一种强化解脂亚洛酵母合成α-酮戊二酸的方法
【专利摘要】本发明公开了一种强化解脂亚洛酵母合成α-酮戊二酸的方法，属于代谢工程【技术领域】。本发明在野生型解脂亚洛酵母Y.lipolytica WSH-Z06菌株细胞中过量表达谷氨酸脱氢酶，构建了重组菌株Y.lipolytica-GDH2，调节细胞通过代谢谷氨酸合成α-酮戊二酸。发酵过程中，为了提高细胞内谷氨酸供应，在发酵培养基中添加L-蛋氨酸亚胺，抑制细胞内谷氨酸代谢合成谷氨酰胺，强化了α-酮戊二酸积累明显提高。因此，通过此方法调节细胞内氨基酸代谢是一种强化α-酮戊二酸积累的有效手段。
【专利说明】-种强化解脂亚洛酵母合成a-鋼戊二酸的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种强化解脂亚洛酵母合成a -丽戊二酸的方法，尤其是一种通过调 节细胞内氨基酸代谢强化a -丽戊二酸合成的方法，属于代谢工程领域。
【背景技术】
[0002] a -丽戊二酸作为微生物细胞内H駿酸循环（TCA)途径中重要中间产物之一，参 与微生物细胞的多种代谢活动。不仅是H駿酸循环中的关键节点，在生物体内参与氨基酸、 蛋白质、维生素的合成W及能量代谢，与H駿酸循环中其他代谢中间产物相比，a-丽戊二 酸在微生物细胞内代谢积累受到多种调控作用。因此，掲示a-丽戊二酸在微生物细胞内 代谢积累及调控机制具有重要的研究意义，并对强化细胞内其他H駿酸循环中代谢产物积 累具有指导意义。a-丽戊二酸是重要的化工合成中间体，在氨基酸、维生素和其它小分子 物质合成，在医药、有机合成、营养强化剂等领域都有着重要的应用前景。传统化学合成法 生产该有机酸因合成线路长，反应过程复杂，而且利用氯化物等对人体有毒害化合物阻止 了化学合成法生产的a-丽戊二酸在医药和食品等高附加值产品中的应用。利用微生物法 发酵生产a -丽戊二酸不仅能减少对化石能源供应的依赖，并且W可再生的生物质为原料 具有环境友好，经济可W持续性等优点。
[0003] 微生物法生产a -丽戊二酸过程中存在目标代谢产物浓度低、生产强度低等不利 因素。本发明通过削弱微生物细胞消耗a-丽戊二酸合成氨基酸，来强化a-丽戊二酸的 合成积累。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的第一个技术问题是提供一种a -丽戊二酸合成强化的重组解脂 亚洛酵母，是在解脂亚洛酵母出发菌株中过量表达谷氨酸脱氨酶，强化谷氨酸脱氨酶活力， 强化谷氨酸供应，增强a-丽戊二酸积累。
[0005] 在本发明的一种实施方式中，编码所述谷氨酸脱氨酶的基因来自酿酒酵母。
[0006] 在本发明的一种实施方式中，编码所述谷氨酸脱氨酶的基因的核巧酸序列如SEQ ID NO. 2 所示。
[0007] 在本发明的一种实施方式中，所述重组解脂亚洛酵母是W解脂亚洛酵母为出发菌 株，W含有潮霉素转磯酸移酶为筛选标记的整合型表达载体PO为表达载体。
[0008] 在本发明的一种实施方式中，所述解脂亚洛酵母是解脂亚洛酵母WSH-Z06 CCTCC NO ：M20714〇
[0009] 在本发明的一种实施方式中，所述质粒pO的构建方法参见文献；Swennen D，Paul MF, Vernis L,Beckerich JM, Fournier A, Gaillardin C. Secretion of active anti-Ras single-chain Fv antibody by the yeasts Yarrowia Iipolytica and Kluyveromyces lactis. Microbiology-S卵，2002. 148:41-50。
