专利名称：中国对虾抗菌肽基因与克隆技术的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种中国对虾抗菌肽基因与克隆技术，属于分子生物学技术领域。
随着人们生活水平的提高，对海产品的需求愈来愈大。中国对虾是我国重要的海产养殖品种。但90年代以来，对虾病大规模暴发，使海产养殖业遭受严重损失。国内许多学者在对虾病防治方面作了大量的工作，并且取得了很多进展。对虾的养殖产量也逐年回升。但到目前为止，对虾病仍是困扰对虾养殖业的一个难题。解决这一问题主要应从控制病原和提高对虾免疫力等方面入手。对虾的防御机制主要依赖血细胞的活动，包括吞噬外来物质或形成包涵体，血细胞合成抗菌物质(抗菌肽或多肽)并释放到血淋巴。另外酚氧化酶系统导致局部黑化和凝集，也起着一定的作用。狄特梅(Deatoumieux)等对凡那对虾(Litopenaeus vannamei)的抗菌肽进行了研究，从中分离得到了对虾抗菌肽(称为对虾肽，Penaeidins)并克隆到其基因，还对其进行了性质、基因表达和定位以及重组表达等方面的研究，参见狄特梅，布勒特等人“对虾肽，从凡纳对虾中分离得到的一种新的抗菌肽”《生物化学杂志》1997，27228398-28406(Destoumieux D，Bulet P，et al.Penaeidin，a new family of antimicrobial peptides isolated from the shrimp Penaeusvannamei.J Biol Chem，1997，27228398-28406)。国内在昆虫抗菌肽方面的研究较多，肢口纲中鲎抗真菌肽的表达也有报道，在抗菌肽转基因植物方面也取得了可喜的成果，但甲壳纲动物抗菌肽的研究尚未见报道。
抗菌肽的作用机理与传统抗生素不同，它的靶位点主要是病原体细胞膜，因此不易产生抗性，并且抗菌肽对真核细胞几乎没有作用，仅仅作用原核细胞和发生病变的真核细胞。抗菌肽不仅作用于革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌，而且也作用于真菌、原虫、某些病毒和肿瘤细胞，同时，还能加速免疫和伤口愈合过程(赵东红等，1999，昆虫抗菌肽的功能、作用机理与分子生物学研究最新进展，生物工程进展19(5)14-18)。特别是部分抗菌肽对一些临床耐药致病菌也有良好的抗菌作用，同时抗真菌肽的发现，对棘手的人类真菌病的治疗提供了新的思路。更为引人关注的是昆虫抗菌肽对癌细胞有杀伤作用，而对人体细胞无任何无不良影响，这是目前使用的肿瘤化疗药物所不具备的特性。在目前许多病原菌对现有抗生素逐步产生抗药性，而新的抗生素的发现极其困难的情况下，抗菌肽为开发新的抗细菌、抗真菌、抗病毒和抗肿瘤药物开辟了广阔的前景。目前已经引起了人们的浓厚兴趣，国外已有一些公司投入大量人力物力进行肽类抗生素的研究。总之，昆虫抗菌肽的研究不仅在理论上具有重要意义，而且在实践上具有巨大的应用潜力，因此，它已成为当今生物医药研究的热点之一。
发明内容本发明利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、嵌套聚合酶链式反应(Nested-PCR)、3’端cDNA快速扩增(3’RACE)以及Smart cDNA的方法，从对中国对虾抗菌肽进行了研究，首次从中国对虾中克隆到了1种抗菌肽基因，称为中国对虾肽基因，用于抗菌肽基因的重组表达和基因转移，并为对虾病防治和进一步开发为医药产品奠定基础。
