位点，使得在所述G蛋白和所述GPCR之间存在间隔区(归因于所述限制位点)。
然后利用PCR保证各个受体序列融合入上文公开的所述Gsα通用载体，其中使用下面方法在各管内加入100ng编码GPCR的cDNA，各管包含2μl每种引物(有义和反义)、3μl 10mM dNTP、10μl10XTaqPlusTMPrecision缓冲液、1μl TaqPlusTMPrecision聚合酶(Stratagene#600211)和80μl水。针对所述GPCR的反应温度和循环时间如下，其中步骤2到步骤4重复35次94℃1分钟；94℃30秒钟；62℃20秒钟；72℃1分钟40秒；然后72℃5分钟。PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，然后纯化。用XbaI和EcoRV消化所述纯化产物，纯化所需插入片段，连接进所述Gs通用载体的各个限制位点。转化后分离阳性克隆，然后通过限制酶消化确认；按照上文陈述的方法完成使用293细胞的表达。测序GPCR-Gs融合蛋白的各个阳性克隆，确认其正确性。
b.Gq(6氨基酸缺失)/Gi融合构建物如下完成Gq(del)/Gi融合构建物的设计去除Gαq亚单位N末端六(6)个氨基酸(氨基酸2到7，序列TLESIM(SEQ.ID.NO.47)，并Gαi蛋白的对应氨基酸(序列DCGLF(SEQ.ID.NO.49))取代C末端五(5)个氨基酸(序列EYNLV(SEQ.ID.NO.48))。使用质粒63313作为模板，使用下面引物通过PCR获得该融合构建物5′-gatcAAGCTTCCATGGCGTGCTGCCTGAGCGAGG-3′(SEQ.ID.NO.50)和5′-gatcGGATCCTTAGAACAGGCCGCAGTCCTTCAGGTTCAGCTGCAGGATGGTG-3′(SEQ.ID.NO.51)，所述质粒63313包含携带血凝素标记的小鼠Gαq野生型形式。小写字母表示的核苷酸是间隔区。
利用TaqPlusPrecision DNA聚合酶(Stratagene)通过如下循环扩增，其中步骤2到4重复35次95℃2分钟；95℃20秒钟；56℃20秒钟；72℃2分钟；然后72℃7分钟。将所述PCR产物克隆进pCRII-TOPO载体(Invitrogen)，使用ABI Big Dye Terminator试剂盒(P.E.Biosystems)测序。通过2步骤克隆方法，将来自包含所述融合构建物序列的TOPO克隆的插入片段穿梭入表达载体pcDNA3.1(+)的HindIII/BamHI位点。
实施例6所公开的人GPCR的组织分布RT-PCR应用RT-PCR证实表达，确认几种新型人GPCR的组织分布。所利用的寡核苷酸是GPCR特异性的，使用人多组织cDNA组合(MTC，Clontech)作为模板。在40μl反应物内，按照生产商的指导使用TaqDNA聚合酶(Stratagene)。将20μl所述反应物加载到1.5％琼脂糖凝胶上，分析所述RT-PCR产物。下面的表E列出受体、循环条件和所利用的引物，并且列出与所述受体有关的典型疾病/紊乱。
表E
与位于这些组织或区域中的受体有关的疾病和紊乱包括但不限于心脏紊乱和疾病(如血栓形成、心肌梗死、动脉粥样硬化、心肌病)、肾病/紊乱(如肾衰竭、肾小管性酸中毒、肾性糖尿、肾原性尿崩症、胱氨酸尿、多囊肾病)、嗜酸粒细胞增多、白细胞增多、白细胞减少、卵巢癌、性功能障碍、多囊卵巢综合征、胰腺炎和胰腺癌、过敏性肠综合征、结肠癌、Crohn氏病、溃疡性结肠炎、憩室炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、囊性纤维变性、肺炎、肺动脉高血压、肺结核和肺癌、Parkinson氏病、运动障碍和运动失调、学习记忆障碍、饮食障碍(如厌食、贪食症等)、肥胖、癌症、胸腺瘤、重症肌无力、循环系统疾病、前列腺癌、前列腺炎、肾病/紊乱(如肾衰竭、肾小管性酸中毒、肾性糖尿、肾原性尿崩症、胱氨酸尿、多囊肾病)、感觉运动处理和唤醒障碍、强迫观念与行为的障碍、睾丸癌、阴茎异常勃起、前列腺炎、疝、内分泌紊乱、性功能障碍、变态反应、抑郁、精神病、偏头痛、反流、精神分裂症、溃疡、支气管痉挛、癫痫、前列腺肥大、焦虑、鼻炎、咽峡炎和青光眼。因此，本发明的方法可以用于诊断和/或治疗这些和其它疾病和紊乱。
实施例7方法直接鉴定反激动剂和激动剂A.[35S]GTPγS测定虽然已经使用内源组成型有活性的GPCR直接鉴定可用作例如反激动剂的候选化合物，但由于未曾完全理解的原因，可能加剧测定内的差异。在一些实施方案中，上文公开的GPCR融合蛋白也与非内源组成型活化的GPCR一起应用。当使用所述蛋白时，测定内差异看起来基本稳定，由此获得有效的信噪比。其良好结果是允许更可靠地鉴定候选化合物。因此，在一些实施方案中，优选在直接鉴定时使用GPCR融合蛋白，并且当使用所述融合蛋白时，利用下面测定方法。
1.膜制备最好如下制备包含目标组成型有活性的孤独GPCR融合蛋白、并且用于直接鉴定可用作反激动剂或激动剂的候选化合物的膜a.材料“膜刮除缓冲液”包含20mM HEPES和10mM EDTA，pH 7.4；“膜洗涤缓冲液”包含20mM HEPES和0.1mM EDTA，pH 7.4；“结合缓冲液”包含20mM HEPES，100mM NaCl和10mM MgCl2，pH7.4。
b.方法整个方法过程中所有物质都保存在冰上。首先从汇合的单层细胞上吸走培养基，用10ml冷PBS清洗，然后吸走PBS。此后，加入5ml膜刮除缓冲液脱落细胞；然后将细胞提取物转移进50ml离心管(4℃下在20,000rpm离心17分钟)。此后，吸走上清，将沉淀重悬浮于30ml膜洗涤缓冲液，4℃下在20,000rpm离心17分钟。吸走上清，将沉淀重悬浮于结合缓冲液。然后使用Brinkman PolytronTM匀浆器匀浆所述重悬浮的沉淀(破碎15-20秒钟，直到物质形成悬浮液)。该物质在本文中称为“膜蛋白”。
2.Bradford蛋白测定匀浆后，测定所述膜的蛋白浓度，例如使用Bradford蛋白测定方法进行测定(稀释蛋白到约1.5mg/ml，等分并冰冻(-80℃)等待以后使用；冰冻时，使用方法如下测定那一天，室温下解冻冰冻的膜蛋白，然后旋涡振荡，用Polytron在约12×1,000rpm匀浆约5-10秒钟；注意在多次制备时，所述匀浆器在匀浆不同制备物之间应当充分清洁)。
a.材料结合缓冲液(如上文所述)；Bradford染料试剂；按照生产商的指导使用Bradford蛋白标准(Biorad，目录号500-0006)。
b.方法制备两份管，一份管包括膜，另一份管作为对照“空白”。每管包含800μl结合缓冲液。此后，每管加入10μl Bradford蛋白标准(1mg/ml)，在其中一管加入10μl膜蛋白(不是空白管)。此后，每管加入200μl Bradford染料试剂，旋涡振荡。五分钟后，再次旋涡振荡两管，将其中的物质转移到比色杯。使用CECIL 3041分光光度计在波长595对所述比色杯读数。
3.直接鉴定测定a.材料GDP缓冲液含37.5ml结合缓冲液和2mg GDP(Sigma，目录号G-7127)，在结合缓冲液中顺序稀释获得0.2μM GDP的浓度(每孔中GDP的最终浓度是0.1μM GDP)；每孔的最终体积是200μl，包含候选化合物、100μl GDP缓冲液(最终浓度0.1μM GDP)、50μl结合缓冲液中的膜蛋白和50μl结合缓冲液中的[35S]GTPγS(0.6nM)(每10ml结合缓冲液2.5μl[35S]GTPγS)。