[0010] 本发明要解决的第二个技术问题是提供一种强化解脂亚洛酵母合成a-丽戊二 酸的方法，是调节细胞内氮源代谢，通过在解脂亚洛酵母出发菌株中过量表达谷氨酸脱氨 酶，强化谷氨酸脱氨酶活力，强化谷氨酸供应、增强a -丽戊二酸积累。
[0011] 在本发明的一种实施方式中，为增强细胞内谷氨酸的供应，还可W外源添加谷氨 醜胺合成酶抑制剂k蛋氨酸亚胺，降低细胞内谷氨酸代谢分解，强化谷氨酸供应、增强 a-丽戊二酸积累。
[0012] 本发明要解决的第H个技术问题是提供一种构建所述重组解脂亚洛酵母的方法， 主要包括W下步骤；（1)构建表达目的基因所用的整合型表达载体；扩增潮霉素磯酸转移 酶h地基因，h地基因的核巧酸序列如SEQ ID NO. 1所示，利用限制性内切酶Stu I与化nd III同时处理扩增得到的h地基因和PO质粒，并连接两酶切产物得到含有潮霉素转磯酸 移酶为筛选标记的整合型表达载体pO化地）；（2)构建重组整合型表达质粒；根据NCBI公 开的序列，全化学合成编码谷氨酸脱氨酶的编码基因GD肥的开放阅读框序列，利用限制内 切酶Sfi I和Not I切割GD肥的开放阅读框和整合型表达载体PO化地），连接获得重组表 达质粒pO化地)-GD肥；（3)将所得的pO化地)-GD肥质粒转化Y. Iipolytica WSH-Z06 ;利 用电穿孔转化方法将被限制性内切酶Avr II线性化的重组整合型表达质粒转化野生型 Y. Iipolytica WSH-Z06,提取转化子基因组，利用验证引物对VBF/V-GD肥验证筛选阳性转 化子，获得Y. Iipolytica-GD肥菌株。
[0013] 本发明要解决的第四个技术问题是提供一种应用所述重组解脂亚洛酵母发酵 生产a-丽戊二酸的方法，是将所得重组解脂亚洛酵母活化后接种到发酵培养基中， 28-301：、200-220巧111，培养 144-168 小时。
[0014] 在本发明的一种实施方式中，发酵培养基成分为：甘油lOOg/l，（NH4)2S04 3g/l， KH2P〇43g/L，M拆〇4 ? 7&0 I. 2g/L，化Cl 0. 5g/L，K2HPO4 0. Ig/L，盐酸硫胺素 2Xl〇-7g/L，调 抑为5. 0后再加入20g/L化C〇3。
[0015] 在本发明的一种实施方式中，发酵培养基中还添加了 k蛋氨酸亚胺。
[0016] 在本发明的一种实施方式中，发酵培养基含有k蛋氨酸亚胺36. Img/L，甘油 lOOg/L，（畑4)25〇4 3g/L，KH2P〇4 3g/L，M拆〇4*7&0 1.2g/L，化Cl 0. 5g/L，K2HP〇4 0. Ig/L，盐 酸硫胺素2 X l〇-7g/L，调抑为5. 0后再加入20g/L CaC〇3。
[0017] 在本发明的一种实施方式中，将所得重组解脂亚洛酵母接种至种子培养基中， 28°C、200rpm，培养16-18小时；按10%的接种量从种子培养基中接种到含有50ml发酵培 养基的500ml H角瓶中，培养温度为28C、揽拌转数为2(K)巧m，培养144-168小时。
[0018] 过量表达谷氨酸脱氨酶的重组解脂亚洛酵母菌株细胞内谷氨酸脱氨酶催化活力 上升至8. 62U/(mg ?蛋白质），是出发菌株的7. 2倍。
[0019] 在重组菌株发酵过程中添加0. 2mM谷氨醜胺合成酶抑制剂k蛋氨酸亚胺，能降 低谷氨酸代谢分解，重组菌株细胞中的谷氨酸含量上升至0. 99 y mol/ (mg ?菌体干重），提 高了 86.3%。重组菌Y. Iipolytica-GD肥细胞外积累的a-丽戊二酸提高了 32. 4%，至 19.2g/L〇
