专利名称：一种人/山羊肝嵌合模型的建立及其鉴定方法
技术领域：
本发明属生物组织细胞技术领域，具体涉及建立一种人/山羊肝嵌合模型的方法及其鉴定方法造血干细胞因其来源较易和临床应用价值广泛而引起更多研究者的关注，认为造血干细胞就是循环状态中的具有可塑性的一类干细胞。因此，人干细胞跨种系移植到动物体内是否可以有效地保存和扩增它。通过此方法可以在受体中产生人的细胞，并合成有正常功能的蛋白质，从而达到治疗某些疾病的目的。
还有报道在妊娠的适当时期进行宫内移植已经制成了嵌合体的小鼠、绵羊和猴。利用逆转录病毒将外源基因导入免疫系统成熟前的胎羊体内，产生了表达外源基因的嵌合绵羊。这类动物对于外源基因及其表达产物都产生了免疫耐受。在植入β-半乳糖苷酶基因的受体绵羊中已发现有其蛋白产物的表达。这类实验为探索用干细胞移植技术治疗疾病提供了线索。
本发明采用了人/山羊造血干细胞异种移植模型，作为一种新的受体进行人造血干细胞的移植潜能研究。与绵羊相比，山羊平均体重15-25公斤，易于饲养，体重和大小及其多胎妊娠特点适合实验操作和研究。本发明经动物实验证实在移植山羊的肝脏中带有人抗人细胞核因子抗原(PCNA)和抗人肝细胞特异抗原(HSA)的肝细胞，不但证实人源性细胞的存在，而且证明这些细胞在胎山羊肝脏内可以分化。本发明动物实验中一只受体羊中大量表达PCNA，其他三只受体羊表达活性中等。人造血干细胞在受体羊体内发生部分分化，但仍可保持表型稳定长达10个月。
本发明通过以下方法建立人/山羊肝嵌合模型1、构建人/山羊肝细胞嵌合移植模型首先收集新鲜人脐血，然后分离出人HSC，将分离的HSC移植入胎山羊腹腔中。整个过程在8-16小时内完成。待胎羊分娩后3个月、6个月、10个月分别抽取静脉血进行检测，验证山羊体内确实嵌合有人HSC及其含量和分化程度。在此基础上获得人/山羊肝细胞嵌合模型。
2、鉴定人/山羊HSC移植模型肝细胞嵌合体(1)鉴定山羊造血系的嵌合，采用了一系列人特异的CD抗原的单克隆抗体，常规选择CD20/CD7；GPA/CD45；D34/CD15；CD14/38(PE/FITC标记)以及CD3，CD4，CD8，CD56等单抗进行FACS测定。
应用流式细胞仪技术(FACS)进行检测。经移植的山羊外周血DNA和RNA分别用PCR和RT-PCR方法检测是否有人CD34和血型糖蛋白A的存在和表达。
(2)免疫组织化学分析肝脏组织取血液标本鉴定阳性山羊肝脏进行免疫组织化学和流式细胞仪分析。正常山羊肝组织为对照。人肝组织取自意外死亡的正常健康个体肝组织标本。
肝组织标本固定于4％中性福尔马林液中，石蜡包埋，切片厚度4μm，用0.05％胰蛋白酶稀释至1∶250，37℃5分钟修复抗原。在过氧化物酶耦联的免疫染色中，内源性的过氧化物酶用0.3％的过氧化氢灭活。非特异性抗原用5％正常马血清封闭。然后用抗人增殖细胞核抗原(PCNA)的单抗孵育。用抗生物素蛋白—生物素复合物法染色，光镜观察结果。
(3)流式细胞仪分析肝组织PBS充分冲洗新鲜肝组织去除血迹，于冰内用含1mM EDTA的PBS匀浆化。溶胞产物用纱布滤除组织块，然后在含0.002％的胶原酶(II型)和10u/ml的DNA酶溶液中37℃温育20分钟。得富集的单个肝脏细胞悬液。肝细胞(约108个)在含有0.05％Triton X-100的PBS中重悬用以增加膜的通透性。血清封闭后，细胞用抗人HSA的单抗4℃温育20分钟。清洗后加PE结合抗鼠IgG的抗体4℃放置20分钟，进行FACS检测。
(4)表达hHNF-3β和hALB mRNA经筛选确定人肝细胞核因子(hHNF-3β)，和人血清白蛋白(hALB)的mRNA表达，作为检测山羊肝组织中人肝细胞基因表达的依据。前者是人肝脏发育早期表达的一种特异性标记蛋白而后者是人肝脏组织表达的一种特异性蛋白。以此确定山羊肝中有人源性肝细胞并具有活性。具体步骤如下①反转录酶反应(RT)取RNA(0.5～1μg)3μl，寡聚脱氧胸腺嘧啶0.5μl，RNA酶抑制剂0.5μl，焦碳酸二乙脂处理水(DEPC·H2O)8μl混和，置70℃水浴10分钟后，插入冰中，再依次加入5倍浓度反转录缓冲液(5×buffer)4μl，0.1M二硫苏糖醇(DTT)2μl，脱氧酸核苷酸混合液(dNTPs)(10mM)1μl，逆转录酶(MMLV)200u 1μl，取上述混合液置37℃1小时。
