染色体特异分子标记及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于作物分子生物学与遗传育种领域，具体涉及希尔斯山羊草1Ss染色体的特异分子标记的建立与应用，碱基序列见序列表，扩增图谱见附图。使用建立的希尔斯山羊草1Ss染色体特异分子标记对杂交群体的鉴定结果与基因组原位杂交鉴定结果一致性为100%，因而，建立的分子标记可以对小麦背景中是否含有希尔斯山羊草1Ss染色体进行有效检测。本发明获得的特异分子标记不仅可用于小麦-希尔斯山羊草杂交群体的筛选、鉴定，还可以应用于辅助选育籽粒微量元素含量高及高品质的小麦新品系/品种，提高筛选效率，缩短育种时间，具有积极的产业化价值。
【专利说明】希尔斯山羊草1 Ss染色体特异分子标记及其应用
[0001]
【技术领域】 本发明属于作物分子生物学与遗传育种领域，具体涉及希尔斯山羊草ISs染色体特异 分子标记的建立，还涉及所述特异分子标记在跟踪检测小麦背景中希尔斯山羊草染色体方 面的应用。
[0002]
【背景技术】 全球有超过30亿的人口处在体内缺Fe和Zn元素的"隐性饥饿"状态下，有超过2. 5 亿儿童不同程度的缺乏Fe和Zn元素（Underwood等，1998)。矿质元素特别是微量元素缺 乏和蛋白摄入量不足将增加社会医疗保健的开支，严重阻碍社会经济的发展。我国小麦籽 粒矿质元素尤其是Fe和Zn元素含量还不能满足人们的基本需求(朱展才和吴兆苏，1991 ; 张勇等，2007)，因此，需要改良我国小麦矿质元素含量来改善人们的营养状况。通过往土壤 里施用含微量元素的肥料和选择矿质含量高的小麦基因型作为亲本进行育种工作，都是 可以提高小麦籽粒Fe和Zn元素含量的有效途径。但是，在土壤偏碱性的情况下，施用微量 元素肥料也于事无补。施用微量元素肥料将增加投入成本并且施用过量还会对土壤造成污 染。因此，选择矿质元素含量高的小麦亲本或培育含有微量元素高效吸收基因的小麦品种 是最为有效和经济的手段。小麦远缘物种部分染色体上携带有控制矿质元素吸收和转运的 基因，可以利用染色体工程的方法将小麦远缘物种中携带高效吸收和转运微量元素尤其是 Fe和Zn元素的染色体或染色体片段导入小麦，达到有效提高小麦籽粒Fe和Zn元素含量的 目的。
[0003] 山羊草属（Genus JegiTrOAS)包含23个物种，均是小麦的远缘物种。该属物种的基 本基因组包括C、D、U、S、S^S'S'S'M.N和T。5个S型染色体（Sj1Jjsh和S b)和小 麦的B染色体都具有一定同源性。希尔斯山羊草Ga 染色体和拟斯卑尔脱 山羊草的S染色体都有可能是小麦B染色体的供体，这表明相比于其他 染色体，这二者可能与小麦B染色体发生重组更为容易，因此，值得在小麦育种中应用。目 前，拟斯卑尔脱山羊草的抗病和抗逆基因已经被应用于小麦抗性育种工作（Cherukuri等， 2005 ;Seyfarth等，1999 ;Helguera等，2000 ;Jia等，1996)。然而，对于希尔斯山羊草的利 用还有待于进一步加强。
[0004] 希尔斯山羊草，2n=14，基因组SsSs,高抗小麦叶锈病和白粉病（Buloichik等， 2008)、高抗小麦杆锈病（Liu等，2011)以及禾谷类二叉姆（Holubec和Havlickova, 1994)、 对干旱和盐胁迫也有较好的抗性（Nevo和Chen, 2010)。因此，该种质中的优异基因值得 进一步向小麦转移。Friebe等（1995)鉴定了一整套中国春-希尔斯山羊草附加系，为定 位优异基因在染色体上的位置提供了研究材料。以这套附加系为工具，Garg等（2009)和 Wang等（2011)将显者提商小麦品质、显者提商小麦杆粒铁和锋兀素的基因分别都定位在 了希尔斯山羊草ISs染色体上；Buloichik等（2008)将抗小麦白粉病基因定位在2S S染色 体上；Liu等（2011)将抗小麦杆锈病基因定位在3SS染色体上。
[0005] 小麦-外源物种附加系中除了含有小麦育种需要的优异基因外，还含有一些控 制不利农艺性状的基因，因此，需要利用染色体工程方法将其诱导后才能应用于小麦育 种工作。到目前为止，中国春-希尔斯山羊草3$附加系已经被成功改造并应用于小麦 抗軒镑病育种工作中（Liu WX，Jin Y，Rouse M，Friebe B，Gill BS，and Pumphrey MO. Development and characterization of wheat - Ae. searsii Robertsonian translocations and a recombinant chromosome conferring resistance to stem rust. Theor Appl Genet，2011，122:1537-1545.)