b.方法最好使用96孔板筛选候选化合物(可以冰冻在-80℃)。简单匀浆膜蛋白(或携带表达载体的膜作为对照，所述表达载体不合所述GPCR融合蛋白)直到成为悬浮液。然后使用例如上文所述的Bradford蛋白测定方法测定蛋白浓度。用结合缓冲液稀释膜蛋白(和对照)到0.25mg/ml(最终测定浓度12.5μg/孔)。此后，每个Wallac ScintistripTM(Wallac)孔加入100μl GDP缓冲液。然后使用5μl加样工具在所述孔中转移5μl候选化合物(即在总测定体积200μl中占5μl，构成1∶40的比例，使得所述候选化合物的最终筛选浓度是10μM)。此外，为避免污染，每个转移步骤后都在三个池内清洗加样工具，所述三个池盛有水(1X)、乙醇(1X)和水(2X)，每次清洗后从加样工具甩去多余液体，用纸和Kim抹布擦干所述工具。此后，每孔加入50μl膜蛋白(也利用对照孔，该孔包含没有所述GPCR融合蛋白的膜)，室温下温育5-10分钟。此后，每孔加入50μl结合缓冲液内的[35S]GTPγS(0.6nM)，然后在摇床内室温下温育60分钟(同样，在本实施例中，用箔片覆盖平板)。通过在22℃下以4000RPM离心所述平板15分钟，终止测定。用8通道多支管吸走平板中的液体，用平板盖封口。然后所述平板在Wallac 1450上使用设置“Prot.#37”读数(根据生产商的指导)。
B.环状AMP测定直接鉴定候选化合物的另一种测定方法可以使用基于环化酶的测定完成。除直接鉴定外，可以利用本测定方法作为独立性的方法，确认根据上文所述[35S]GTPγS方法获得的结果。
最好根据下面方法，利用改良Flash PlateTM腺苷酸环化酶试剂盒(New England Nuclear；目录号SMP004A)直接鉴定可用作GPCR反激动剂和激动剂的候选化合物。
转染后约三天收获转染细胞。匀浆在含20mM HEPES，pH7.4和10mM MgCl2的缓冲液内悬浮的细胞，制备膜。使用BrinkrnanPolytronTM在冰上匀浆约10秒钟。得到的匀浆物在4℃下于49,000Xg离心15分钟。得到的沉淀重悬浮于含20mM HEPES，pH 7.4和0.1mMEDTA的缓冲液内，匀浆10秒钟，然后在4℃下于49,000Xg离心15分钟。得到的沉淀保存在-80℃直到使用。在直接鉴定筛选的那一天，在室温下缓慢融化所述膜沉淀，重悬浮于含20mM HEPES，pH 7.4和10mM MgCl2的缓冲液，使得最终蛋白浓度为0.60mg/ml(所述重悬浮的膜置于冰上直到使用)。
按照生产商的指导制备和维持cAMP标准和检测缓冲液(在11ml检测缓冲液内含2μCi示踪物[125I cAMP(100μl)])。新鲜制备用于筛选的测定缓冲液，所述缓冲液含20mM HEPES，pH 7.4，10mM MgCl2，20mM磷酸肌酸(Sigma)，0.1单位/ml肌酸磷酸激酶(Sigma)，50μMGTP(Sigma)和0.2mM ATP(Sigma)；测定缓冲液保存在冰上直到使用。
最好将如上文鉴定的候选化合物(如果冰冻，则在室温下解冻)加入96孔板的孔内(3μl/孔；最终测定浓度12μM)，并且加入40μl膜蛋白(30μg/孔)和50μl测定缓冲液。所述混合物在室温下温和搅拌温育30分钟。
温育后，每孔加入100μl测定缓冲液，然后温育2-24小时。然后在Wallac MicroBetaTM读板机上使用“Prot.#31”读板(根据生产商的指导)。
C.黑素细胞筛选测定可以如下进行鉴定GPCR候选激动剂或反激动剂的方法引入色素细胞系的测试细胞，所述测试细胞能够应对特定刺激分散或聚集它们的色素，并表达编码所述GPCR的外源克隆。假如所述GPCR的活化诱导色素分散，则刺激物(如光)设置色素处理的起始状态为色素聚集在测试细胞内。然而，假如所述GPCR的活化诱导色素聚集，则用刺激物刺激细胞设置色素沉积的起始状态为色素分散。使所述测试细胞与所述化合物接触，确定细胞内的色素处理是否从色素处理的起始状态改变。与所述GPCR偶联候选化合物引起的色素细胞分散在培养皿上看起来较暗，而色素细胞的聚集看起来叫亮。
材料和方法根据美国专利号5,462,856和美国专利号6,051,386的公开内容，这两份公开物通过引用结合到本文中。
虽然为利用内源和非内源性人GPCR的目的，本领域内技术人员可以利用各种表达载体，但在一些实施方案中优选所利用的载体是pCMV。该载体按照国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约规定于1998年10月13日保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)(10801 University Blvd.，Manassas，VA 20110-2209 USA)。所述DNA经过ATCC测试，确认是有活力的。ATCC已经对pCMV给予如下保藏号ATCC#203351。
除专门指明外，本专利文件中引用的参考文献，包括共同未决和相关专利申请都通过引用完整地结合到本文中。上面的公开方案和下面的权利要求包括在技术人员能力范围内的对所公开发明的修改和扩展。
序列表<110>Arena Pharmaceuticals，Inc.
<120>内源和非内源组成型活化人G蛋白偶联受体<130>AREN-0309<150>09/170,496<151>1998-10-13<150>PCT/US99/23938<151>1998-10-13<150>60/253,404<151>2000-11-27<150>60/255,366<151>2000-12-12<150>60/270,286<151>2001-02-20<150>60/282,365<151>2001-04-06<150>60/270,266<151>2001-02-20<150>60/282,032<151>2001-04-06<150>60/282,358<151>2001-04-06<150>60/282,356<151>2001-04-06<150>60/290,917<151>2001-05-14<150>60/309,208<151>2001-07-31<160>67<170>PatentIn版本3.1<210>1<211>1002<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>新型序列
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<223>新型序列
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gtccacagcg tttttctgct gacagtgcca tttcgcttga cctacctcat caagaagact240tggatgtttg ggctgccctt ctgcaaattt gtgagtgcca tgctgcacat ccacatgtac300ctcacgttcc tattctatgt ggtgatcctg gtcaccagat acctcatctt cttcaagtgc360aaagacaaag tggaattcta cagaaaactg catgctgtgg ctgccagtgc tggcatgtgg420acgctggtga ttgtcattgt ggtacccctg gttgtctccc ggtatggaat ccatgaggaa480tacaatgagg agcactgttt taaatttcac aaagagcttg cttacacata tgtgaaaatc540atcaactata tgatagtcat ttttgtcata gccgttgctg tgattctgtt ggtcttccag600gtcttcatca ttatgttgat ggtgcagaag ctacgccact ctttactatc ccaccaggag660ttctgggctc agctgaaaaa cctatttttt ataggggtca tccttgtttg