专利名称：一种海葵神经毒素基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基因，特别是一种海葵神经毒素基因。本发明还涉及其蛋白在制备治疗心血管疾病药物中的应用。
背景技术：
海葵(anthopleura)，属腔肠动物门(soelenterata)，珊瑚纲(anthozoa)，是海洋中较原始的动物类。在长期的生物进化过程中，为了抵御敌害及捕获食物，海葵触手的刺丝囊能够分泌多种海葵毒素，基本上是多肽类毒素，对人和动物有多种生理活性作用。根据海葵毒素的生理功能将其分为3类海葵神经毒素、海葵溶细胞素及海葵钾离子通道抑制剂。
国外对海葵神经毒素的研究始于七十年代。1976年美国夏威夷大学Shibata等人从黄海葵(Anthopleura xanthogrammica)中分离纯化了Ap-A和Ap-B二种毒素，发现有增强心肌收缩的作用；1977年，Tanaka等对Ap-A的氨基酸序列进行了测定；随后，又有多种海葵神经毒素被发现，并做了氨基酸序列测定，以及二级、三级结构的分析。1992年，Gallagher等根据天然的Ap-B的氨基酸序列，体外合成了编码Ap-B的基因，在大肠杆菌中进行了重组表达，重组蛋白与天然的Ap-B在氨基酸组成、序列、二级结构、高压液相图谱及生物活性方面相同。海葵神经毒素的药理研究结果显示，这类毒素专一地和钠离子通道膜蛋白3位点结合，能延迟钠通道的失活。一方面，毒素作为分子探针可用于钠通道的生物学研究；另一方面，毒素对心肌组织产生非常强的正性收缩作用，而且，对实验动物的心率和血压没有影响；另外，海葵毒素还具有抗心律失常的作用，它能够延长心肌细胞复极过程中的有效不应期和动作电位时程，属3类抗心律失常作用。因此，研究开发海葵神经毒素用于治疗心衰和心律失常，是一项很有意义的工作。
海葵在我国海域分布较广，但产量较少。我国的海葵种类主要有黄海葵(Anthopleura xanthogrammica)、纵条肌海葵(Haliplanella luciae)、日本侧花海葵(Anhopleura Japonica)、太平洋侧花海葵(Anthopleura pacfica)、暗侧花海葵(Anthopleura nigrescens)、青岛侧花海葵(Aanthopleura Qingdaoensis)、华丽黄海葵(anthopleura elegantissima)、须毛细指海葵(Metridium dianthus)、疣海葵(Adamsia palliata)、红海葵(Actinia equina)等。目前，国内对海葵神经毒素的研究报道较少。对我国特有的海葵资源进行研究，发现新的有应用前景的强心类及抗心律失常海葵毒素，进行基因重组、表达，具有很重要的意义。
从所有已经纯化的海葵神经毒素一级结构来看，大部分为46～49个氨基酸，称为长链神经毒素，分子量在5kDa左右；另一些分子量在3kDa左右的多肽，称为短链神经毒素。目前文献报道的海葵长链神经毒素已有20多种，氨基酸序列比较可以看出其共性为存在6个Cys残基；3对二硫键；多肽链末端都是亲水性氨基酸。这些海葵神经毒素根据来源又可以分为两类来源于海葵科的Type-I类毒素称为海葵肽类毒素(Actiniid)；而来源于刺海葵科的Type-II类毒素称为刺海葵肽类毒素(Stichodactylid)。
发明内容本发明的目的在于提供一种新的海葵神经毒素基因。
本发明的另一目的在于提供上述基因的蛋白在制备治疗心血管疾病药物中的应用。
本发明所选择的海葵属于侧花海葵(anthopleura sp)，采自广东省湛江海边滩涂。侧花海葵毒素cDNA文库的构建首先分离海葵触手，提取总RNA。然后比较已发现的海葵神经毒素，它们的氨基酸组成及序列有很大的保守性，依据Ap-B两端的保守氨基酸序列，设计简并引物，运用RT-PCR方法，扩增得到目的条带，将目的条带连接到T载体，并转化E.coli挑选重组克隆。
本发明通过对以上重组克隆大规模序列测定，从中得到了1个新的编码侧花海葵毒素的克隆，命名为As7，并通过基因工程方法表达出重组蛋白。新基因编码47个氨基酸的成熟肽，等电点为7.6，分子量为4,800道尔顿，具有典型的海葵神经毒素一级结构的特征，分子内含有6个半胱氨酸，形成3对二硫键。