。希尔斯山羊草ISs染色体的导入小麦不仅可 以提高籽粒铁锌含量，还可以提高小麦品质，但是IS s附加系尚未被利用染色体工程方法诱 导。基于此，我们开展了 ISs附加系的诱导工作。诱导群体的筛选与鉴定需要分子标记的 辅助进行，因此，希尔斯山羊草ISs染色体特异标记的建立对该工作的顺利开展起着重要作 用。在希尔斯山羊草染色体分子标记建立方面，Liu等（Liu WX，Jin Y，Rouse M，Friebe Bj Gill BSj and Pumphrey MO. Development and characterization of wheat - Ae. searsii Robertsonian translocations and a recombinant chromosome conferring resistance to stem rust. Theor Appl Genet，2011，122:1537-1545.)建立了希尔斯 山羊草3SS染色体的EST-STS标记，用这些标记鉴定了小麦-希尔斯山羊草易位系并定位 了来自希尔斯山羊草上的抗小麦軒锈病基因。Sun等（Sun X，Hu SL，Liu X，Qian WQ， Hao STj Zhang AM, Wang DW. Characterization of the HMW glutenin subunits from Aegilops searsii and identification of a novel variant HMW glutenin subunit. Theor Appl Genet，2006，113:631-641.)和 Garg 等（Garg M，Tanaka H，Ishikawa N， Takata K， Yanaka M， Tsujimoto H. A novel pair of HMW glutenin subunits from Aegilops searsii improves quality of hexaploid wheat. Cereal Chemistry, 2009， 86:26-321.)均建立了希尔斯山羊草ISs的种子蛋白标记。待测小麦材料若种植后收获种 子再进行种子蛋白检测，耗时太长而操作繁琐。然而，能用于快速、简便、实用且不依据待测 小麦整个生育期(材料发芽即可提取其DNA进行检测)的小麦背景中希尔斯山羊草IS s染色 体(或染色体片段)的PCR标记检测方法未见报道，因此，希尔斯山羊草ISs染色体PCR标记 的建立，将对其诱导群体的筛选鉴定以及高铁锌含量及高品质小麦品种选育都有很重要的 实际意义。
[0006]
【发明内容】
为了解决以上现有技术中没有希尔斯山羊草ISs染色体的PCR标记的问题，本发明提 供了一种能够快捷、有效、简便地鉴定待测样本中是否含有希尔斯山羊草ISs染色体的特异 分子标记。因此，本发明的目的是建立希尔斯山羊草IS s染色体特异分子标记，提供一种检 测小麦背景中希尔斯山羊草染色质的新方法。
[0007] 本发明还提供了所述希尔斯山羊草ISs染色体特异分子标记在杂交种质筛选与鉴 定中的应用。
[0008] 本发明是通过以下措施得到的： 本发明所提供的检测小麦背景中希尔斯山羊草ISs染色体的方法，是以待测希尔斯山 羊草、小麦-希尔斯山羊草ISs附加系及小麦对照基因组总DNA (表1)为模板，对EST-STS (expressed sequence tag-sequence tagged sites)、 EST-SSR (expressed sequence tag-simple sequence repeat)、SSR (simple sequence repeat)、COS (conserved orthologous set)和 PLUG (PCR-based landmark unique gene)引物进行筛选，筛选出能 在小麦-希尔斯山羊草ISs附加系中扩增出特异DNA条带的引物，引物筛选的统计结果见 表2。进而，用筛选出的引物对小麦-希尔斯山羊草1SS-7SS附加系、端体附加系及小麦对照 (表1)进行PCR扩增，获得小麦-希尔斯山羊草ISs附加系和相应端体附加系（ISsS或IS sL 端体附加系)中的能扩增出而小麦中不能扩增出的特异DNA条带，获得的这些特异DNA条带 则来自希尔斯山羊草ISs染色体。其检测特异扩增产物长度分别如表3所示。
