甜橙根特异性启动子CsBFTP的分离及应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于植物基因工程【技术领域】，具体涉及一个启动子的分离与鉴定。从柑橘类果树甜橙品种“锦橙”中分离的CsBFT基因中，得到一个基于该基因的特异启动子序列，该启动子被命名为CsBFTP，其能在柑橘类果树的根中特异性表达。所述的启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其核苷酸的核心序列长度为1,575bp，该启动子还可以受到激素和非生物胁迫的诱导。
【专利说明】甜橙根特异性启动子CsBFTP的分离及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物基因工程【技术领域】。具体涉及一个甜橙根特异启动子CsBFTP的 分离及应用，本发明的启动子可用于构建根特异表达的转基因植物；在植物响应激素和非 生物胁迫等途径中有重要的作用；为植物的发育和生长提供必要的基础。
【背景技术】
[0002] 植物能根据外界环境变化调控特定基因的表达，以适应复杂多变的生长环境。真 核生物的基因表达调控包括转录前调控、转录调控、转录后调控、翻译调控和翻译后调控。 基因的成功转录是在上游启动子、RNA聚合酶、转录因子等一系列因素一起参与。真核生物 中的TATA和CAAT框，它们决定了转录的起始位点和效率，负责和RNA聚合酶结合，启动基 本转录过程。其中，转录水平受顺式作用元件和转录因子协调作用，是表达水平的关键环 节。植物基因启动子中包括多种重要的顺式作用元件，在转录水平上参与调控下游相应基 因表达，从而使植物能够抵御外界环境胁迫。驱动基因能够特异性表达的顺式作用元件由 于功能的不同而各不相同，无法给出一个统一的结构，这些元件的结构可能有其自身的特 点，它们对基因的特异性表达起到了决定性的作用。因此，对植物特异诱导的启动子进行研 究有助于了解基因转录调控表达模式及调控机制，并应用于基因工程中提高或改进外源目 的基因的表达。目前已经通过分子生物学的手段验证很多在组织中特异性表达和诱导表达 的启动子，如FT/TF1基因家族中MFT通过与ABA信号途径中的ABI3和ABI5蛋白形成负 反馈环调控拟南芥种子的萌发（Xi et al.，2010)。ABA在植物的逆境胁迫如干旱、低温、 高盐条件下通过伴随着大量的物理变化和发育的改变来增强对逆境的抗性（Mansfieid et al.，1987)。
[0003] BFT(BROTHER OF FT AND TFLl)基因作为FT/TF1基因家族中的一员，在植物的成 花转变过程中有重要的作用。BFT在高盐胁迫下可通过与FD蛋白互作，抑制了 FD蛋白与 FT的互作引起植物的晚花（Jae et al.，2014)。除了接受植物发育信号在植物成花方面有 重要作用以外，也有研究表明BFT在胁迫条件下可诱导表达（Minida et al.，2001 ;Chung et al.，2010)。150mM NaCl处理后可明显增强BFT基因的表达，并且高盐胁迫对BFT基因 的诱导表达是依赖于 ABA (Jae et al·，2011 ;Jae et al·，2014)
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，从甜橙品种锦橙中分离出一个在根中特 异性表达启动子CsBFTP，利用该启动子的特异性转化拟南芥可获得转基因株系，该启动子 上含有与些激素和非生物胁迫相关的元件，表明该启动子在植物响应激素和非生物胁迫等 途径中有重要的作用。
[0005] 本发明的技术方案如下所述：
[0006] 本发明利用植物基因克隆技术，从甜橙品种锦橙（Citrus sinensis)基因组中克 隆得到一个在根中特异表达的启动子，它的核苷酸序列如表SEQ ID NO :1所示，序列的长 度为1，575bp。 申请人:将该启动子命名为CsBFTP， 申请人:将该启动子与标记基因⑶S融合， 通过花序浸染法转入拟南芥中，验证了该启动子表达的特异性；通过对启动子序列进行预 测发现该启动子上含有一些与激素和非生物胁迫诱导相关的元件，并对这些元件进行了验 证，表明这个启动子在响应激素和非生物胁迫方面有重要的作用。
[0007] 更详细的技术方案见《【具体实施方式】》所述。
【专利附图】
【附图说明】
[0008] 序列表SEQ ID NO :1是本发明克隆的在甜橙品种锦橙根中特异性表达的启动子 CsBFTP的核苷酸序列。
[0009] 图1 :是本发明的技术路线。
[0010] 图2 :是CsBFT基因的表达分析。
[0011] 图3 :是从锦橙基因组DNA中扩增CsBFT启动子的电泳图谱。图中标记说明：图左 为 DL2000marker。
[0012] 图中标注的是CsBFT基因在甜橙品种"锦橙"的不同部位根、茎、叶、花、果、花托、 花瓣、雄蕊、子房中的表达情况。在基地取完后的材料马上在液氮中进行速冻，并在超低温 冰箱中保存，备用。花是全开放的花，果是盛花期后一个月的幼果，花不同部位的分离是在 冰上进行操作。
[0013] 图4 :是原载体pCAMBIA1391Z和本发明构建的（重组）表达载体 pCAMBIA1391+CsBFTP 的物理图谱。
[0014] 图4标记说明：图4中的A图为原载体pCAMBIA1391Z的物理图谱；图4中的B图 为本发明构建的表达载体pCAMBIA1391+CsBFTP的物理图谱。
[0015] 图5 :是CsBFT启动子驱动⑶S基因在拟南芥中的表达情况。是在T3代苗中进行 检测。图中标记说明：图5中的（A)图是3天时CsBFTP主要在根中表达；图5中的（B)图 是7天时CsBFTP主要在根中表达；图5中的（C)图是14天时CsBFTP主要是根部和子叶的 叶柄及叶脉中表达；图5中的（D)图是在花中没有检测到CsBFTP的表达；图5中的（E)图 是在果中也没有检测到CsBFTP的表达；表明CsBFTP是在根中是特异性表达的。
[0016] 图6 :采用PLACE在线网站对CsBFTP的分析结果。
[0017] 图中标记说明如表1所示：
[0018] 表1启动子CsBFTP的顺式作用元件的预测
[0019]
【权利要求】
1. 甜橙根特异启动子CsBFTP在调控柑橘根发育过程中的应用，其特征在于所述的启 动子的核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示。
2. 如权利要求1所述的甜橙根特异启动子CsBFTP在调控柑橘根发育过程中的应用，其 特征在于所述柑橘包括甜橙。
【文档编号】C12N15/113GK104388432SQ201410665913
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年11月19日 优先权日:2014年11月19日
【发明者】张金智, 侯小进, 胡春根 申请人:华中农业大学