tttccttccc720taccagttct ttaggatcta ttacttgaat gttgtgacgc attccaatgc ctgtaacagc780aaggttgcat tttataacga aatcttcttg agtgtaacag caattagctg ctatgatttg840cttctctttg tctttggggg aagccattgg tttaagcaaa agataattgg cttatggaat900tgtgttttgt gccgttag 918<210>4<211>305<212>PRT<213>人<400>4Met Pro Gly His Asn Thr Ser Arg Asn Ser Ser Cys Asp Pro Ile Val1 5 10 15Thr Pro His Leu Ile Ser Leu Tyr Phe Ile Val Leu Ile Gly Gly Leu20 25 30Val Gly Val Ile Ser Ile Leu Phe Leu Leu Val Lys Met Asn Thr Arg35 40 45Ser Val Thr Thr Met Ala Val Ile Asn Leu Val Val Val His Ser Val50 55 60Phe Leu Leu Thr Val Pro Phe Arg Leu Thr Tyr Leu Ile Lys Lys Thr65 70 75 80Trp Met Phe Gly Leu Pro Phe Cys Lys Phe Val Ser Ala Met Leu His85 90 95Ile His Met Tyr Leu Thr Phe Leu Phe Tyr Val Val Ile Leu Val Thr100 105 110Arg Tyr Leu Ile Phe Phe Lys Cys Lys Asp Lys Val Glu Phe Tyr Arg115 120 125
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His Cys Arg Gly Gly Cys Ser Val Phe Phe Ser Lys Ile Ser Gly Val180 185 190Leu Thr Phe Met Thr Ser Phe Tyr Ile Pro Gly Ser Ile Met Leu Cys195 200 205Val Tyr Tyr Arg Ile Tyr Leu Ile Ala Lys Glu Gln Ala Arg Leu Ile210 215 220Ser Asp Ala Asn Gln Lys Leu Gln Ile Gly Leu Glu Met Lys Asn Gly225 230 235 240Ile Ser Gln Ser Lys Glu Arg Lys Ala Val Lys Thr Leu Gly Ile Val245 250 255Met Gly Val Phe Leu Ile Cys Trp Cys Pro Phe Phe Ile Cys Thr Val260 265 270Met Asp Pro Phe Leu His Tyr Ile Ile Pro Pro Thr Leu Asn Asp Val275 280 285Leu Ile Trp Phe Gly Tyr Leu Asn Ser Thr Phe Asn Pro Met Val Tyr290 295 300Ala Phe Phe Tyr Pro Trp Phe Arg Lys Ala Leu Lys Met Met Leu Phe305 310 315 320Gly Lys Ile Phe Gln Lys Asp Ser Ser Arg Cys Lys Leu Phe Leu Glu325 330 335Leu Ser Ser<210>13<211>1029<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>新型序列<400>13atgaccagca atttttccca acctgttgtg cagctttgct atgaggatgt gaatggatct 60tgtattgaaa ctccctattc tcctgggtcc cgggtaattc tgtacacggc gtttagcttt120gggtctttgc tggctgtatt tggaaatctc ttagtaatga cttctgttct tcattttaag180cagctgcact ctccaaccaa ttttctcatt gcctctctgg cctgtgctga cttcttggta240ggtgtgactg tgatgctttt cagcatggtc aggacggtgg agagctgctg gtattttgga300gccaaatttt gtactcttca cagttgctgt gatgtggcat tttgttactc ttctgtcctc360
cacttgtgct tcatctgcat cgacaggtac attgtggtta ctgatcccct ggtctatgct420accaagttca ccgtgtctgt gtcgggaatt tgcatcagcg tgtcctggat tctgcctctc480acgtacagcg gtgctgtgtt ctacacaggt gtcaatgatg atgggctgga ggaattagta540agtgctctca actgcgtagg tggctgtcaa attattgtaa gtcaaggctg ggtgttgata600gattttctgt tattcttcat acctaccctt gttatgataa ttctttacag taagattttt660cttatagcta aacaacaagc tataaaaatt gaaactacta gtagcaaagt agaatcatcc720tcagagagtt ataaaatcag agtggccaag agagagagga aagcagctaa aaccctgggg780gtcacggtac tagcatttgt tatttcatgg ttaccgtata cagttgatat attaattgat840gcctttatgg gcttcctgac ccctgcctat atctatgaaa tttgctgttg gagtgcttat900tataactcag ccatgaatcc tttgatttat gctctatttt atccttggtt taggaaagcc960ataaaactta ttttaagtgg agatgtttta aaggctagtt catcaaccat tagtttattt 1020ttagaataa 1029<210>14<211>342<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>新型序列<400>14Met Thr Ser Asn Phe Ser Gln Pro Val Val Gln Leu Cys Tyr Glu Asp1 5 10 15Val Asn Gly Ser Cys Ile Glu Thr Pro Tyr Ser Pro Gly Ser Arg Val20 25 30Ile Leu Tyr Thr Ala Phe Ser Phe Gly Ser Leu Leu Ala Val Phe Gly35 40 45Asn Leu Leu Val Met Thr Ser Val Leu His Phe Lys Gln Leu His Ser50 55 60Pro Thr Asn Phe Leu Ile Ala Ser Leu Ala Cys Ala Asp Phe Leu Val65 70 75 80Gly Val Thr Val Met Leu Phe Ser Met Val Arg Thr Val Glu Ser Cys85 90 95Trp Tyr Phe Gly Ala Lys Phe Cys Thr Leu His Ser Cys Cys Asp Val100 105 110Ala Phe Cys Tyr Ser Ser Val Leu His Leu Cys Phe Ile Cys Ile Asp115 120 125