[0009] EST-STS、COS和PLUG引物扩增特征在于15 μ L PCR反应体系为：25 ng/ μ L的 模板 DNA 1 μ L，5 U/μ L Taq DNA polymerase 0· 15 μ L，200 μ M 的 dNTPs，含 Mg2+的 IOX PCRbuffer 1.5 μ?，10μΜ的上、下游引物各lyL，用无菌双蒸馏水补充反应体系 至 15μ L ; PCR反应扩增程序为：94 °C预变性3 min，随后35个循环：94°C变性45 S，57°C退火45 S，72°C延伸 2 min，最后 72°C延伸 10 min，4°C保存。
[0010] EST-SSR引物扩增特征在于15 μ L PCR反应体系为：25 ng/μ L的模板DNA 1 μ L， 5 U/μ L Taq DNA polymerase 0· 15 μ L，200 μ M 的 dNTPs，含 Mg2+的 10 X PCR buffer 1. 5μ L，10μ M的上、下游引物各1 μ L，用无菌双蒸馏水补充反应体系至15μ L ; PCR反应扩增程序为：94 °C预变性3 min，随后35个循环：94°C变性45 S，52°C退火45 S，72°C延伸 2 min，最后 72°C延伸 10 min，4°C保存。
[0011] SSR引物扩增特征在于15 μ L PCR反应体系为：25 ng/μ L的模板DNA 1 μ L， 5 U/μ L Taq DNA polymerase 0· 15 μ L，200 μ M 的 dNTPs，含 Mg2+的 10 X PCR buffer 1. 5μ L，10μ M的上、下游引物各1 μ L，用无菌双蒸馏水补充反应体系至15μ L ; PCR反应扩增程序为：94 °C预变性3 min，随后35个循环：94°C变性45S，55°C退火 45S，72°C延伸 2 min，最后 72°C延伸 10 min，4°C保存。
[0012] EST-SSR，SSR和COS引物扩增产物用8 %的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳缓 冲液为1XTBE。取15μ?扩增产物，加入3yL指示剂(含0· 1%溴酚蓝和0· 1%二甲苯青)， 混匀，上样量3 μ L，180V恒定电压电泳约55min。经硝酸银染色30 min后观察照相。PLUG 和EST-STS引物的扩增产物进行2%的琼脂凝胶上电泳，电泳缓冲液为1XTAE。扩增产物 IOuL在150V恒压下电泳约25min，然后用lug/mL的溴化乙锭溶液进行染色30min，最后在 ⑶S-Gel Dol 2000紫外凝胶成像系统下扫描照像。
[0013] 依据上述方法步骤，获得一种希尔斯山羊草ISs染色体特异分子标记，一一列举如 下： 短臂引物对碱基序列如下： MAG2137-EST-SSR ： F :5' -GAGTTCGATGACATGGCTGA-3'，（见序列表中序列 1) R: :5' -CCGATAACAAAGTGCGTGAA-3' ；（见序列表中序列 2) 长臂引物对碱基序列如下： Xgwml35-SSR ： F :5' -TGTCAACATCGTTTTGAAAAGG-3'，（见序列表中序列 3) R :5' -ACACTGTCAACCTGGCAATG-3' ；（见序列表中序列 4) BG606586-EST-STS ： F :5' -GGAGAAGCAAGACCACTTCG-3'，（见序列表中序列 5) R :5' -ATGTCGAATTCCAGCACCTC-3' ；（见序列表中序列 6) BF604958-EST-STS ： F :5' -GCAAAAGAAGAAGGGGAAGG-3'，（见序列表中序列 7) R :5' -GGTCATGTTGGTGATGTTGG-3' ；（见序列表中序列 8) BF474878-EST-STS ： F :5' -CATGTATCTGGTGGTGAGCTTT-3'，（见序列表中序列 9) R:5' -GTTCACCTGTGCTTGCATTC-3' ；（见序列表中序列 10) 希尔斯山羊草ISs染色体特异分子标记为上述5对引物中的一对以上的组合或者短臂 引物对与一对以上的长臂引物对的组合。
[0014] 所述的希尔斯山羊草ISs染色体特异分子标记的应用是使用所述的希尔斯山羊草 ISs染色体特异分子标记对待测样品进行PCR扩增，对小麦背景中是否含有希尔斯山羊草 ISs染色体进行检测或辅助检测。