本发明从中国对虾中克隆到了一种抗菌肽基因，它具有SEQ ID NO 1所示的序列序列表同系基因一(1)SEQ ID NO 1的信息(a)序列特征*长度600碱基对*类型核酸*链型双链*拓扑结构线性(b)分子类型cDNA(c)假设否(d)反义否(e)最初来源对虾(Penaeus chinensis)(f)序列描述SEQ ID NO.1ATGCGCCTCGTGGTCTGCCTGGTCTTCTTGGCCTCCTTCGCCCTGGTCTGCCAAGGGCAA60AAGGGTGGTTACACACGCCCGATATCCAGACCACCCTATGGGGGAGGATATGGCAATGTT120TGCACTTCATGCCACGTTCTTACCACCTCACAAGCTCGTTCTTGCTGCAGTCGGTTTGGA180CGTTGCTGTGTGCCAAGAAGAGGATACAGTGGTTGATGAAGAAGACAACGAAAACCTGAC240TTCACAACGTATTCATTAATTGTGAAGAGACTGCAACCCTGATTTTGAACTGTATTTTCT300CGTTCCATTTTTTTTACTTTTGCTTGTGGAAAGGATGCTTTGCAAGGATGCACTAAAGAT360TTTTCCATGATTGCCTGATGAATGAAAGTGCATGTGGGATGTAAGTGCATTTGTCCCAGC420AGGTCCTCGTGTATTCATGATTTGTAACACACGAGAAAGAATACTTGTTGTTTGACTTTC480ATTGTAATTAATTGTACGCATGGGTCTGTGTGTGGTTGGTGATTGCATATTTCCCGAAGG540ACATTTGGAATAGTACTACTCCTTTACAAATAAAATCGATAACTGCAAAAAAAAAAAAAA 600(2)SEQ ID NO.2的信息(a)序列特征*长度71氨基酸*类型氨基酸*链型单链*拓扑结构线性(b)分子类型肽(c)序列描述MRLVVCLVFL ASFALVCQGQ KGGYTRPISR PPYGGGYGNV CTSCHVLTTS1 10 20 30 40 50QARSCCSRFG RCCVPRRGYSG60 71本发明从中国对虾中克隆上述抗菌肽基因的方法包括(1)从中国对虾的血细胞中提取总RNA，(2)然后进行cDNA第一链合成，(3)利用两对简并引物嵌进行逆转录PCR和嵌套PCR，得到对虾抗菌肽基因片段，正向引物F15’ATG CGC CTC GTG GTC TG 3’，反向引物R15’TCC TTT TAC TAA ITG ICA ICA 3’正向引物F25’TAC AIG GGC GGT TAC AC 3’反向引物R25’CCG AAC TTG ATG CAG CA 3’(4)又用一条特异性正向引物F35’-TAC AGG GGC GGT TAC ACA CG-3’，进行cDNA 3’端快速扩增(3’RACE)，(5)然后进行对虾抗菌肽cDNA 5’端克隆。
本发明的关键技术是获得高质量的RNA，我们采用Catrimox-14TMRNA分离试剂盒(宝生物公司，日本)，可以得到较好的结果。
具体操作条件如下1.总RNA提取从中国对虾的第一腹节基部腹窦抽取血淋巴，收集血细胞。根据宝生物工程(大连)有限公司Catrimox-14TMRNA提取试剂盒说明进行，自离心收集的血细胞中提取总RNA。2.cDNA第一链合成据上海生工生物工程技术服务有限公司cDNA合成试剂盒说明书进行。3.对虾抗菌肽cDNA片段克隆(1)根据已报道的凡那对虾抗菌肽成熟肽的基因序列，采用对虾偏爱的密码子设计两对简并引物，用于RT-PCR和嵌套PCR，得到对虾抗菌肽基因片段。正向引物F15’ATG CGC CTC GTG GTC TG 3’，反向引物R15’TCC TTT TAC TAA ITG ICA ICA 3’正向引物F25’TAC AIG GGC GGT TAC AC 3’反向引物R25’CCG AAC TTG ATG CAG CA 3’(2)用所设计第一对外引物F1、R1，以合成的cDNA为模板进行第一次聚合酶链式反应(PCR)。聚合酶链式反应(PCR)的试剂与条件10xTaq DNA聚合酶缓冲液5微升(μl)模板cDNA 1μl正向引物(1.25μg/μl) 1μl反向引物(1.25μg/μl) 1μl脱氧核苷酸混合物(dNTP)4μlExTaq DNA聚合酶 0.25μl灭菌水37.75μl总体积50μlPCR反应程序为94℃预变性2min，然后进入下列循环94℃30s，50℃45s，72℃30s，35个循环，最后72℃延伸10min，2％琼脂糖凝胶电泳检测。