Arg Tyr Ile Val Val Thr Asp Pro Leu Val Tyr Ala Thr Lys Phe Thr130 135 140Val Ser Val Ser Gly Ile Cys Ile Ser Val Ser Trp Ile Leu Pro Leu145 150 155 160Thr Tyr Ser Gly Ala Val Phe Tyr Thr Gly Val Asn Asp Asp Gly Leu165 170 175Glu Glu Leu Val Ser Ala Leu Asn Cys Val Gly Gly Cys Gln Ile Ile180 185 190Val Ser Gln Gly Trp Val Leu Ile Asp Phe Leu Leu Phe Phe Ile Pro195 200 205Thr Leu Val Met Ile Ile Leu Tyr Ser Lys Ile Phe Leu Ile Ala Lys210 215 220Gln Gln Ala Ile Lys Ile Glu Thr Thr Ser Ser Lys Val Glu Ser Ser225 230 235 240Ser Glu Ser Tyr Lys Ile Arg Val Ala Lys Arg Glu Arg Lys Ala Ala245 250 255Lys Thr Leu Gly Val Thr Val Leu Ala Phe Val Ile Ser Trp Leu Pro260 265 270Tyr Thr Val Asp Ile Leu Ile Asp Ala Phe Met Gly Phe Leu Thr Pro275 280 285Ala Tyr Ile Tyr Glu Ile Cys Cys Trp Ser Ala Tyr Tyr Asn Ser Ala290 295 300Met Asn Pro Leu Ile Tyr Ala Leu Phe Tyr Pro Trp Phe Arg Lys Ala305 310 315 320Ile Lys Leu Ile Leu Ser Gly Asp Val Leu Lys Ala Ser Ser Ser Thr325 330 335Ile Ser Leu Phe Leu Glu340<210>15<211>1062<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>新型序列<400>15
atggagcaca cgcacgccca cctcgcagcc aacagctcgc tgtcttggtg gtcccccggc 60tcggcctgcg gcttgggttt cgtgcccgtg gtctactaca gcctcttgct gtgcctcggt120ttaccagcaa atatcttgac agtgatcatc ctctcccagc tggtggcaag aagacagaag180tcctcctaca actatctctt ggcactcgct gctgccgaca tcttggtcct ctttttcata240gtgtttgtgg acttcctgtt ggaagatttc atcttgaaca tgcagatgcc tcaggtcccc300gacaagatca tagaagtgct ggaattctca tccatccaca cctccatatg gattactgta360ccgttaacca ttgacaggta tatcgctgtc tgccacccgc tcaagtacca cacggtctca420tacccagccc gcacccggaa agtcattgta agtgtttaca tcacctgctt cctgaccagc480atcccctatt actggtggcc caacatctgg actgaagact acatcagcac ctctgtgcat540cacgtcctca tctggatcca ctgcttcacc gtctacctgg tgccctgctc catcttcttc600atcttgaact caatcattgt gtacaagctc aggaggaaga gcaattttcg tctccgtggc660tactccacgg ggaagaccac cgccatcttg ttcaccatta cctccatctt tgccacactt720tgggcccccc gcatcatcat gattctttac cacctctatg gggcgcccat ccagaaccgc780tggctggtgc acatcatgtc cgacattgcc aacatgctag cccttctgaa cacagccatc840aacttcttcc tctactgctt catcagcaag cggttccgca ccatggcagc cgccacgctc900aaggctttct tcaagtgcca gaagcaacct gtacagttct acaccaatca taacttttcc960ataacaagta gcccctggat ctcgccggca aactcacact gcatcaagat gctggtgtac 1020cagtatgaca aaaatggaaa acctataaaa gtatccccgt ga 1062<210>16<21l>353<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>新型序列<400>16Met Glu His Thr His Ala His Leu Ala Ala Asn Ser Ser Leu Ser Trp1 5 10 15Trp Ser Pro Gly Ser Ala Cys Gly Leu Gly Phe Val Pro Val Val Tyr20 25 30Tyr Ser Leu Leu Leu Cys Leu Gly Leu Pro Ala Asn Ile Leu Thr Val35 40 45Ile Ile Leu Ser Gln Leu Val Ala Arg Arg Gln Lys Ser Ser Tyr Asn50 55 60Tyr Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ala Asp Ile Leu Val Leu Phe Phe Ile65 70 75 80