本发明通过设计了一对引物，将编码侧花海葵神经毒素的新基因As7用PCR方法从T载体上扩增出来，克隆到原核融合表达载体pETTRX上，构建成表达质粒并将其转化大肠杆菌BL21(DE3)。此表达载体(pETTRX-As7)以T7为启动子，采用分子伴侣TRX为融合伴体，帮助重组蛋白正确折叠，以可溶的形式表达，TRX的C端有柔链区和6×His结构，便于利用固定化金属配体亲和层析进行纯化。所设计的上游引物含有蛋白酶3C位点，以便外源蛋白单体的获得。通过对培养时间，诱导时间，温度等条件的摸索和优化，As7融合蛋白的表达量可达到150mg/L，并且基本上处于可溶状态。
本发明还优化了重组As7蛋白的纯化条件，表达产物的超声裂解液经Ni2+Chelating Sepharose亲和色谱层析，得到纯度较高的融合蛋白，融合蛋白经3C蛋白酶切割和进一步的G50凝胶柱层析，可得到纯度在95％以上的成熟重组海葵神经毒素蛋白。
本发明获得的重组海葵神经毒素具有生物活性。
本发明获得的重组海葵神经毒素对大鼠离体心房具有强烈的促进收缩作用。对重组海葵神经毒素进行的活性实验，检测As7重组蛋白对大鼠离体心房的作用，发现用药后的大鼠心房收缩明显增强，最高可增强250.7％。此外，它还有3类抗心律失常作用，能够延长大鼠心肌细胞有效不应期17％。本发明利用基因工程的方法，找到了1个海葵毒素新基因，并采用融合表达系统生产出具有强心作用和抗心律失常作用的重组海葵毒素，可用于制备治疗心血管疾病药物。
本发明的含有As7海葵神经毒素成熟肽编码序列的表达质粒pETTRX-As7由该表达质粒载体经Kpn I/Not I双酶切，可得到191bp的片段，即为侧花海葵神经毒素As7成熟肽编码序列(其中包含蛋白酶3C识别位点)。
本发明的表达质粒载体的复制方法参照Sambrook(Sambrook，et al.1989，Molecular cloing.Cold Spring Harbor Labroratory Press.USA)方法，按CaCl2法在E.Coli.DH5α或BL21(DE3)菌株中转化质粒，用含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB培养基转化细菌，碱法提取质粒。
图1为海葵神经毒素基因As7核苷酸序列及其编码的氨基酸序列；
图2为海葵触手总RNA提取结果；图3为海葵神经毒素As7基因的RT-PCR扩增结果；图4为含基因As7的重组质粒pPETTRX-As7表达质粒构建图；图5为含基因As7的pPETTRX-As7表达质粒酶切鉴定图；图6为重组As7蛋白亲和层析图谱；图7为重组As7蛋白诱导表达、亲和层析电泳图。
图8为重组As7蛋白分子筛层析图谱。
图9重组As7分子筛层析的SDS-PAGE(Tricine)分析图3中1PCR阴性对照；2PCR目的条带；3100bp DNA marker。图5中1100bp DNA marker；2pPETTRX-As7 Kpn I/Not I双切。图6中BB液洗脱；CC液洗脱；DD液洗脱；EE液洗脱。图7中1未经诱导的pPETTRX-h7a菌体总蛋白；2经IPTG诱导的pPETTRX-h7a菌体总蛋白；3诱导菌超声上清总蛋白；4Sigma wide range marker；5C液洗脱峰总蛋白；6D液洗脱峰总蛋白。图8中A第1峰；B第2峰；C第3峰。图9中1.Sigma wide rangemarker；2.经过亲和层析得到的TRX-As7融合蛋白；3.TRX-As7融合蛋白经Prescission protease切割；4纯化的重组As7。
具体实施方式
以下实施例将有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。
实施例一 侧花海葵触手总RNA的提取和RT-PCR扩增总RNA的提取和cDNA合成分离一只侧花海葵触手，采用异硫氰酸胍法提取触手总RNA，酚/氯仿抽提去除蛋白质.获得100μg毒腺总RNA，其A260/A280＝2.03，经1％甲醛变性胶电泳检测可见清晰的18s和28s两条带，比值＞1，以及LIA两条特异RNA条带，表明总RNA完整性良好。取5μg RNA用Oligo-dT进行反转录以合成cDNA第一链，得到20μl cDNA第一链产物。