(3)再以第1次PCR产物为模板，用F2、R2为引物，进行第二次PCR，PCR退火温度改为51℃，其余与前面相同。取50μl扩增产物进行制备电泳，用胶纯化试剂盒进行DNA的回收和纯化，再与pUCm-T载体连接，转化DH5α菌株，进行蓝白斑筛选，挑取单克隆白斑扩增培养后，提取质粒，用限制性内切酶PstI酶切和F2、R2为引物做PCR检测，确认插入片段大小后进行测序。4.对虾抗菌肽cDNA 3’端快速扩增(3’RACE)根据得到的抗菌肽基因片段序列，又设计一条特异性正向引物F35’-TAC AGG GGC GGTTAC ACA CG-3’，进行cDNA 3’端快速扩增，操作步骤按宝生物3’RACE试剂盒说明书进行。
取血细胞总RNA约20μg，其他试剂的调制和反应条件按说明书进行。用特异性引物F3与3’接头引物进行3’端PCR扩增，采用55℃退火，其余与上述的PCR扩增程序相同，对所得产物按前述方法进行克隆、验证和测序。5.对虾抗菌肽cDNA 5’端克隆按CLONTECH公司(美国)SMARTTMPCR cDNA文库构建试剂盒说明书进行，包括下列步骤(1)第一链cDNA合成1.0μlRNA样品(0.05-1.0μg总RNA)1μl SMART寡核苷酸(5’TACGGCTGCGAGAAGACGACAGAAGGG-3’)1μl CDS/3’PCR引物(Oligo(dT)30N-1N；N＝A、G、C或T，N-1＝A、G或C)2.0μl水将上述试剂在0.5ml离心管内混匀，72℃孵育2分钟。再冰浴2分钟，然后加入下列试剂2.0μl 5x第一链缓冲液1.0μl DTT(20mM)1.0μl dNTP(10mM)1.0μl MMLV逆转录酶10μl 总体积混匀，42℃孵育1小时，冰浴终止反应。
(2)cDNAD的长PCR扩增模板用上述合成cDNA，正向引物为5’PCR引物5’-TACGGCTGCGAGAAGACGACAGAA-3’，逆向引物为CDS/3’PCR引物，其余试剂与上述PCR反应相同，DNA聚合酶均为为ExTaq聚合酶，总体积为50μl。反应条件为95℃1分钟，然后进入下列循环95℃15秒。68℃5分钟，共进行22个循环。
(3)以长PCR扩增的cDNA为模板，以试剂盒提供的5’PCR引物和反向引物R1为引物进行第一次PCR扩增，然后再以此次PCR产物为模板，用F1和特异性反向引物R35’ACAGCA ACG TCC AAA CCG ACT G 3’进行第二次PCR扩增，从而获得了对虾抗菌肽cDNA的全部信号肽和部分成熟肽序列。6.对虾抗菌肽cDNA序列验证根据拼接得到的对虾抗菌肽cDNA全序列的5’和3’端特异性序列，设计1对特异性引物进行全长序列扩增，再测序验证。通过网上相似性和同源性检索，提示对虾抗菌肽可以抑制革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌生长，也可以抑制真菌生长。对虾抗菌肽的分子量很小，不会引起人体产生免疫反应，有很大的药用开发的前景，或者用于对虾病的防治。
具体实施方式
实施例1.一种克隆的中国对虾抗菌肽基因，具有如下序列序列表同系基因一(1)SEQ ID NO 1的信息(a)序列特征*长度600碱基对*类型核酸*链型双链*拓扑结构线性(b)分子类型cDNA(c)假设否(d)反义否(e)最初来源对虾(Penaeus chinensis)(f)序列描述SEQ ID