一种补料生产l-茶氨酸的方法
【专利摘要】本发明涉及一种补料生产L-茶氨酸的方法，属于生物【技术领域】。本发明所解决的技术问题是提供了恒速补料和变速补料的工艺，可以提高L-茶氨酸在高浓度底物下的转化率，降低生产成本，技术方案为：采用来源于枯草芽胞杆菌来源的γ-GGTase生产L-茶氨酸；按照1:5到1:15的比例配制L-谷氨酰胺和乙胺盐酸盐，设定温度30-45℃，调pH 9.0-11.0后，按照每毫升反应液2-20个单位的量加入γ-GGTase，每2小时补加一定量的底物，反应10-20小时，得到较高浓度的L-茶氨酸。
【专利说明】一种补料生产[-茶氨酸的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种补料生产卜茶氨酸的方法，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]1-茶氨酸([-1116)，又称乙基-V -谷氨酰胺(54-61:1171- V 此肅丨加)或V -谷氨酰乙胺(V，由日本科学家于1949年首次从绿茶中分离得到，是茶叶中特有的游离氨基酸，也是茶叶的主要风味物质。1 811880^等首次将该酶从茶的籽根中成功分离，并证明其对1-1116、乙胺及八I？具有较高的亲和性，但该酶稳定性差，在体外极易失活。
[0003]近年来，据越来越多的研究报道，1-茶氨酸具有镇静减压、提高认知、增强免疫力以及预防肿瘤等重要生理功能，同时作为食品添加剂广泛应用于饮料、糖果、饼干、冰激凌等广品中，起到改善食品风味和提闻营养价值等作用。
[0004]在医药领域已用于预防癌症、预防阿尔茨海默症、控制抑郁症等方面；在保健食品中用于镇静放松、抗疲劳、提高学习记忆能力等方面；在普通食品中用于改善食品风味、强化营养等，也有报道用1-1116进行饮用水进化、除臭、抗腐蚀剂及抗酸化剂的例子。1-1110在市场的需求日渐广泛，需求量也越来越大，因此开发低成本、大规模制备匕茶氨酸技术的要求日渐迫切。
[0005]1-1116的制备方法主要有从绿茶中直接提取法、化学合成法和微生物酶法。
[0006]直接提取[-11?的方法有传统的化学试剂沉淀法和随后发展起来的离子交换层析法。化学试剂沉淀法的主要采用热水浸泡茶叶而形成茶汤或冷乙醇提取获得提取液，加入碱式碳酸铜使1-1116与之反应析出形成1-1116-铜盐沉淀，使用稀硫酸溶解后通入43气体去除后加入一定量83 (0?) 2沉淀液体中3042—等杂质，得到较纯的1-1116液体，最后对液体通过抽滤、浓缩、结晶、精制等步骤，获得高纯1^-1116粉末或晶体。离子交换法采用合适的溶液1)?使目标氨基酸带上相应的电荷，并通过离子交换柱达到分离提取的目的。直接提取法生产1-1116具有原料成本高、提取工序复杂、得率低等缺点，不能满足低成本、大规模制备高纯卜了“的市场要求。
[0007]化学合成法主要分为三条合成路线:1.吡咯烷酮酸或焦谷氨酸法，利用乙胺和1-吡咯烷酮酸生成卜茶氨酸。1 110^6118^6111等于1942年在实验室中用乙胺和卜吡咯烷酮酸在水溶液中反应，合成1-1116，但收率较低；后人尝试用吡咯烷酮酸和无水乙胺在低温下反应或营造惰性环境等，提高了 1-1116的收率取代谷氨酸酯和乙胺水解反应产生化取代茶氨酸:3.取代谷氨酸酐法，首先利用保护基保护谷氨酸中的0 -氨基，然后进行分子内脱水形成环状谷氨酸酐，再与乙胺作用生产化取代茶氨酸，最后去除保护基团得到1-1116。化学合成法存在反应时间长、收率低等缺点，同时由于需要采用高压、惰性气体保护和保护基团等方式，增加生产成本。
[0008]微生物酶法合成具有操作简单，构型专一，放大生产容易等优点，是降低生产成本，提高生产强度的有效途径，现已逐渐代替直接提取法和化学合成法，成为[-1116大规模生产的主流方法。然而，现有的研究存在Y-谷氨酰转肽酶(Y-GGT)的酶种开发较少，野生酶酶活较低，对L-The生产应用的效果有待提高，在高底物浓度下反应的研究较少等缺点，这些不足限制了其工业化应用进程。
【发明内容】
[0009]本发明所解决的技术问题是提供了一种生物法生产L-The的工艺，降低了 L-The的生产成本。
[0010]为解决上述问题，本发明技术方案为:
[0011]采用来源于Bacillus subtilis的Y-GGT重组酶生产L-The:L_谷氨酰胺(L-Gln)和乙胺盐酸盐按照一定比例配制成底物溶液，调pH 9-11后，按照每毫升反应液2-20个单位的量加入来源于枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis),中国典型微生物保藏中心，CCTCC AB 130001) GGTase，充分反应10-20小时，采用恒速和变速补料工艺提高L-The产量。
[0012]所述恒速补料方法为=L-Gln和乙胺盐酸盐按照一定比例配制成底物溶液，调pH
9-11后，按照每毫升反应液2-20个单位的量加入GGTase，每2h补加一定量的底物，反应
10-20小时生产L-The。
[0013]所述变速补料方法为=L-Gln和乙胺盐酸盐按照一定比例配制成底物溶液，调pH9-11后，按照每毫升反应液2-20个单位的量加入GGTase，每2h测定底物消耗量并补加底物至初始浓度，反应10-20小时生产L-The。
[0014]所述微生物发酵生产GGTase的方法为，在一定培养条件下，微生物发酵一定时间(Xingyi Chen, Lingqia Su, Danffu, Jing ffu.Applicat1n ofrecombinantBacillus subtilis Y-glutamyltranspeptidase to the product1n ofL-theanine[J].ProcessB1chemistry, 2014，49:1429 - 1439)，得到含有GGTase的发酵液，发酵液经过粗过滤、精过滤、浓缩、干燥等全部工艺或部分工艺后得到GGTase粉沫或者粗酶液。
[0015]所述GGTase的最适反应温度为30°C _40°C，温度通过影响酶对底物的催化效率，从而影响酶的活力，温度过高或过低都会影响酶的作用效果。从降低生产成本考虑，应该将生产工艺的温度设定在酶最适温度附近，这样大大降低加入的酶量，从而降低生产成本。
[0016]所述GGTase的最适pH范围为9.0-11.0，pH对GGTase活力的影响较大，从降低成本的角度考虑，应该将生产工艺的温度设定在酶最适反应PH附近。
[0017]L-The的分析采用高效液相色谱。色谱条件:Waters 600HPLC色谱仪，Waters自动进样器，检测系统:Agilent 1200,色谱柱:Eclipse XDB-C185 μ m(4.6mmX 150mm);流动相A相为无水醋酸钠4.52g,加入IL去离子水，再加入225 μ L三乙胺，醋酸调节pH到7.2±0.05，后加入5mL四氢呋喃。B相为无水醋酸钠4.52g加去离子水定容为200mL，醋酸调节pH到7.2±0.05，再加400mL甲醇和400mL乙腈。流速0.8mL/min,柱温40°C。处理样品用10% (w/v)的三氯乙酸等体积稀释,室温放置l_2h, 12000r.min-1离心1min,再用
0.22 μ m水相针式滤器过滤后上机分析。
[0018]所述L-Gln与乙胺盐酸盐的配比可以为1:5到1:15之间。在L-Gln与乙胺盐酸盐合成L-The的反应中，L-Gln分子与乙胺分子的反应比例为1:1，而由于GGT受体活性位点的特异性较低，除乙胺外，水分子，L-Gln等均能结合在受体的活性中心，与乙胺形成竞争关系，而降低目标产物L-The的产量。因此，在实践过程中，往往需要使乙胺过量于L-Gln，来提高L-The产量。
[0019]本发明的技术原理如下:
[0020]采用GGTase转化法生产L-The时，底物浓度过高会导致L-The转化率下降，其原因主要是因为高浓度的底物L-Gln对GGTase具有抑制作用，因此考虑使用较低的初始底物浓度，通过补料策略将底物浓度维持在较低的条件下，反应速率快，提高了 L-The的转化率。
[0021]本发明是根据GGTase以及产物L-The的特点生产L-The的工艺，相对于现有技术，具有以下优点:
[0022]I)提供一种高转化率、低成本的L-The的生产方法，填补了该【技术领域】内的空白，为L-The大规模的生物法生产奠定了基础；
[0023]2)酶反应的温度比较低，不需要进行大量的升温降温控制，低能耗，特别适合工业化生产；