[0015] 检测或辅助检测步骤如下： (1) 以待测的可能含有希尔斯山羊草ISs染色体（或染色体片段）的小麦背景系的基 因组总DNA为模板，希尔斯山羊草、中国春-希尔斯山羊草ISs附加系为阳性对照，以中国春 小麦和其他4个不同小麦品种/品系为阴性对照，用权利要求1所述的希尔斯山羊草IS s染 色体特异分子标记分别对模板和对照进行PCR扩增，扩增结果使用2%琼脂糖凝胶或8%聚 丙烯酰胺凝胶(交联度为2. 5%)电泳进行检测； (2) 如果待测模板DNA凝胶电泳检测图谱中含有与阳性对照相同的特异DNA条带而阴 性对照无该带，则说明待测小麦背景系的基因组中含有希尔斯山羊草IS s染色体；如果待测 模板DNA凝胶电泳检测图谱中不含有与对照相同的特异多态性DNA条带，则说明待测小麦 背景系的基因组中不含有希尔斯山羊草IS s染色体。
[0016] 本发明的有益效果： 1、 本发明建立了希尔斯山羊草ISs染色体的新标记，提供了使用新标记检测小麦背景 中希尔斯山羊草IS s染色体的新方法。因为希尔斯山羊草ISs染色体能显著提高小麦籽粒 中微量元素 Fe和Zn含量，并且ISs的导入小麦可以显著提高小麦加工品质，因此，本发明 获得的特异分子标记可用于杂交群体的筛选、鉴定与辅助选育籽粒微量元素（Fe和Zn)含 量商及商品质的小麦新品系/品种； 2、 所筛选出的特异性分子标记，对小麦背景中是否含有希尔斯山羊草ISs染色体进行 检测或辅助检测，特异性强，检测准确率高，提高筛选效率，缩短育种时间，具有积极的产业 化价值。
[0017]
【专利附图】
【附图说明】 图1.引物MAG2137扩增产物在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶(交联度为2. 5%)中的电泳 结果，箭头所示为多态性带，其中A图为引物MAG2137对希尔斯山羊草、中国春-希尔斯山 羊草ISs附加系、一粒小麦、圆锥小麦、绵阳11、绵阳15和中国春的扩增结果，B图为引物 MAG2137对中国春-希尔斯山羊草1SS-7SSB加系和中国春的扩增结果，C图为引物MAG2137 对中国春-希尔斯山羊草IS s附加系、中国春-希尔斯山羊草ISs短臂和ISs长臂端体附加 系以及中国春的扩增结果； 图2.引物Xgwml35扩增产物在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶(交联度为2. 5%)中的电泳 结果，箭头所示为多态性带，其中A图为引物Xgwml35对希尔斯山羊草、中国春-希尔斯山 羊草ISs附加系、一粒小麦、圆锥小麦、绵阳11、绵阳15和中国春的扩增结果，B图为引物 Xgwml35对中国春-希尔斯山羊草1SS-7SS附加系和中国春的扩增结果，C图为引物Xgwml35 对中国春-希尔斯山羊草IS s附加系、中国春-希尔斯山羊草ISs短臂和ISs长臂端体附加 系以及中国春的扩增结果； 图3.引物BG606586扩增产物经限制性内切酶#沙1酶切后在2%的琼脂糖凝胶中的电 泳结果，箭头所示为多态性带，其中A图为引物BG606586对希尔斯山羊草、中国春-希尔斯 山羊草ISs附加系、一粒小麦、圆锥小麦、绵阳11、绵阳15和中国春的扩增结果，B图为引物 BG606586对中国春-希尔斯山羊草1SS-7SS附加系和中国春的扩增结果，C为引物BG606586 对中国春-希尔斯山羊草IS s附加系、中国春-希尔斯山羊草短臂和ISs长臂端体附加系的 扩增结果； 图4.引物BF604958扩增产物经限制性内切酶#沙1酶切后在2%的琼脂糖中的电泳 结果，箭头所示为多态性带，其中A图为引物BF604958对希尔斯山羊草、中国春-希尔斯 山羊草ISs附加系、一粒小麦、圆锥小麦、绵阳11、绵阳15和中国春的扩增结果，B图为引 物BF604958对中国春-希尔斯山羊草1S S-7SS附加系和中国春的扩增结果，C图为引物 BF604958对中国春-希尔斯山羊草ISs附加系、中国春-希尔斯山羊草ISs短臂和IS s长 臂端体附加系以及中国春的扩增结果； 图5.引物BF474878扩增产物经限制性内切酶你 el II酶切后在2%的琼脂糖中的电 泳结果，箭头所示为多态性带，其中A图为引物BF474878对希尔斯山羊草、中国春-希尔 斯山羊草ISs附加系、一粒小麦、圆锥小麦、绵阳11、绵阳15和中国春的扩增结果，B图为 引物BF474878对中国春-希尔斯山羊草1S S-7SS附加系和中国春的扩增结果，C图为引物 BF474878对中国春-希尔斯山羊草ISs附加系、中国春-希尔斯山羊草ISs短臂和IS s长 臂端体附加系以及中国春的扩增结果； 图6为引物MAG2137对中国春IB缺体/中国春-希尔斯山羊草ISs附加系杂交F2群 体的扩增产物在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶中的电泳图； 