NO.1ATGCGCCTCGTGGTCTGCCTGGTCTTCTTGGCCTCCTTCGCCCTGGTCTGCCAAGGGCAA60AAGGGTGGTTACACACGCCCGATATCCAGACCACCCTATGGGGGAGGATATGGCAATGTT120TGCACTTCATGCCACGTTCTTACCACCTCACAAGCTCGTTCTTGCTGCAGTCGGTTTGGA180CGTTGCTGTGTGCCAAGAAGAGGATACAGTGGTTGATGAAGAAGACAACGAAAACCTGAC240TTCACAACGTATTCATTAATTGTGAAGAGACTGCAACCCTGATTTTGAACTGTATTTTCT300CGTTCCATTTTTTTTACTTTTGCTTGTGGAAAGGATGCTTTGCAAGGATGCACTAAAGAT360TTTTCCATGATTGCCTGATGAATGAAAGTGCATGTGGGATGTAAGTGCATTTGTCCCAGC420AGGTCCTCGTGTATTCATGATTTGTAACACACGAGAAAGAATACTTGTTGTTTGACTTTC480ATTGTAATTAATTGTACGCATGGGTCTGTGTGTGGTTGGTGATTGCATATTTCCCGAAGG540AGATTTGGAATAGTAGTACTCCTTTACAAATAAAATCGATAACTGCAAAAAAAAAAAAAA 600(2)SEQ ID NO.2的信息(b)序列特征*长度71氨基酸*类型氨基酸*链型单链*拓扑结构线性(b)分子类型肽(c)序列描述MRLVVCLVFL ASFALVCQGQ KGGYTRPISR PPYGGGYGNV CTSCHVLTTS1 10 20 30 40 50QARSCCSRFG RCCVPRRGYSG60 71实施例2.中国对虾抗菌肽基因的克隆方法1.总RNA提取从10cm以上中国对虾的第一腹节基部腹窦抽取血淋巴，内加1/10体积的抗凝剂(10％柠檬酸钠，pH7)和终浓度为200μM的苯基硫脲(作为黑化抑制剂)。30毫升血淋巴在4℃700g离心15分钟，收集血细胞。将收集的血细胞用日本宝生物公司RNA提取试剂盒CatrimoxTM提取总RNA。
2.cDNA第一链合成约30微克总RNA，加反应液20微升(50毫摩尔氯化钾，3毫摩尔氯化镁，10毫摩尔三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(Tris-HCl)pH8.3，1毫摩尔二硫苏糖醇(DTT)，5微摩尔寡聚脱氧胸腺核苷酸(Oligod(T)17)，500微摩尔脱氧核糖核苷酸混合物(dNTP)，25单位RNA酶抑制剂，8单位AMV逆转录酶)42℃反应90分钟。70℃10分钟终止反应。
3.PCR反应聚合酶链式反应(PCR)试剂与条件正向引物F15’ATG CGC CTC GTG GTC TG 3’，反向引物R15’TCC TTT TAC TAA ITG ICA ICA 3’正向引物F25’TAC AIG GGC GGT TAC AC 3’反向引物R25’CCG AAC TTG ATG CAG CA 3’首先将下列试剂混在一起·10xTaq DNA聚合酶缓冲液5微升(μl)·模板cDNA 1μl·正向引物F1(1.25μg/μl) 1μl·反向引物R1(1.25μg/μl) 1μl·脱氧核苷酸混合物(dNTP)4μl·Taq DNA聚合酶 0.25μl·灭菌水37.75μl·总体积50μlPCR反应条件为首先94℃变性2分钟，然后进入下列循环94℃30秒，51℃30秒，72℃30秒，共进行30个循环，最后72℃延伸10分钟。
然后以该PCR产物为模板，以F2和R2为引物，其余条件相同，进行第二次PCR扩增，获得约120bp扩增片段。
4.反应产物纯化利用德国卡珍(QIAGEN)公司产品(QIAquick Gel Extraction Kit)，操作步骤按产品说明书进行。
5.抗菌肽基因克隆取纯化产物3微升，连接于pUCm-T载体(上海生工产品)。转化大肠杆菌DH5α菌株，在含有安苄青霉素(100微克/毫升)和5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷(X-gal 0.2微克/毫升)的平板生长过夜，挑取3个白斑，在LB液体培养基(5毫升，含100微克/毫升安苄青霉素)过夜培养。