引物设计和RT-PCR扩增依据Ap-B的两端氨基酸序列，用oligo引物设计软件辅助分析，设计出两条简并引物。Ap-B两端氨基酸序列(N端)GVPCLCD----------GWCCKK(C端)正义链(A1)5’GG(A/C/T/G)GT(A/C/T/G)CC(A/C/T/G)TG(T/C)(T/C)T(A/C/T/G)TG(T/C)GA 3’反义链(A2)5’(T/C)TT(T/C)TT(A/G)CA(A/G)CA CCA(A/C/T/G)CC 3’每50μl PCR反应体积加入1μl cDNA单链作为模板，PCR扩增，电泳检测，发现在150bp附近出现预期的特异性扩增带，回收此带。
实施例二 重组海葵神经毒素基因序列的测定和分析将回收的电泳产物连接至T载体，转化DH5α大肠杆菌，挑选重组克隆测序。一共测定了16个克隆，Blast同源分析表明，其中有1个是神经毒素基因序列，这7个毒素基因长度都是141bp，编码1个长度为47个氨基酸的毒素蛋白，这个毒素蛋白编号为As7，它和已报导的海葵神经毒素蛋白的氨基酸序列不完全相同，是1个新的毒素蛋白。
目前，已报导的海葵神经毒素有20多种，氨基酸数目介于46-49(另外还有几个毒素的氨基酸残基介于27-31，称短链神经毒素)，其中12个氨基酸保守。根据它们的氨基酸序列又可分为两个亚类，以Ap-A、Ap-B为代表，属第一亚类；以Sh I、Rp I为代表，属第二亚类.两个亚类之间，氨基酸序列的同源性为30％左右，而属同一个亚类的毒素蛋白，氨基酸序列之间的同源性超过60％，我们所发现的这个毒素蛋白属于第一亚类。用Clustalw分析软件，对这个毒素蛋白和Ap-A类的几个毒素蛋白进行多序列比较，结果如下Ap-AGVSCLCDSDGPSVRGNTLSGTLWLYPSGCPSGWHNCKAHGPTIGWCCKQAp-BGVPCLCDSDGPRPRGNTLSGILWFYPSGCPSGWHNCKAHGPNIGWCCKKAs7 GVACLCDSDGPSVHGNTLSGTIWLA--GCPSGWHNCKAHGPTIGWCCKQAp-CGVPCLCDSDGPSVRGNTLSGILWLA--GCPSGWHNCKAHGPTIGWCCKQAsV GVPCLCDSDGPSVRGNTLSGILWLA--GCPSGWHNCKKHKPTIGWCCK-** ******** :****** :*. **********: :*.******“*”表示相同；“:”表示差异较小；“.”表示差异明显；空格表示完全不同从上图可以看出，As7与Ap-C非常相似，它们之间只是第3位、14位、21位和22位4个氨基酸的差异。与Ap-C的Blast分析结果表明，As7和Ap-C的同源性是93％。另外，它和AsV的序列也很接近，Blast分析结果显示，As7和AsV的同源性是89％。
在PCR扩增反应中，用普通的Taq酶会出现约10-4的错配，由于目的片段较小，PCR的循环数不超过30个，降低了错误参入的概率。实施例三 重组海葵神经毒素表达质粒的构建依据As7基因的两端序列合成一对引物，上游引物含Kpn I和PrescissionProtease切割位点，下游引物含BamH I切割位点。上游引物(B1)5’CGGGGT ACCCTG GAA GTT CTG TTC CAG GGG CCCGGG GTTKpn I Precision Protease siteCCG TGT TTG TGT GAC3’下游引物(B2)5’CGCGGA TCCTTA TTA CTT CTT GCA GCA CCA GCC AAT G3’BamH I以含As7基因的pGEM-T Easy质粒为模板，B1、B2为引物PCR扩增，得到特异扩增的单一条带，产物大小在200bp左右。PCR扩增产物先以Kpn I/BamH I的组合克隆到BSK质粒上构建成BSK-As7，然后以Kpn I/Not I的组合克隆到原核融合表达载体pPETTRX上。克隆载体和表达载体分别用Kpn I/BamHI和Kpn I/Not I进行双酶切鉴定。克隆载体和表达载体中的外源基因经测序鉴定正确。所设计的上游引物中含Pre-scission蛋白酶切割位点，以便切除融合伴侣TRX。实施例四 重组海葵神经毒素融合蛋白的表达将pETTRX-As7转化大肠杆菌BL21(DE3)。基因工程菌超声裂解上清液经SDS-PAGE电泳分析表明，菌体经诱导后有明显的特异表达产物带，分子量与用软件DNA TOOL5.1预测的理论值18.5kD相符。