Val Phe Val Asp Phe Leu Leu Glu Asp Phe Ile Leu Asn Met Gln Met85 90 95Pro Gln Val Pro Asp Lys Ile Ile Glu Val Leu Glu Phe Ser Ser Ile100 105 110His Thr Ser Ile Trp Ile Thr Val Pro Leu Thr Ile Asp Arg Tyr Ile115 120 125Ala Val Cys His Pro Leu Lys Tyr His Thr Val Ser Tyr Pro Ala Arg130 135 140Thr Arg Lys Val Ile Val Ser Val Tyr Ile Thr Cys Phe Leu Thr Ser145 150 155 160Ile Pro Tyr Tyr Trp Trp Pro Asn Ile Trp Thr Glu Asp Tyr Ile Ser165 170 175Thr Ser Val His His Val Leu Ile Trp Ile His Cys Phe Thr Val Tyr180 185 190Leu Val Pro Cys Ser Ile Phe Phe Ile Leu Asn Ser Ile Ile Val Tyr195 200 205Lys Leu Arg Arg Lys Ser Asn Phe Arg Leu Arg Gly Tyr Ser Thr Gly210 215 220Lys Thr Thr Ala Ile Leu Phe Thr Ile Thr Ser Ile Phe Ala Thr Leu225 230 235 240Trp Ala Pro Arg Ile Ile Met Ile Leu Tyr His Leu Tyr Gly Ala Pro245 250 255Ile Gln Asn Arg Trp Leu Val His Ile Met Ser Asp Ile Ala Asn Met260 265 270Leu Ala Leu Leu Asn Thr Ala Ile Asn Phe Phe Leu Tyr Cys Phe Ile275 280 285Ser Lys Arg Phe Arg Thr Met Ala Ala Ala Thr Leu Lys Ala Phe Phe290 295 300Lys Cys Gln Lys Gln Pro Val Gln Phe Tyr Thr Asn His Asn Phe Ser305 310 315 320Ile Thr Ser Ser Pro Trp Ile Ser Pro Ala Asn Ser His Cys Ile Lys325 330 335Met Leu Val Tyr Gln Tyr Asp Lys Asn Gly Lys Pro Ile Lys Val Ser
340 345 350Pro<210>17<211>969<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>新型序列<400>17atggatccaa ccgtcccagt cttcggtaca aaactgacac caatcaacgg acgtgaggag 60actccttgct acaatcagac cctgagcttc acggtgctga cgtgcatcat ttcccttgtc120ggactgacag gaaacgcggt agtgctctgg ctcctgggct accgcatgcg caggaacgct180gtctccatct acatcctcaa cctggccgca gcagacttcc tcttcctcag cttccagatt240atacgttcgc cattacgcct catcaatatc agccatctca tccgcaaaat cctcgtttct300gtgatgacct ttccctactt tacaggcctg agtatgctga gcgccatcag caccgagcgc360tgcctgtctg ttctgtggcc catctggtac cgctgccgcc gccccacaca cctgtcagcg420gtcgtgtgtg tcctgctctg gggcctgtcc ctgctgttta gtatgctgga gtggaggttc480tgtgacttcc tgtttagtgg tgctgattct agttggtgtg aaacgtcaga tttcatccca540gtcgcgtggc tgattttttt atgtgtggtt ctctgtgttt ccagcctggt cctgctggtc600aggatcctct gtggatcccg gaagatgccg ctgaccaggc tgtacgtgac catcctgctc660acagtgctgg tcttcctcct ctgcggcctg cccttcggca ttctgggggc cctaatttac720aggatgcacc tgaatttgga agtcttatat tgtcatgttt atctggtttg catgtccctg780tcctctctaa acagtagtgc caaccccatc atttacttct tcgtgggctc ctttaggcag840cgtcaaaata ggcagaacct gaagctggtt ctccagaggg ctctgcagga caagcctgag900gtggataaag gtgaagggca gcttcctgag gaaagcctgg agctgtcggg aagcagattg960gggccatga969<210>18<211>322<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>新型序列<400>18Met Asp Pro Thr Val Pro Val Phe Gly Thr Lys Leu Thr Pro Ile Asn1 5 10 15Gly Arg Glu Glu Thr Pro Cys Tyr Asn Gln Thr Leu Ser Phe Thr Val
20 25 30Leu Thr Cys Ile Ile Ser Leu Val Gly Leu Thr Gly Asn Ala Val Val35 40 45Leu Trp Leu Leu Gly Tyr Arg Met Arg Arg Asn Ala Val Ser Ile Tyr50 55 60Ile Leu Asn Leu Ala Ala Ala Asp Phe Leu Phe Leu Ser Phe Gln Ile65 70 75 80Ile Arg Ser Pro Leu Arg Leu Ile Asn Ile Ser His Leu Ile Arg Lys85 90 95Ile Leu Val Ser Val Met Thr Phe Pro Tyr Phe Thr Gly Leu Ser Met100 105 110Leu Ser Ala Ile Ser Thr Glu Arg Cys Leu Ser Val Leu Trp Pro Ile115 120 125Trp Tyr Arg Cys Arg Arg Pro Thr His Leu Ser Ala Val Val Cys Val130 135 140Leu Leu Trp Gly Leu Ser Leu Leu Phe Ser Met Leu Glu Trp Arg Phe145 150 155 160Cys Asp Phe Leu Phe Ser Gly Ala Asp Ser Ser Trp Cys Glu Thr Ser165 170 175Asp Phe Ile Pro Val Ala Trp Leu Ile Phe Leu Cys Val Val Leu Cys180 185 190Val Ser Ser Leu Val Leu Leu Val Arg Ile Leu Cys Gly Ser Arg Lys195 200 205Met Pro Leu Thr Arg Leu Tyr Val Thr Ile Leu Leu Thr Val Leu Val210 215 220Phe Leu Leu Cys Gly Leu Pro Phe Gly Ile Leu Gly Ala Leu Ile Tyr225 230 235 240Arg Met His Leu Asn Leu Glu Val Leu Tyr Cys His Val Tyr Leu Val245 250 255Cys Met Ser Leu Ser Ser Leu Asn Ser Ser Ala Asn Pro Ile Ile Tyr260 265 270Phe Phe Val Gly Ser Phe Arg Gln Arg Gln Asn Arg Gln Asn Leu Lys275 280 285