6.质粒纯化收取过夜培养菌液1-2毫升，离心(10000转，1分钟)收集细胞。用微量DNA纯化试剂盒(Wizard plus SV Minipreps DNA Purification System，美国普洛麦Promega公司)纯化质粒，纯化步骤按说明书进行。
7.序列测定与同源检索取纯化质粒2-5微升，用载体引物T7进行全自动测序(上海生工公司)，将所得序列与基因库序列比较。
8.对虾抗菌肽cDNA 3’和5’端克隆基本程序与上述相同。
根据得到抗菌肽基因片段后，又用一条特异性正向引物F35’-TAC AGG GGC GGT TACACA CG-3’，进行cDNA 3’端快速扩增，操作步骤按宝生物3’RACE试剂盒说明书进行。
取血细胞总RNA约20μg，其他试剂的调制和反应条件按说明书进行。用特异性引物F3与3’接头进行3’端PCR扩增，采用55℃退火，其余与上述的PCR扩增程序相同，对所得产物按前述方法进行克隆、验证和测序。
对虾抗菌肽cDNA 5’端克隆如下按美国克隆技术公司(CLONTECH)SMARTTMPCR cDNA文库构建试剂盒说明书进行，包括下列步骤(1)第一链cDNA合成1.0μl RNA样品(0.8μg总RNA)1μlSMART寡核苷酸(5’TACGGCTGCGAGAAGACGACAGAAGGG-3’)1μlCDS/3’PCR引物(Oligo(dT)30N-1N；N＝A、G、C或T，N-1＝A、G或C)2.0μl 水将上述试剂在0.5ml离心管内混匀，72℃孵育2分钟。再冰浴2分钟，然后加入下列试剂2.0μl 5x第一链缓冲液1.0μl DTT(20mM)1.0μl dNTP(10mM)1.0μl MMLV逆转录酶10μl 总体积混匀，42℃孵育1小时，冰浴终止反应。
(2)cDNAD的长PCR扩增模板用上述合成cDNA，正向引物为5’PCR引物5’-TACGGCTGCGAGAAGACGACAGAA-3’，逆向引物为CDS/3’PCR引物，其余试剂与上述PCR反应相同，DNA聚合酶均为为ExTaq聚合酶，总体积为50μl。反应条件为95℃1分钟，然后进入下列循环95℃15秒。68℃5分钟，共进行22个循环。
(3)以长PCR扩增的cDNA为模板，以试剂盒提供的5’PCR引物和反向引物R1为引物进行第一次PCR扩增，然后再以此次PCR产物为模板，用F1和特异性反向引物R35’ACAGCA ACG TCC AAA CCG ACT G 3’进行第二次PCR扩增，从而获得了对虾抗菌肽cDNA的全部信号肽和部分成熟肽序列。
对虾抗菌肽cDNA序列验证根据拼接得到的对虾抗菌肽cDNA全序列的5’和3’端特异性序列，设计1对特异性引物进行全长序列扩增，再测序验证。
序列表同系基因一(1)SEQ ID NO 1的信息(a)序列特征*长度600碱基对*类型核酸*链型双链*拓扑结构线性(b)分子类型cDNA(c)假设否(d)反义否(e)最初来源对虾(Penaeus chinensis)(f)序列描述SEQ ID NO.1ATGCGCCTCGTGGTCTGCCTGGTCTTCTTGGCCTCCTTCGCCCTGGTCTGCCAAGGGCAA60AAGGGTGGTTACACACGCCCGATATCCAGACCACCCTATGGGGGAGGATATGGCAATGTT120TGCACTTCATGCCACGTTCTTACCACCTCACAAGCTCGTTCTTGCTGCAGTCGGTTTGGA180CGTTGCTGTGTGCCAAGAAGAGGATACAGTGGTTGATGAAGAAGACAACGAAAACCTGAC240TTCACAACGTATTCATTAATTGTGAAGAGACTGCAACCCTGATTTTGAACTGTATTTTCT300CGTTCCATTTTTTTTACTTTTGCTTGTGGAAAGGATGCTTTGCAAGGATGCACTAAAGAT360TTTTCCATGATTGCCTGATGAATGAAAGTGCATGTGGGATGTAAGTGCATTTGTCCCAGC420AGGTCCTCGTGTATTCATGATTTGTAACACACGAGAAAGAATACTTGTTGTTTGACTTTC480ATTGTAATTAATTGTACGCATGGGTCTGTGTGTGGTTGGTGATTGCATATTTCCCGAAGG540ACATTTGGAATAGTACTACTCCTTTACAAATAAAATCGATAACTGCAAAAAAAAAAAAAA 