②设计RT-PCR引物人肝细胞核因子(hHNF-3β)mRNA的目的片段为368bp，上下游引物分分别为5′-CCTACGCCAACATGAACTCC-3′和5′-GTAGCAGCCGTTCTCGAACA-3′；特异于人血清白蛋白(hALB)mRNA的PCR引物的设计已知人与羊的ALBcDNA具有80％的同源性，本发明设计了多组能扩增ALBcDNA的引物。通过比较，选择了最合适的引物作为本发明常规PCR扩增hALBcDNA的引物。其上游引物(A)相当于hALBcDNA的第450位核苷酸至468位核苷酸，下游引物(B)相当于hALBcDNA的第830位核苷酸至849位核苷酸。用于指导扩增hALBcDNA共400bp的核苷酸片段。
上下游引物序列分别为5′-CCGATTGGTGAGACCAGAG-3′和5′-GCAGCATTCCGTGTGGACT-3′③用RT-PCR法检测人肝细胞核因子(hHNF-3β)使用国产0.5ml Tip管。PCR试剂购自TAKARA公司。总反应体积25μl。PCR反应时每管加入10×buffer2.5μl、dNTP2.0μl(2.5mM/μl)、引物HNFβ-1 1μl(10pmol/μl)、HNFβ-2 0.2μl(10pmol/μl)、TaqE(5u/μl)、H2O 17.7μl(灭菌水)、cDNA模板1μl(10-50ng)，加入石蜡油。放入Eppendorf Mastercycler Gradient PCR仪中进行PCR检测。
反应条件94℃变性5分钟后，进入PCR循环94℃1分钟，56-63℃45秒钟，72℃1分钟，最后在72℃延伸10分钟。进行30-32次循环。
④用RT-PCR法检测人血清白蛋白(hALB)使用国产0.5ml Tip管。PCR试剂购自TAKARA公司。总反应体积25μl。PCR反应时每管加入10×buffer2.5μl、dNTP2.0μl(2.5mM/μl)、引物A 1μl(10pmol/μl)、引物B 1μl(10pmol/μl)、TaqE(5u/μl)0.2μl、H2O 17.7μl(灭菌水)、cDNA模板1μl(约为10-50ng)，加入石蜡油。放入Eppendorf Mastercycler Gradient PCR仪中进行PCR检测。反应条件94℃变性5分钟后，进入PCR循环94℃1分钟，52-64℃1分钟，72℃1-2分钟，最后在75℃延伸10分钟。进行30次循环。
⑤检测PCR产物PCR产物用3％NuSieve琼脂糖凝胶电泳40mA、1小时溴化乙锭染色后观察结果。
RT-PCR结果显示在正常人和受体山羊肝脏都有特异性368bp的hHNF-3β片段和400bp hALB的片段存在。正常对照组山羊和未成功植入HSC的山羊均无上述片段出现。
本发明实验结果如下1、山羊嵌合体的鉴定FACS分析发现在移植HSC的山羊血液中人的CD抗原(包括CD14，CD20，CD34和GPA)占较大比例，但正常对照羊中未见。PCR和RT-PCR分析证实移植后山羊白细胞中存在人的CD34和GPA抗原。上述结果表明人的HSC已成功植入受体羊中。
2、山羊肝组织的免疫化学分析正常人肝脏标本用作阳性对照，所有细胞显示人肝细胞核PCNA染色阳性。对照组羊肝标本不同部位的切片均呈阴性，而移植HSC的羊肝脏标本中发现有细胞核PCNA染色阳性的人源肝细胞存在。
正常人肝脏标本和HSC移植山羊肝脏均有人HSA染色阳性的细胞，证明山羊肝内有人源性细胞。
3、FACS检测山羊体内的人肝细胞移植后山羊肝匀浆中检出有人HSA表达，正常对照组山羊无人HSA表达。
4、hHNF-3β和hALB mRNA的表达RT-PCR显示在正常人肝脏标本和受体山羊肝脏均有特异性368bp的hHNF-3β片段和400bp hALB的片段存在。正常对照组山羊和未成功植入HSC的山羊则无上述片段出现。证明上述所表达的人源性细胞是有功能的。