图7为引物Xgwml35对中国春IB缺体/中国春-希尔斯山羊草ISs附加系杂交F2群 体的扩增产物在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶中的电泳图； 图8为引物BG606586对中国春IB缺体/中国春-希尔斯山羊草ISs附加系杂交F2群 体的扩增产物经限制性内切酶酶切后在2%的琼脂糖中的电泳图； 图9为引物BF604958对中国春IB缺体/中国春-希尔斯山羊草ISs附加系杂交F2群 体的扩增产物经限制性内切酶酶切后在2%的琼脂糖中的电泳图； 图10为引物BF474878对中国春IB缺体/中国春-希尔斯山羊草ISs附加系杂交F2 群体的扩增产物经限制性内切酶酶切后在2%的琼脂糖中的电泳图； 图11为基因组原位杂交鉴定分子标记鉴定出的部分中国春IB缺体和中国春-希尔 斯山羊草ISs附加系的部分杂交F2分离群体的杂交图谱，其中，图AD分别为杂交后代植株 AS-17、AS-96、AS-189和AS-342的基因组原位杂交结果。
【具体实施方式】
[0018] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明。
[0019] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0020] 下述实施例中，如无特殊说明，所用PCR体系方法与
【发明内容】
部分的描述的PCR体 系及方法相同，所有引物合成均由成都瑞信生物公司完成。所用TA编号的实验材料(表1) 全部由美国堪萨斯州立大学小麦基因组学与遗传资源中心Gill BS教授惠赠，公众可从美 国堪萨斯州立大学小麦基因组学与遗传资源中心（http://www. k-state. edu/wgrc/)有偿 获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
[0021] 下述实施例中的绵阳11小麦（MYll)和中国春（CS) (Liu C，Yang ZJ，Li GR， Zeng ZX, Zhang Y, Zhou JP, Liu ZH, Ren ZL. 2008. Isolation of a new repetitive DNA sequence from Secale africanum enables targeting of Secale chromatin in wheat background. 159(1-2): 249-258·);绵阳 15 (MY15) (Zhou JP, Zhang HY, Yang ZJ, Li GR, Hu LJ, Lei MP, Liu C, Zhang Y, Zhang Y, Ren ZL. 2012. Characterization of a new T2DS. 2DL-?R translocation triticale ZH-I with multiple resistances to diseases. Genet Resour Crop Evol, 59(6):1161-1168. ) 1? 电子科技大学生命科学与技术学院杨足君教授提供，公众可从山东省农业科学院作物所获 得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。ASl-AS384为 中国春IB缺体/中国春-希尔斯山羊草IS s附加系杂交F2群体。
[0022] 表1供试材料
【权利要求】
1. 一种希尔斯山羊草1SS染色体特异分子标记，其特征在于 短臂引物对碱基序列如下： MAG2137-EST-SSR ： F :5, -GAGTTCGATGACATGGCTGA-3，， R: :5' -CCGATAACAAAGTGCGTGAA-3' ； 长臂引物对为下述引物对中的一对以上： Xg碰135-SSR : F :5' -TGTCAACATCGTTTTGAAAAGG-3'， R:5, -ACACTGTCAACCTGGCAATG-3,； BG606586-EST-STS ： F :5, -GGAGAAGCAAGACCACTTCG-3，， R:5' -ATGTCGAATTCCAGCACCTC-3' ； BF604958-EST-STS ： F :5, -GCAAAAGAAGAAGGGGAAGG-3，， R:5' -GGTCATGTTGGTGATGTTGG-3' ； BF474878-EST-STS ： F :5' -CATGTATCTGGTGGTGAGCTTT-3'， R:5' -GTTCACCTGTGCTTGCATTC-3' ； 希尔斯山羊草1SS染色体特异分子标记为上述5对引物中的一对以上的组合或者短臂 引物对与一对以上的长臂引物对的组合。
