专利名称：一种与水稻抗褐飞虱基因连锁的scar分子标记的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种与水稻抗褐飞虱基因连锁的SCAR标记，可用于分子标记辅助育 种，属于水稻抗虫育种和分子生物学领域。
背景技术：
20世纪70年代以来，各国科学家都致力于抗褐飞虱新基因的开发和利用。到目前 为止，根据抗性基因对不同生物型褐飞虱的不同抗性反应，至少已经鉴定了 15个抗褐飞虱 基因(Athwal 等，1971 ；khush 等，1985 ；khush 和 Brar 等，1991 ；Ishii 等，1994 ；刘国庆等， 2001)，其中，Bphl 和 Bph2 抗生物型 1 和 3 ；Bph3、Bph4、Bph8、Bph9 和 BphlO (t)抗生物型 1、2和3 ；Bph5、Bph6、Bph7抗生物型4。对抗褐飞虱新基因进行定位是有效利用抗褐飞虱 基因的基础。现在已经将Bphl、bph2、Bph9、BphlO定位于水稻的第12号染色体上，bph(t) 和Bphll被定位于第3染色体上，Bph3、bph4、Bph (t)和bphl2分别被定位于第10、6、9、4 号染色体上[16]。1994年Ishii等采用RFLP分析方法将BphlO (t)定位在第12号染色体 距离RG4573. 68cM的位置上；1997年Huang等采用QTL分析法将一未命名的新抗性位点定 位在第12染色体的RG463和SdH-I之间；1998年Alam等以IR64和Azucena为亲本，构建 了一个含有131个单株的双单倍体，应用QTL方法研究IR64的抗性基因，实验结果表明， IR64的主效抗性基因被定位在第12染色体上，同时在第1、2、3、4、6、8染色体上也存在抗性 位点；2001年刘国庆等利用紧穗野生稻与栽培稻品种02428远缘杂交后代将一个抗性基因 定位在第2染色体上，位于SSR标记RM140和RM250之间，命名为Bphl3 (t)。在某些水稻品 种中还存在着抗褐飞虱基因的抑制基因，比如在水稻品种TKM6具有抗性基因Bphl和显性 抑制基因Ibphl，所以TKM6对褐飞虱表现为感虫反应，通过将TKM6和IR24杂交后两对基因 发生分离，在杂交后代中可以选择到抗虫单株，培育最终培育出抗褐飞虱新品种IR26。SCAR (sequence characterized amplified region) ；！5 歹曾 示 i 己 il 常是由RAPD标记转化而来的。为了提高所找到的某一 RAPD标记在应用上的稳定性，可将 该RAPD标记片段从凝胶上回收并进行克隆和测序，根据其碱基序列设计一对特异性引物 (18-24bp)，也可只对该RAPD标记片段的末端进行测序，在原来的10个碱基引物的基础上 增加相邻的14个左右的碱基，成为与原来RAPD标记片段末端相配对的特异性引物。并对 基因组DNA进行PCR扩增，便可以扩增出与原来RAPD标记片段相同大小的特异性带谱，这 种经过转化的特异DNA分子标记就成为SCAR标记。SCAR标记一般表现为扩增带谱的是否 存在，是一种显性标记。但有时也表现为长度多态性标记，为共显性标记[38]。相对RAPD 标记，由于SCAR标记所用的引物长度和并且与模板完全配对，所以在相当严谨的条件下， 我们可以得到稳定性和重复性很好的结果，随着SCAR标记研究的不断发展和完善，将会得 到越来越多的重要农艺性状的SCAR标记，在将来的分子辅助育种中发挥中重要作用。随着分子生物学的迅速发展，大部分的农作物的转化已经成为了可能，定位和分 离与重要农艺性状相关的基因已成为研究农艺性状发育过程的重要方向，也是应用基因工 程技术改良植物遗传性状的关键所在。近年来发展和应用了几种基因的定位方法。利用分子标记辅助选择育种可以有效实现育种从表型选择向基因型选择的根本性转变。
发明内容
本发明的目的是提供一种与水稻抗褐飞虱基因连锁的SCAR标记，该标记能够用 于水稻抗褐飞虱的辅助选择育种，为克隆新的抗褐飞虱基因奠定基础。本发明通过以下技术方案实现上述目的一种与水稻抗褐飞虱基因连锁的SCAR 标记，由序列表中的SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2组成的引物对PCR扩增获得。所述分子 标记SCAR694，是用RAPD分子标记方法筛选出S2297(13分子标记，再将S2297(13转换成稳定的 SCAR标记，该标记采用下列方法得到1、所用材料为药用野生稻1665 (Oryza officinals Waii Ex Wat t)与栽培稻桂 99远缘杂交的B3F4代自交分离群体。