600(2)SEQ ID NO.2的信息(a)序列特征*长度71氨基酸*类型氨基酸*链型单链*拓扑结构线性(b)分子类型肽(c)序列描述MRLVVCLVFL ASFALVCQGQ KGGYTRPISR PPYGGGYGNV CTSCHVLTTS1 10 20 30 40 50QARSCCSRFG RCCVPRRGYSG60 7权利要求
1.一种克隆的中国对虾抗菌肽基因，其特征在于，具有SEQ ID NO 1所示的序列同系基因一(1)SEQ ID NO 1的信息(a)序列特征*长度600碱基对*类型核酸*链型双链*拓扑结构线性(b)分子类型cDNA(c)假设否(d)反义否(e)最初来源对虾(Penaeus chinensis)(f)序列描述SEQ ID NO.1ATGCGCCTCGTGGTCTGCCTGGTCTTCTTGGCCTCCTTCGCCCTGGTCTGCCAAGGGCAA60AAGGGTGGTTACACACGCCCGATATCCAGACCACCCTATGGGGGAGGATATGGCAATGTT120TGCACTTCATGCCACGTTCTTACCACCTCACAAGCTCGTTCTTGCTGCAGTCGGTTTGGA180CGTTGCTGTGTGCCAAGAAGAGGATACAGTGGTTGATGAAGAAGACAACGAAAACCTGAC240TTCACAACGTATTCATTAATTGTGAAGAGACTGCAACCCTGATTTTGAACTGTATTTTCT300CGTTCCATTTTTTTTACTTTTGCTTGTGGAAAGGATGCTTTGCAAGGATGCACTAAAGAT360TTTTCCATGATTGCCTGATGAATGAAAGTGCATGTGGGATGTAAGTGCATTTGTCCCAGC420AGGTCCTCGTGTATTCATGATTTGTAACACACGAGAAAGAATACTTGTTGTTTGACTTTC480ATTGTAATTAATTGTACGCATGGGTCTGTGTGTGGTTGGTGATTGCATATTTCCCGAAGG540ACATTTGGAATAGTACTACTCCTTTACAAATAAAATCGATAACTGCAAAAAAAAAAAAAA 600(2)SEQ ID NO.2的信息(a)序列特征*长度71氨基酸*类型氨基酸*链型单链*拓扑结构线性(b)分子类型肽(c)序列描述MRLVVCLVFL ASFALVCQGQ KGGYTRPISR PPYGGGYGNV CTSCHVLTTS1 10 20 30 40 50QARSCCSRFG RCCVPRRGYSG60 71
2.一种权利要求1所述中国对虾抗菌肽基因的克隆方法，其特征在于，包括(1)从中国对虾的血细胞中提取总RNA，(2)然后进行cDNA第一链合成，(3)利用两对简并引物进行RT-PCR和嵌套PCR，得到对虾抗菌肽基因片段，正向引物F15’ATG CGC CTC GTG GTC TG 3’，反向引物R15’TCC TTT TAC TAA ITG ICA ICA 3’正向引物F25’TAC AIG GGC GGT TAC AC 3’反向引物R25’CCG AAC TTG ATG CAG CA 3’(4)又用一条特异性正向引物F35’-TAC AGG GGC GGT TAC ACA CG-3’，进行cDNA 3’端快速扩增，(5)然后进行对虾抗菌肽cDNA 5’端克隆。
3.如权利要求2所述中国对虾抗菌肽基因的克隆方法，其特征在于，所述的提取总RNA是从中国对虾的第一腹节基部腹窦抽取血淋巴，收集血细胞，根据宝生物工程(大连)有限公司Catrimox-14TMRNA提取试剂盒说明进行，自离心收集的血细胞中提取总RNA。