2. -种权利要求1所述的希尔斯山羊草1SS染色体特异分子标记的应用，其特征在于 使用权利要求1所述的希尔斯山羊草1SS染色体特异分子标记进行PCR扩增，对小麦背景 中是否含有希尔斯山羊草1SS染色体进行检测或辅助检测。
3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于检测或辅助检测步骤如下： (1) 以待测的可能含有希尔斯山羊草1^染色体或染色体片段的小麦背景系的基因组 总DNA为模板，用权利要求1所述的希尔斯山羊草1SS染色体特异分子标记分别对模板和 对照进行PCR扩增，扩增结果使用凝胶电泳进行检测； (2) 如果待测模板DNA凝胶电泳检测图谱中含有与阳性对照相同的特异DNA条带而阴 性对照无该带，则说明待测小麦背景系的基因组中含有希尔斯山羊草1^染色体；如果待测 模板DNA凝胶电泳检测图谱中不含有与对照相同的特异多态性DNA条带，则说明待测小麦 背景系的基因组中不含有希尔斯山羊草1SS染色体。
4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于步骤（1)中使用希尔斯山羊草、中国春-希 尔斯山羊草1SS附加系为阳性对照，以中国春小麦和/或其他不同小麦品种/品系为阴性 对照。
5. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于BG606586-EST-STS、BF604958-EST-STS和 BF474878-EST-STS引物对扩增特征在于15 ii L PCR反应体系为：25 ng/ ii L的模板DNA 1 u L, 5 U/uL Taq DNA polymerase 0? 15 ii L，200 ii M 的 dNTPs，含 Mg2+的 10 X PCR buffer 1.5 iiL, 10iiM的上、下游引物各1 iiL,用无菌双蒸馈水补充反应体系至15iiL; PCR反应扩增程序为：94 °C预变性3 min，随后35个循环：94°C变性45 S，57°C退火45 S，72°C延伸 2 min，最后 72°C延伸 10 min，4°C保存。
6. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于MAG2137-EST-SSR引物对扩增特征在 于 15 iiL PCR 反应体系为：25 ng/iiL 的模板 DNA liiL，5 U/iiL Taq DNA polymerase 0.15iiL，200 iiM 的 dNTPs，含 Mg2+的 10X PCRbuffer 1.5iiL，10iiM 的上、下游引物各 1 U L，用无菌双蒸馏水补充反应体系至15 y L ; PCR反应扩增程序为：94 °C预变性3 min，随后35个循环：94°C变性45 S，52°C退火45 S，72°C延伸 2 min，最后 72°C延伸 10 min，4°C保存。
7. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于Xgwml35-SSR引物对扩增特征在于15 yL PCR 反应体系为：25 ng/uL 的模板 DNA In L，5 U/uL Taq DNA polymerase 0.15 uL， 200 iiM 的 dNTPs，含 Mg2+的 10X PCRbuffer 1.5iiL，10iiM 的上、下游引物各 liiL，用无 菌双蒸馏水补充反应体系至15 y L ; PCR反应扩增程序为：94 °C预变性3 min，随后35个循环：94°C变性45S，55°C退火 45S，72°C延伸 2 min，最后 72°C延伸 10 min，4°C保存。
8. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于步骤（1)中使用2%琼脂糖凝胶或8%的交 联度为2. 5%的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测。
【文档编号】C12Q1/68GK104371996SQ201410666237
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2014年11月20日 优先权日:2014年11月20日
【发明者】刘成, 宫文英, 刘建军, 李根英, 宋健民, 李豪圣, 刘爱峰, 曹新有, 程敦公, 王灿国, 赵振东 申请人:山东省农业科学院作物研究所