2、用CTAB法提取水稻总DNA，分别溶于1 X TE中，并于_20°C保存备用，经1. 0%的 琼脂糖凝胶电泳检测水稻总DNA的完整性，并根据EB染色强度计算其浓度。3、采用RAPD分子标记方法，对与水稻抗褐飞虱相关的分子标记的筛选。4、选出一个RAPD分子标记S2297Q3，经过连锁性鉴定，发现该标记与水稻抗褐飞虱 基因相连锁，与抗性基因的遗传距离为10. ICMo5、将S2297Q3克隆测序后，根据所测序列，设计引物SEQ ID NO. 1和SEQ IDN0. 2，以 水稻总DNA为模板，PCR扩增得到SCAR标记，即SCAR694。采用RAPD分子标记方法，进行与水稻抗褐飞虱基因相连锁的分子标记，其筛选的 具体做法为1)标记筛选本实验所用的材料为药用野生稻1665 (Oryza officinals Waii Ex Wat t)与 栽培稻桂99远缘杂交的B3F4代自交分离群体选取B3F4代自交分离群体中10株不抗褐 飞虱植株总DNA混合作为不抗池DNA，10株抗褐飞虱植株总DNA混合作为抗池DNA，用每 一条RAPD引物分别对不抗池DNA和抗池DNA分别进行RAPD PCR, PCR扩增反应体系建 AL 10 X buffer 2uL ；2. 5mM dNTP2uL ； IOpM primer IuL ；总 DNA (20 50ng/uL) ； IuL Ex Taq(0. 5u/uL)2uL ；最后加 ddH20 补足至 20uL。反应程序为 95°C 预变性 5min ；94°C 30s， 36°C 30s, 72°C Imin 40个循环；然后72°C延伸IOmin (袁勇芳等，2000)。PCR反应扩增产 物用1. 5%琼脂糖凝胶电泳然后经EB染色检测，并记录每条扩增带谱在琼脂糖凝胶上的位 置，筛选具有抗褐飞虱基因多态性的随机引物。2)标记S2297Q3的连锁性鉴定利用筛选得到的RAPD引物S229TO3对近等基因系群体122个单株进行PCR扩增。 结果显示，75株抗性单株中有66株存在特异带，9株不存在特异带；47株不抗单株中有1株 存在特异带，46株没有扩增到特异带。结果表明，特异片段S2297。3与水稻抗褐飞虱是紧密 连锁的，但在抗性单株和敏感单株中均存在一定的交换。结合近等基因系群体的表型抗性 鉴定结果，采用MAPMAKER/EXP. Version 3. 0分析，软件分析表明S2297(13与抗褐飞虱基因间 的遗传距离为10. IcM03) RAPD标记测序分析胶回收试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司，pGEM T-Easy vector kit购自Promega公司。用筛选的RAPD引物大量扩增RAPD标记，PCR产物用1. 5%琼脂糖凝胶电泳， 再用柱离心式小量胶回收试剂盒回收RAPD特异性标记片段，并连接克隆至克隆载体pGEM T-Easy vector上，按照BIORAD公司电脉冲仪的操作程序，采用电激法转化E. coliDH5 α， 在含有X-gal和IPTG的氨苄青霉素LA选择培养基上挑选白色菌落，并用限制性内切酶 EcoR I酶切鉴定重组质粒，送宝生物工程大连有限公司测序。测序结果显示，该RAPD特异 性标记片段大小为703bp。4) SCAR标记的转换根据RAPD标记特异性片段DNA测序结果，设计特异性引物SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2。用特异性引物对15株不抗株DNA和15株抗性单株DNA进行PCR，体系为10 X buffer 2uL,2. 5mM dNTP 2uL,IOpM primer 各 luL，总 DNA(20 50ng/uL)，IuL Ex Taq (0. 5u/ uL)2uL，加 ddH20补足至 20uL。反应程序为:95°C预变性 5min，94°C 30s, 50°C 30s, 72°C Imin 30个循环，然后72°C延伸lOmin。PCR反应扩增产物用1. 0%琼脂糖凝胶电泳然后经EB染 色检测。结果在抗性单株中扩增出了 694bp的特异带，而在不抗单株中没有检测到相应的
市ο本发明的突出效果在于该标记能够用于水稻抗褐飞虱的辅助选择育种，为克隆新的抗褐飞虱基因奠定了 ■石出。
具体实施例方式采用RAPD分子标记方法，得到与水稻抗褐飞虱相关的分子标记S229TO3，该分子标 记的实际长度为703bp，用SCAR方法换成SCAR694标记。一、水稻材料的准备将药用野生稻1665与栽培稻杂交，经过幼胚培养得到的Fl代与栽培稻品种进行 进行远缘杂交，然后连续回交、自交和植株抗性鉴定，获得近等基因系B3F4抗感群体，一共 122株。抗性表型鉴定结果见表1表1近等基因系B3F4植株抗性鉴定结果