4.如权利要求2所述中国对虾抗菌肽基因的克隆方法，其特征在于，所述的对虾抗菌肽cDNA片段克隆步骤如下用第一对外引物F1、R1，以合成的cDNA为模板进行第一次聚合酶链式反应，试剂与条件10xTaq DNA聚合酶缓冲液5微升(μl)模板cDNA 1μl正向引物(1.25μg/μl) 1μl反向引物(1.25μg/μl) 1μl脱氧核苷酸混合物(dNTP) 4μlExTaq DNA聚合酶 0.25μl灭菌水37.75μl总体积50μlPCR反应程序为94℃预变性2min，94℃30s(秒)，50℃45s，72℃30s，35个循环，最后72℃延伸10min，2％琼脂糖凝胶电泳检测；再以第1次PCR产物为模板，用F2、R2为引物，进行第二次PCR，PCR退火温度改为51℃，其余与前面相同，取50μl扩增产物进行制备电泳，用胶纯化试剂盒进行DNA的回收和纯化，再与pUCm-T载体连接，转化DH5α菌株，进行蓝白斑筛选，挑取单克隆白斑扩增培养后，提取质粒，用PstI酶切和F2、R2为引物做PCR检测，确认插入片段大小后进行测序。
5.如权利要求2所述中国对虾抗菌肽基因的克隆方法，其特征在于，所述的对虾抗菌肽cDNA 3’端快速扩增，步骤如下得到抗菌肽基因片段后，又设计一条特异性正向引物F35’-TAC AGG GGC GGT TAC ACACG-3’，进行cDNA 3’端快速扩增，操作步骤按宝生物3’RACE试剂盒说明书进行，取血细胞总RNA约20μg，其他试剂的调制和反应条件按说明书进行，用特异性引物F3与3’接头进行3’端PCR扩增，采用55℃退火，对所得产物进行克隆、验证和测序。
6.如权利要求2所述中国对虾抗菌肽基因的克隆方法，其特征在于，所述的对虾抗菌肽cDNA 5’端克隆步骤如下(1)第一链cDNA合成1.0μl RNA样品(0.05-1.0μg总RNA)1μlSMART寡核苷酸(5’TACGGCTGCGAGAAGACGACAGAAGGG-3’)1μlCDS/3’PCR引物(Oligo(dT)30N-1N；N＝A、G、C或T，N-1＝A、G或C)2.0μl 水将上述试剂在0.5ml离心管内混匀，72℃孵育2分钟，再冰浴2分钟，然后加入下列试剂2.0μl 5x第一链缓冲液1.0μl DTT(20mM)1.0μl dNTP(10mM)1.0μl MMLV逆转录酶10μl 总体积混匀，42℃孵育1小时，冰浴终止反应；(2)cDNA的长PCR扩增模板用上述合成cDNA，正向引物为5’PCR引物5’-TACGGCTGCGAGAAGACGACAGAA-3’，逆向引物为CDS/3’PCR引物，其余试剂与上述PCR反应相同，DNA聚合酶均为为ExTaq聚合酶，总体积为50μl，反应条件为95℃1分钟，然后进入下列循环95℃15秒。68℃5分钟，共进行22个循环；(3)以长PCR扩增的cDNA为模板，以试剂盒提供的5’PCR引物和反向引物R1为引物进行第一次PCR扩增，然后再以此次PCR产物为模板，用F1和特异性反向引物R35’ACAGCA ACG TCC AAA CCG ACT G 3’进行第二次PCR扩增，从而获得了对虾抗菌肽cDNA的全部信号肽和部分成熟肽序列。
全文摘要
中国对虾抗菌肽基因与克隆技术,属于分子生物学技术领域。基因的序列特征为:长度:600碱基对,类型:核酸,链型:双链,拓扑结构:线性。本发明利用逆转录聚合酶链式反应(RT－PCR)、嵌套聚合酶链式反应(Nested－PCR)、3’端cDNA快速扩增(3’RACE)以及Smart cDNA的方法,从中国对虾中克隆到抗菌肽基因,用于抗菌肽基因的重组表达和基因转移,并为对虾病防治和进一步开发为医药产品奠定基础。
文档编号C12P19/00GK1381587SQ0210993
公开日2002年11月27日 申请日期2002年1月23日 优先权日2002年1月23日
发明者王金星, 赵小凡, 相建海 申请人:山东大学