经过对培养时间，诱导浓度，温度等条件的摸索菌体扩大培养不同时间后诱导表达比较，基因工程菌的培养条件为接单菌落于50ml氨卞抗性LB培养基中，37℃，250rpm培养过夜，取过夜培养物20ml接种于2L的氨卞抗性LB培养基中，37℃，250rpm培养至OD600＝0.6(扩大培养约2h)，加入100mM IPTG和20％葡萄糖至终浓度分别为1mM和0.2％，25℃，250rpm诱导培养10h后离心收获菌体。经SDS-PAGE电泳分析分析表明，在此条件下hk-30融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的20％以上，基本上处于可溶状态。
实施例五 重组海葵神经毒素融合蛋白的纯化及成熟蛋白的获得将收获的总菌体用TE(pH8.0)洗涤，再用Tis(50mM，pH7.0)悬浮，超声处理后，裂解上清液经Ni2+Chelating Sepharose亲和色谱层析一步纯化，经SDS-PAGE分析和薄层扫描分析表明融合蛋白的纯度达到80％。以1L基因工程菌培养物为材料，最终获得约120mg纯化的融合蛋白。
为了提高重组蛋白的得率和浓度，简化实验步骤，缩短对重组蛋白的处理时间，在用Ni2+亲和色谱层析纯化重组蛋白时，我们采用一步法进行纯化。根据载体质粒pETTRX所表达的外源蛋白与Ni2+亲和柱的结合能力较强的特点，我们选用了较简化的洗脱条件50mMTris，500mMNaCl，pH7.0(A液)；50mMTris，500mMNaCl，pH6.0(B液)；50mM咪唑，50mMTris，500mMNaCl，pH6.0(C液)；100mM咪唑，50mMTris，500mMNaCl，pH6.0(D液)。重组As7多肽在D液被洗脱下来。从SDS-PAGE结果来判断分离效果最好的部分。
利用Folin-酚法测定重组As7的蛋白浓度，收获浓度在0.7mg/ml以上的洗脱液，加入Precision Protease进行切割，用SDS-PAGE检测酶切结果，可明显看到5kD附近代表成熟As7的谱带。将反应液用Ni2+Chelating Sepharose亲和色谱层析柱纯化(条件同前)，收获含成熟As7的穿流液，并用Sephadex G-50进一步纯化(洗脱液为PBS)，便得纯度在95％以上的成熟重组海葵As7(图9，10)。
实施例六 急性毒性实验(LD50)体重20±2g的NIH小鼠60只，随机分为6组，每组10只，雌雄各半，其中5组为给药组，1组为对照组。腹腔注射给药，1小时内，小鼠出现发呆、抽搐等中毒症状，继续观察7天，用Bliss法计算小鼠的半致死量。结果显示，重组As7蛋白对小鼠的半数致死量(LD50)为5.0mg/kg。
实施例七 重组As7蛋白对大鼠离体心房的强心实验重组As7的生物活性参照Shibata的方法，采用大鼠离体心房进行检测。结果发现，重组As7具有增强大鼠心肌收缩的能力。对心肌收缩力增强的程度用以下方法计算心房收缩增加百分率＝(给药后的心房收缩幅度-给药前的心房收缩幅度)/给药前的心房收缩幅度×100％，重组As7能明显增强大鼠离体心房的收缩能力，与毒K(毒毛旋花子甙K)比较，其作用更强。
重组h7a对大鼠离体心房增强收缩结果(n＝7～9 x±s)剂量分组 给药后对离体心房收缩增加百分率(％)(μg/ml) 1min 3min5min毒K(2) -4.00±8.0080±112.5 95.33±53.11高剂量h7a(2.0) 130.82±80.2 160.03±70.25 250.7±67.73中剂量h7a(1.0) 50.50±24.00 150.30±70.63 198.0±100.53低剂量h7a(0.5) 30.90±21.30 98.67±71.00152.22±76.00<110>中山大学<120>一种海葵神经毒素基因及其应用<130><140><141><160>2<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>405<212>DNA<213>侧花海葵(Anthopleura sp)<220><221>CDS<222>(117)..(263)<220><221>mat_peptide<222>(120)..