Leu Val Leu Gln Arg Ala Leu Gln Asp Lys Pro Glu Val Asp Lys Gly290 295 300Glu Gly Gln Leu Pro Glu Glu Ser Leu Glu Leu Ser Gly Ser Arg Leu305 310 315 320Gly Pro<210>19<211>969<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>新型序列<400>19atggattcaa ccatcccagt cttgggtaca gaactgacac caatcaacgg acgtgaggag 60actccttgct acaagcagac cctgagcttc acggggctga cgtgcatcgt ttcccttgtt120gcgctgacag gaaacgcggt tgtgctctgg ctcctgggct gccgcatgcg caggaacgct180gtctccatct acatcctcaa cctggtcgcg gccgacttcc tcttccttag cggccacatt240atatgttcgc cgttacgcct catcaatatc cgccatccca tctccaaaat cctcagtcct300gtgatgacct ttccctactt tataggccta agcatgctga gcgccatcag caccgagcgc360tgcctgtcca tcctgtggcc catctggtac cactgccgcc gccccagata cctgtcatcg420gtcatgtgtg tcctgctctg ggccctgtcc ctgctgcgga gtatcctgga gtggatgttc480tgtgacttcc tgtttagtgg tgctgattct gtttggtgtg aaacgtcaga tttcattaca540atcgcgtggc tggttttttt atgtgtggtt ctctgtgggt ccagcctggt cctgctggtc600aggattctct gtggatcccg gaagatgccg ctgaccaggc tgtacgtgac catcctcctc660acagtgctgg tcttcctcct ctgtggcctg ccctttggca ttcagtgggc cctgttttcc720aggatccacc tggattggaa agtcttattt tgtcatgtgc atctagtttc cattttcctg780tccgctctta acagcagtgc caaccccatc atttacttct tcgtgggctc ctttaggcag840cgtcaaaata ggcagaacct gaagctggtt ctccagaggg ctctgcagga cacgcctgag900gtggatgaag gtggagggtg gcttcctcag gaaaccctgg agctgtcggg aagcagattg960gagcagtga969<210>20<211>322<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>新型序列<400>20
Met Asp Ser Thr Ile Pro Val Leu Gly Thr Glu Leu Thr Pro Ile Asn1 5 10 15Gly Arg Glu Glu Thr Pro Cys Tyr Lys Gln Thr Leu Ser Phe Thr Gly20 25 30Leu Thr Cys Ile Val Ser Leu Val Ala Leu Thr Gly Asn Ala Val Val35 40 45Leu Trp Leu Leu Gly Cys Arg Met Arg Arg Asn Ala Val Ser Ile Tyr50 55 60Ile Leu Asn Leu Val Ala Ala Asp Phe Leu Phe Leu Ser Gly His Ile65 70 75 80Ile Cys Ser Pro Leu Arg Leu Ile Asn Ile Arg His Pro Ile Ser Lys85 90 95Ile Leu Ser Pro Val Met Thr Phe Pro Tyr Phe Ile Gly Leu Ser Met100 105 110Leu Ser Ala Ile Ser Thr Glu Arg Cys Leu Ser Ile Leu Trp Pro Ile115 120 125Trp Tyr His Cys Arg Arg Pro Arg Tyr Leu Ser Ser Val Met Cys Val130 135 140Leu Leu Trp Ala Leu Ser Leu Leu Arg Ser Ile Leu Glu Trp Met Phe145 150 155 160Cys Asp Phe Leu Phe Ser Gly Ala Asp Ser Val Trp Cys Glu Thr Ser165 170 175Asp Phe Ile Thr Ile Ala Trp Leu Val Phe Leu Cys Val Val Leu Cys180 185 190Gly Ser Ser Leu Val Leu Leu Val Arg Ile Leu Cys Gly Ser Arg Lys195 200 205Met Pro Leu Thr Arg Leu Tyr Val Thr Ile Leu Leu Thr Val Leu Val210 215 220Phe Leu Leu Cys Gly Leu Pro Phe Gly Ile Gln Trp Ala Leu Phe Ser225 230 235 240Arg Ile His Leu Asp Trp Lys Val Leu Phe Cys His Val His Leu Val245 250 255Ser Ile Phe Leu Ser Ala Leu Asn Ser Ser Ala Asn Pro Ile Ile Tyr
260 265 270Phe Phe Val Gly Ser Phe Arg Gln Arg Gln Asn Arg Gln Asn Leu Lys275 280 285Leu Val Leu Gln Arg Ala Leu Gln Asp Thr Pro Glu Val Asp Glu Gly290 295 300Gly Gly Trp Leu Pro Gln Glu Thr Leu Glu Leu Ser Gly Ser Arg Leu305 310 315 320Glu Gln<210>21<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>新型序列<400>21cagagctctg gtggccacct ctgtcc 26<210>22<211>25<212>DMA<213>人工序列<220>