B嵌合山羊肝脏组织有HSA染色阳性细胞C对照组山羊肝脏细胞不显色图3是嵌合山羊肝脏细胞用HSA标记后进行FACS分析其中M1对照组山羊M2实验组山羊图4是对嵌合山羊肝脏组织用RT-PCR方法分析人肝细胞核因子(hHNF-3β)和人血清白蛋白(hALB)mRNA的表达情况，产物在恒电流40mA下3％琼脂糖凝胶电泳分析结果其中AhHNF-3β mRNA表达情况M100bp DNA梯度标记1未移植人HSC的山羊，hHNF-3β mRNA不表达2-4移植人HSC的受体羊，有hHNF-3β mRNA表达5空白对照，6人肝脏组织，有hHNF-3β mRNA表达7人脐血，hHNF-3β mRNA不表达8人血，hHNF-3β mRNA不表达BhALB mRNA表达情况M10bp DNA梯度标记1未移植人HSC的对照山羊，hALB mRNA不表达2-4移植人HSC的受体羊，有hALB mRNA表达5空白对照6人肝脏组织，有hALB mRNA表达
权利要求
1.一种建立人/山羊肝细胞嵌合模型的方法，其特征在于通过下述步骤进行1)构建人/山羊肝细胞嵌合移植模型在建立人/山羊造血干细胞异种移植模型的基础上，进行人特异CD抗原单克隆抗体和流式细胞仪技术检测以及分析鉴定山羊外周血DNA和RNA的人CD34和血型糖蛋白A的存在和表达，得人/山羊肝细胞嵌合模型，2)免疫组织化学法和流式细胞仪分析肝组织细胞，用RT-PCR方法鉴定检测人肝细胞核因子及人血清白蛋白mRNA的表达，3)表达hHNF-3β和hALB mRNA
2.按权利要求1所述的方法，所述的移植的山羊外周血DNA和RNA检测方法是分别用PCR和RT-PCR方法检测人CD34和血型糖蛋白A的存在和表达分析，建立人/山羊造血干细胞异种移植模型的鉴定方法。
3.按权利要求1的方法，所述的用于鉴定检测人肝细胞核因子及人血清白蛋白mRNA的表达RT-PCR方法包括①反转录酶反应，②设计RT-PCR引物，③检测人肝细胞核因子和人血清白蛋白，④检测PCR产物。
4.按权利要求3的方法，所述的反转录酶反应是取RNA(0.5～1μg)3μl，寡聚脱氧胸腺嘧啶0.5μl，RNA酶抑制剂0.5μl，焦碳酸二乙脂处理水8μl混和，置70℃水浴10分钟后，插入冰中，再依次加入5倍浓度反转录缓冲液4μl，0.1M二硫苏糖醇2μl，脱氧酸核苷酸混合液(10mM)1μl，逆转录酶200u 1μl，取上述混合液置37℃1小时。
5.按权利要求3的方法，所述的人肝细胞核因子其上下游引物分分别为5′-CCTACGCCAACATGAACTCC-3′和5′-GTAGCAGCCGTTCTCGAACA-3′，人肝细胞核因子mRNA的目的片段为368bp。
6.按权利要求3的方法，所述的特异于人血清白蛋白mRNA的引物其上游引物相当于hALBcDNA的第450位核苷酸至468位核苷酸，下游引物相当于hALBcDNA的第830位核苷酸至849位核苷酸，用于指导扩增hALBcDNA共400bp的核苷酸片段。上下游引物序列分别为5′-CCGATTGGTGAGACCAGAG-3′和5′-GCAGCATTCCGTGTGGACT-3′
7.按权利要求3的方法，所述的RT-PCR法的反应条件是94℃变性5分钟后，进入PCR循环，94℃1分钟，52-64℃1分钟，在75℃延伸10分钟，进行30-32次循环。
8.按权利要求3的方法，所述的检测PCR产物，用3％NuSieve琼脂糖凝胶电泳40mA、1小时溴化乙锭染色后观察结果。
全文摘要
本发明属于生物组织细胞技术领域，具体涉及人造血干细胞异种移植山羊后，获得了人/山羊肝细胞嵌合模型。鉴定结果证实，受体山羊肝内存在人源性的肝细胞并具有人肝细胞的形态学和生理学特征，表达人白蛋白等肝细胞特异表达的基因。在个体水平上证实HSC移植后在山羊身体的内环境中演化为人源性肝细胞的免疫和形态学特征，并具有人肝细胞的基因表达和功能。为HSC在体内的扩增、分化和羊肝内人源性肝细胞的检测等提供新的技术平台，开辟了HSC宫内移植研究新途径，为疾病的宫内治疗提供理论和技术依据。
文档编号C12N5/16GK1410532SQ0211112
公开日2003年4月16日 申请日期2002年3月21日 优先权日2002年3月21日
发明者曾凡一, 黄淑帧, 曾溢滔 申请人:上海凡华生物技术有限公司