[0024]3)采用恒速补料的工艺，定时补加底物，提高L-The的转化率，达到65%左右；
[0025]4)采用变速补料的工艺，定时补加消耗的底物量，提高L-The的转化率，达到75%
左右；
[0026]5)本反应总的反应周期短，只需要10-20小时，适合工业化生产；
[0027]总体来讲，本发明具有生产成本低、原料转化率高、产品浓度高、工艺流程简单、生产周期短等诸多优点。
[0028]实施例1
[0029]底物配制:
[0030]L-Gln浓度为200mmol/L，按照1:10的比例加入乙胺盐酸盐，用缓冲液调pH到10.0。
[0031]酶法生产工艺:
[0032]底物溶液配制好后将温度调至37°C，按照每毫升反应液加入6单位的Y -GGTase,然后每反应2小时补加200mmol L-Gln,并定时补加乙胺盐酸盐保持过量,共反应14小时；
[0033]所述L-The的分析采用高效液相色谱。色谱条件:Waters 600HPLC色谱仪,Waters自动进样器，检测系统:Agilent 1200,色谱柱:Eclipse XDB-C185 μ m(4.6mmX 150mm);流动相A相为无水醋酸钠4.52g,加入IL去离子水，再加入225 μ L三乙胺，醋酸调节pH到7.2±0.05，后加入5mL四氢呋喃。B相为无水醋酸钠4.52g加去离子水定容为200mL，醋酸调节PH到7.2±0.05，再加400mL甲醇和400mL乙腈。流速0.8mL/min,柱温40°C。处理样品用10% (w/v)的三氯乙酸等体积稀释,室温放置l_2h, 12000r.min-1离心1min,再用0.22 μ m水相针式滤器过滤后上机分析。底物L-Gln总浓度为lOOOmmol/L，L-The总转化率可达56.2%。
[0034]实施例2
[0035]底物配制:
[0036]同实施例1
[0037]酶法生产工艺:
[0038]底物溶液配制好后将温度调至37°C，按照每毫升反应液加入6单位的Y -GGTase,然后每反应2小时补加15011111101 ，并定时补加乙胺盐酸盐保持过量，共反应14小时；
[0039]1-茶氨酸检测方法:
[0040]同实施例1
[0041]底物[-以!!总浓度为95011111101/1，[-11?总转化率可达63.7%。
[0042]实施例3
[0043]底物配制:
[0044]同实施例1
[0045]酶法生产工艺:
[0046]底物溶液配制好后将温度调至371，按照每毫升反应液加入6单位的V -661^86,然后每反应2小时补加10011111101 ，并定时补加乙胺盐酸盐保持过量，共反应16小时；
[0047]1-茶氨酸检测方法:
[0048]同实施例1
[0049]底物[-以!!总浓度为90011111101/1，总转化率可达67.8%。
[0050]实施例4
[0051]底物配制:
[0052]同实施例1
[0053]酶法生产工艺:
[0054]底物溶液配制好后将温度调至371，按照每毫升反应液加入6单位的V -661^86,然后每反应2小时测定卜以!!消耗量，并补加卜以!!至初始浓度，并定时补加乙胺盐酸盐保持过量，共反应16小时；
[0055]1-1116 检测方法:
[0056]同实施例1
[0057]底物总浓度为60011111101/1，总转化率可达 74.3%。
【权利要求】
1.一种补料生产L-茶氨酸的方法，属于生物技术【技术领域】。本发明所解决的技术问题是提供了恒速补料和变速补料的工艺，降低了 L-茶氨酸的生产成本，提高了转化率。技术方案为:采用来源于枯草芽胞杆菌来源的Y-GGTase生产L-茶氨酸；按照1:5到1:15的比例配制L-谷氨酰胺和乙胺盐酸盐，设定温度30-45°C，调pH 9.0-11.0后，按照每毫升反应液2-20个单位的量加入Y-GGTase，每2小时补加底物100-200mmol，反应10-20小时，最终底物浓度为600-1000mmol/L，得到L-茶氨酸转化率达到60-80%。
【文档编号】C12P13/04GK104372046SQ201410666004
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2014年11月19日 优先权日:2014年11月19日
【发明者】吴敬, 陈晟, 傅嘉懿 申请人:江南大学