<223>新型序列<400>22ctgcgtccac cagagtcacg tctcc 25<210>23<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>新型序列<400>23gtatgcctgg ccacaatacc tccagg 26<210>24<211>31<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>新型序列<400>24gtttgtggct aacggcacaa aacacaattc c31<210>25<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>新型序列<400>25ggtaccacaa tgacaatcac cagcgtcc28<210>26<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>新型序列<400>26ggaacgtgag gtacatgtgg atgtgcagc 29<210>27<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>新型序列<400>27gcagtgtagc ggtcaaccgt gagcagg 27<210>28<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>新型序列
<400>28tgagcaggat ggcgatccag actgaggcgtgg32<210>29<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>新型序列<400>29gaggtacagc tggcgatgct gacag 25<210>30<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>新型序列<400>30gtggccatga gccaccctga gctcc 25<210>31<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>新型序列<400>31ggaatgtcca ctgaatgcgc gcgg24<210>32<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>新型序列<400>32agctcgccag gtgtgagaaa ctcgg 25<210>33<211>30<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>新型序列<400>33gcgttatgag cagcaattca tccctgctgg 30<210>34<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>新型序列<400>34gtatcctgaa cttcgtctat acaactgc28<210>35<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>新型序列<400>35ccctcaggaa tgatgccctt ttgccacaa 29<210>36<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>新型序列<400>36atccatgtgg ttggtgcatg tggttcgt28<210>37<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>新型序列
<400>37aaacaacaaa cagcagaacc atgaccagc 29<210>38<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>新型序列<400>38acatagagac aagtgacatg tgtgaaccac 30<210>39<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>新型序列<400>39ggtatgagac cgtgtggtac ttgagc 26<210>40<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>新型序列<400>40gtggcagaca gcgatatacc tgtcaatgg 29<210>41<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>新型序列<400>41gcgctcatgg agcacacgca cgcccac 27<210>42<211>25<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>新型序列<400>42gaggcagtag ttgccacacc tatgg 25<210>43<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>新型序列<400>43catctggttt gtgttcccag gggcaccag 29<210>44<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>新型序列<400>44gacagtgttg ctctcaaagt cccgtctgac tg 32<210>45<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>新型序列<400>45ctgtttccag ggtcatcaga ctggg 25<210>46<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>新型序列<400>46gcagcattgc tctcaaagtc ctgtctg 27
<210>47<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>新型序列<400>47Thr Leu Glu Ser Ile Met1 5<210>48<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>新型序列<400>48Glu Tyr Asn Leu Val1 5<210>49<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>新型序列<400>49Asp Cys Gly Leu Phe1 5<210>50<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>新型序列<400>50gatcaagctt ccatggcgtg ctgcctgagc gagg 34<210>51<211>53<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>新型序列<400>51gatcggatcc ttagaacagg ccgcagtcct tcaggttcag ctgcaggatg gtg53<210>52<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>新型序列<400>52gtcctcactg gtggccatgt actcc 25<210>53<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>新型序列<400>53ctgcgtccac cagagtcacg tctcc 25<210>54<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>新型序列<400>54cttggatgtt tgggctgccc ttctgc 26<210>55<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>新型序列