(260)<220><221>polyA_signal<222>(343)..(347)<220><221>polyA_site<222>(385)..(405)<400>1ttcttccagg tctcccattt taatatagca aggcctaggg cgtatctagg attttgagta 60gggggagcac aaattaaaga agatgcacct gtgagggggg tcacagaatc ttaaag atg 119Met-1ggg gtg gca tgt ttg tgc gac agt gac ggt cct agc gtg cac ggc aat 167Gly Val Ala Cys Leu Cys Asp Ser Asp Gly Pro Ser Val His Gly Asn1 5 10 15acc ttg tca ggg aca atc tgg ttg gcc ggc tgc cca tcc ggg tgg cat 215Thr Leu Ser Gly Thr Ile Trp Leu Ala Gly Cys Pro Ser Gly Trp His20 25 30aac tgc aag gcc cat ggt ccg acc att ggc tgg tgc tgc aag cag taa 263Asn Cys Lys Ala His Gly Pro Thr Ile Gly Trp Cys Cys Lys Gln35 40 45gatctcctgc ccatcagagc caagactagc atcttagtca agtcattcat tagaataatg 323tagtaaaagc atgcattcaa taaaaactaa taattagcat taaaatcaat gattaaattg 383taaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 405<210>2<211>48<212>PRT<213>侧花海葵(Anthopleura sp)<400>2Met Gly Val Ala Cys Leu Cys Asp Ser Asp Gly Pro Ser Val His Gly1 5 10 15Asn Thr Leu Ser Gly Thr Ile Trp Leu Ala Gly Cys Pro Ser Gly Trp20 25 30His Asn Cys Lys Ala His Gly Pro Thr Ile Gly Trp Cys Cys Lys Gln35 40 4权利要求
1.一种海葵神经毒素基因As7，来源于侧花海葵触手总RNA，以RT-PCR方法扩增而得到的基因片段。
2.如权利要求1所述的基因，其特征在于它为141bp核苷酸，编码47个氨基酸，蛋白等电点为7.6，分子量为4800道尔顿，其核苷酸序列及其编码的氨基酸序列如附图1所示。
3.一种重组质粒载体，含有权利要求1所述的海葵神经毒素基因As7。
4.如权利要求3所述的载体，其特征在于载体为大肠杆菌表达载体。
5.如权利要求4所述的载体，其特征在于载体为pETTRX-As7，其建以硫氧环蛋白为融合伴体，中间插入His的亲和标记位点及蛋白酶3C识别位点，在胞内以可溶形式表达。
6.如权利要求4或5所述的载体，其特征在于载体转化的是能表达海葵神经毒素的大肠杆菌。
7.如权利要求6所述的载体，其特征在于载体为大肠杆菌BL21(DE3)。
8.利用权利要求5所述载体表达的蛋白为海葵神经毒素As7融合蛋白。
9.权利要求2或8所述的蛋白在制备治疗心血管疾病药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种新的一种海葵神经毒素基因As7，它是用RT－PCR的方法，从侧花海葵触手总RNA中分离得到的。本发明获得的重组海葵神经毒素具有生物活性，对大鼠离体心房具有强烈的促进收缩作用。本发明还公开了上述基因的表达及在制备治疗心血管疾病药物中的应用。
文档编号C12P19/34GK1432650SQ0211474
公开日2003年7月30日 申请日期2002年1月16日 优先权日2002年1月16日
发明者徐安龙, 刘文华, 彭文烈, 王义良, 彭立胜, 卫剑文, 王磊 申请人:中山大学