[0020] 本发明的有益之处；本发明通过过量表达谷氨酸脱氨酶，强化W谷氨酸至a-丽 戊二酸的代谢通量，在此基础上，为强化细胞内谷氨酸供应，在发酵过程中添加k蛋氨酸 亚胺，明显提高了细胞外积累a-丽戊二酸含量。本发明通过调剂细胞内氨基酸代谢，降低 了微生物细胞利用a-丽戊二酸合成氨基酸，削弱了 a-丽戊二酸分解代谢，强化细胞外积 累的a-丽戊二酸。
【专利附图】
【附图说明】
[0021] 图1过量表达谷氨酸脱氨酶提高细胞内谷氨酸脱氨酶催化活力，WSH-Z06 ;出发菌 株，GD肥：重组菌。
[0022] 图2过量表达谷氨酸脱氨酶强化a -丽戊二酸合成，WSH-Z06 ;出发菌株，GD肥：重 组菌。
[0023] 图3添加k蛋氨酸亚胺强化细胞内谷氨酸供应，WSH-Z06 ;出发菌株，G畑2 ;重组 園。
[0024] 图4重组菌株细胞外a -丽戊二酸含量变化，WSH-Z06 ;出发菌株，GD肥：重组菌。
【具体实施方式】
[002引 YPD培养基（g ? [I);蛋白腺10,酵母浸膏5,葡萄糖10,固体培养基另加20g ? [1 琼脂。转化子筛选时加入潮霉素B至终浓度为400mg ? [1。
[0026] 种子培养基（g ? L-1):葡萄糖20,蛋白腺10, M拆〇4 ? 7&0 0. 5, KH2PO4 1. 0。用稀 盐酸调抑至5. 5,115C维持15min灭菌。固体斜面另添加20g ? L-I琼脂粉。
[0027] 发酵培养基（g ? L-1) 蛋氨酸亚胺 3. 61 X 1〇-2,甘油 100,（NH4)2S04 3, KH2PO4 3， M拆〇4*7&0 1.2,化Cl 0. 5，K2HP04 0. 1，盐酸硫胺素 2X10-7,抑=4. 5。115°C，灭菌 15min。 接种前加入12rC灭菌30min的CaC〇3至含量为20g ? [1。
[0028] 解脂亚洛酵母Yarrowia lipoidica WSH-Z06从中国典型培养物保藏中也CCTCC 获得，菌种编号为CCTCC NO ;M20714。
[0029] 谷氨酸脱氨酶催化活力和细胞内氨基酸含量测定：离也收集处于指数生长期的细 胞，用 0. 9%生理盐水洗涂，用 10血 0. IM KH2PO4-K2HPO4 ImM 邸TA 0. OlmM DTT pH 7. 5 缓 冲液息浮细胞，在4C条件下，加入酸洗玻璃珠研磨5min，13000 X g离也lOmin，上清液用于 谷氨酸脱氨酶催化活力和细胞内氨基酸含量测定。
[0030] 谷氨酸脱氨酶催化活力：将1. 5ml细胞破碎上清液，加入至含有6mM NA护、IOOmM 谷氨酸、160mM甘氨酸、1. SmM NaCl、4. 2mM邸TA,抑=9. 0的反应混合液中至总体积为3血， 在3(TC，340nm条件下检测NADH含量变化，IU的谷氨酸脱氨酶催化活力定义为；单位时间 内生成1 y mol的NADH所需要的酶量。
[0031] 细胞内谷氨酸和谷氨醜胺的测定方法：将200 y 1细胞破碎上清液加入ImL EP 管中。加入800 UL5 %的H氯己酸，静置5min。1血样品经过0.22 ym水性滤头过滤后 IOO(K)巧m离也lOmin，处理后的样品通过HPLC检测样品中氨基酸含量。
[00础 HPLC条件；样品柱前衍生化；采用邻二甲苯（OPA)、9-巧甲基氯甲醜醋（FMOC)进 行柱前衍生。流动相A相；称取5. Og无水己酸轴于1000血烧杯中，加入1000血水揽拌至 充分溶解，再加入200 y L H己胺，揽拌并滴加5 %的醋酸，将抑调到7. 20 ±0. 05 ;加入5 y L 四氨巧喃，混合后备用。流动相A相；称取5. Og无水己酸轴于1000血烧杯中，加入1000血 水揽拌至充分溶解，再加入200 y L H己胺，揽拌并滴加5 %的醋酸，将抑调到7. 20 ±0. 05 ; 加入5yL四氨巧喃，混合后备用。色谱柱；0DS-2Hypersil(250mmX4.6mmX5ym);柱温： 4(TC，紫外检测器；激发波长338nm ;洗脱程序见下表。