<400>55gtttgtggct aacggcacaa aacacaattc c31<210>56<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>新型序列<400>56ctgctcacgg ttgaccgcta cactgc 26<210>57<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>新型序列<400>57gtggccatga gccaccctga gctcc 25<210>58<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>新型序列<400>58cttcttctcc gacgtcaagg 20<210>59<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>新型序列<400>59cttcttctcc gacgtcaagg 20<210>60<211>20<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>新型序列<400>60cttcttctcc gacgtcaagg 20<210>61<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>新型序列<400>61caacggtctg acaacctcct 20<210>62<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>新型序列<400>62ttgctgtgat gtggcatttt g 21<210>63<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>新型序列<400>63caggaagccc ataaaggcat caa 23<210>64<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>新型序列
<400>64acatcacctg cttcctgacc 20<210>65<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>新型序列<400>65ccagcatctt gatgcagtgt 20<210>66<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>新型序列<400>66ccatctccaa aatcctcagt c 21<210>67<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>新型序列<400>67gctgttaaga gcggacagga aa 2权利要求
1.一种G蛋白偶联受体，所述受体由SEQ.ID.NO.2的氨基酸序列编码。
2.权利要求1的G蛋白偶联受体，所述受体为非内源组成活化型受体。
3.一种质粒，所述质粒包含一种载体以及SEQ.ID.NO.1的cDNA。
4.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求3的质粒。
5.一种G蛋白偶联受体，所述受体由SEQ.ID.NO.4的氨基酸序列编码。
6.权利要求5的G蛋白偶联受体，所述受体为非内源组成活化型受体。
7.一种质粒，所述质粒包含一种载体以及SEQ.ID.NO.3的cDNA。
8.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求7的质粒。
9.一种G蛋白偶联受体，所述受体由SEQ.ID.NO.6的氨基酸序列编码。
10.权利要求9的G蛋白偶联受体，所述受体为非内源组成活化型受体。
11.一种质粒，所述质粒包含一种载体以及SEQ.ID.NO.5的cDNA。
12.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求11的质粒。
13.一种G蛋白偶联受体，所述受体由SEQ.ID.NO.8的氨基酸序列编码。
14.权利要求13的G蛋白偶联受体，所述受体为非内源组成活化型受体。
15.一种质粒，所述质粒包含一种载体以及SEQ.ID.NO.7的cDNA。
16.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求15的质粒。
17.一种G蛋白偶联受体，所述受体由SEQ.ID.NO.10的氨基酸序列编码。
18.权利要求17的G蛋白偶联受体，所述受体为非内源组成活化型受体。
19.一种质粒，所述质粒包含一种载体以及SEQ.ID.NO.9的cDNA。
20.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求19的质粒。
21.一种G蛋白偶联受体，所述受体由SEQ.ID.NO.12的氨基酸序列编码。
22.权利要求21的G蛋白偶联受体，所述受体为非内源组成活化型受体。
23.一种质粒，所述质粒包含一种载体以及SEQ.ID.NO.11的cDNA。
24.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求23的质粒。
25.一种G蛋白偶联受体，所述受体由SEQ.ID.NO.14的氨基酸序列编码。
26.权利要求25的G蛋白偶联受体，所述受体为非内源组成活化型受体。
27.一种质粒，所述质粒包含一种载体以及SEQ.ID.NO.13的cDNA。
28.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求27的质粒，
29.一种G蛋白偶联受体，所述受体由SEQ.ID.NO.16的氨基酸序列编码。
30.权利要求29的G蛋白偶联受体，所述受体为非内源组成活化型受体。
31.一种质粒，所述质粒包含一种载体以及SEQ.ID.NO.15的cDNA。
32.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求31的质粒。
33.一种G蛋白偶联受体，所述受体由SEQ.ID.NO.18的氨基酸序列编码。
34.权利要求33的G蛋白偶联受体，所述受体为非内源组成活化型受体。
35.一种质粒，所述质粒包含一种载体以及SEQ.ID.NO.17的cDNA。
36.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求35的质粒。
37.一种G蛋白偶联受体，所述受体由SEQ.ID.NO.20的氨基酸序列编码。
38.权利要求37的G蛋白偶联受体，所述受体为非内源组成活化型受体。
39.一种质粒，所述质粒包含一种载体以及SEQ.ID.NO.19的cDNA。
40.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求39的质粒。
全文摘要
本发明在本专利文件中涉及跨膜受体，更具体地说涉及未知其内源配体的人G蛋白偶联受体，以及表现组成型活性的所述人GPCR的突变(非内源)形式。
文档编号C12N1/21GK1549858SQ01822271
公开日2004年11月24日 申请日期2001年11月26日 优先权日2000年11月27日
发明者R·陈, Z·L·楚, H·T·当, K·P·罗维茨, C·普里德, R 陈, 当, 楚, 罗维茨, 锏 申请人:阿伦纳药品公司