[0033] 表I氨基酸分析梯度洗脱表
[0034]
【权利要求】
1. 一种a-酮戊二酸合成强化的重组解脂亚洛酵母，其特征在于，是在解脂亚洛酵母 中过量表达谷氨酸脱氢酶，强化谷氨酸供应。
2. 根据权利要求1所述的重组解脂亚洛酵母，其特征在于，编码所述谷氨酸脱氢酶的 基因来源于酿酒酵母。
3. 根据权利要求1或2所述的重组解脂亚洛酵母，其特征在于，以解脂亚洛酵母为出发 菌株，以含有潮霉素转磷酸移酶为筛选标记的整合型表达载体P〇为表达载体，表达核苷酸 序列如SEQ ID NO. 2所不的基因。
4. 一种强化解脂亚洛酵母合成a-酮戊二酸的方法，其特征在于，通过在解脂亚洛酵 母中过量表达谷氨酸脱氢酶，强化谷氨酸脱氢酶活力，强化谷氨酸供应、增强a -酮戊二酸 积累。
5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在解脂亚洛酵母发酵产a-酮戊二酸过程 中外源添加谷氨酰胺合成酶抑制剂L-蛋氨酸亚胺，降低细胞内谷氨酸分解代谢。
6. -种构建权利要求1所述重组解脂亚洛酵母的方法，主要包括以下步骤：（1)构建表 达目的基因所用的整合型表达载体：扩增潮霉素磷酸转移酶hph基因，hph基因的核苷酸序 列如SEQ ID NO. 1所示，利用限制性内切酶Stu I与Hind III同时处理扩增得到的hph基 因和pO质粒，并连接两酶切产物得到含有潮霉素转磷酸移酶为筛选标记的整合型表达载 体pO (hph) ; (2)构建重组整合型表达质粒：全化学合成编码谷氨酸脱氢酶的编码基因 GDH2 的开放阅读框序列，利用限制内切酶Sfi I和Not I切割⑶H2的开放阅读框和整合型表达 载体pO (hph)，连接获得重组表达质粒pO (hph) -GDH2 ; (3)将所得的pO (hph)-⑶H2质粒转 化Y. lipolytica WSH-Z06,验证筛选阳性转化子，获得重组解脂亚洛酵母。
7. -种应用权利要求1所述重组解脂亚洛酵母发酵生产a-酮戊二酸的方法，其特征 在于，是将所得重组解脂亚洛酵母活化后接种到发酵培养基中，28-30°C、200-220rpm，培养 144-168 小时。
8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基含有：甘油100g/L， (NH4)2S043g/L，KH2P0 43g/L，MgS04 ? 7H20 1. 2g/L，NaCl 0? 5g/L，K2HP04 0? lg/L，盐酸硫胺素 2 X l(T7g/L，调 pH 为 5. 0 后再加入 20g/L CaC03。
9. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，发酵培养基添加了 L-蛋氨酸亚胺。
10. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，发酵培养基含有L-蛋氨酸亚胺36. lmg/ L，甘油 100g/L，（NH4)2S043g/L，KH2P0 43g/L，MgS04 ? 7H20 1. 2g/L，NaCl 0? 5g/L，K2HP040. lg/ L，盐酸硫胺素2 X 10_7g/L，调pH为5. 0后再加入20g/L CaC03。
【文档编号】C12P7/50GK104357344SQ201410666089
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年11月19日 优先权日:2014年11月19日
【发明者】陈坚, 周景文, 郭洪伟, 曾伟主, 堵国成 申请人:江南大学