近等基因系编号抗性植株数目 不抗植株数目群体数目B3F475 47122二、水稻总DNA提取取l-50g的新鲜水稻叶片，于液氮中研磨成粉末，将冻粉转入预冷的离心管中，立 即加入等体积(w/v)65°C预热的2XCTAB提取缓冲液，充分混勻，65°C保温10-20分钟，期 间不时摇动。加入等体积的氯仿/异戊醇，轻缓颠倒离心管混勻，室温下，12000r/mim离心 10-20分钟。将上清夜转入另一离心管中，加入1/10体积的10% CTAB，混勻，加入等体积 的氯仿/异戊醇，颠倒离心管混勻，室温下，12000r/min离心10分钟。取上清液，重复(4) 操作1次。将上清液转入新的经硅烷化处理的离心管中，加入1-1. 5倍体积的IXCTAB沉 淀缓冲液，混勻，室温下放置30分钟，观察沉淀生成，如无明显沉淀生成，延长放置时间，随 放置时间延长，沉淀量增加。3500-4000r/min离心5_10分钟，去上清，沉淀吹干，用200uL 10XTE溶解。
加入1-2. 5uL RNAse (10g/L)，37°C保温 1 小时。加入 2_4uL 蛋白酶 K，55°C保温 1 小时。加入150uL H2O和360uL(24 1)氯仿/异戊醇，轻缓摇动6分钟，混勻，室温8000r/ min离心10分钟。上相转入另一新的离心管中，加入1/10体积预冷的NaAC (3M)，再加入2 倍体积预冷的无水乙醇，沉淀DNA，-20°C放置30分钟以上，低温下12000r/min离心10分 钟。DNA沉淀用75%乙醇洗涤两次，离心倒掉乙醇。风干后，加入50UL1XTE溶解，-20°C保 存，备用。三、近等基因系(NIL)DNA混合池的构建从近等基因系中选取10株抗性等级最高的抗性单株，解冻已经稀释的样品DNA， 分别取出50uL混合在一起，构成近等基因系的抗DNA混合池。根据同样的原理，从近等基 因系中选取10株抗性等级最低的抗性单株，解冻已经稀释的样品DNA，分别取出50uL混合 在一起，构成近等基因系的不抗DNA混合池。四、扩增多态性DNA (RAPD)分析用每一条RAPD弓丨物分别对不抗池DNA和抗池DNA分别进行RAPD PCR, PCR扩增 反应体系建立10 X buffer 2uL ；2. 5mM dN TP 2uL ； IOpM RAPDprimer IuL ；总 DNA (20 50ng/uL) IuL ；Ex Taq (0. 5u/uL) 2uL ；加 ddH20 补足至 20uL。反应程序为:95°C预变性 5min ； 940C 30s, 360C 30s, 72°C Imin 40 个循环，然后 72°C延伸 IOmin0 PCR 反应扩增产物用 1. 5% 琼脂糖凝胶电泳然后经EB染色检测，并记录每条扩增带谱在琼脂糖凝胶上的位置，分析每 个RAPD引物在不同DNA池的扩增产物的电泳图谱，寻找在抗、感集团中存在多态性的RAPD 引物，通过4轮的逐渐缩小范围筛选，初步得到能扩增与抗褐飞虱基因Bph连锁的RAPD标 记的随机引物。筛选得到具有抗褐飞虱基因多态性的随机引物S2297Q3。六、标记S229TO3的连锁性鉴定利用筛选得到的RAPD引物S229TO3对近等基因系群体122个单株进行PCR扩增。 结果显示，75株抗性单株中有66株存在特异带，9株不存在特异带；47株不抗单株中有1株 存在特异带，46株没有扩增到特异带。结果表明，特异片段S2297。3与水稻抗褐飞虱是紧密 连锁的，但在抗性单株和敏感单株中均存在一定的交换。结合近等基因系群体的表型抗性 鉴定结果，采用MAPMAKER/EXP. Version 3. 0分析，软件分析表明S2297(13与抗褐飞虱基因间 的遗传距离为10. IcM0七、RAPD标记测序分析胶回收试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司，pGEM T-Easy vector kit购自 Promega公司。用筛选的RAPD引物大量扩增RAPD标记，PCR产物用1. 5%琼脂糖凝胶电泳， 再用柱离心式小量胶回收试剂盒回收RAPD特异性标记片段，并连接克隆至克隆载体pGEM T-Easy vector上，按照BIORAD公司电脉冲仪的操作程序，采用电激法转化E. coliTH5 α， 在含有X-gal和IPTG的氨苄青霉素LA选择培养基上挑选白色菌落，并用限制性内切酶 EcoR I酶切鉴定重组质粒，送宝生物工程大连有限公司测序。测序结果显示，该RAPD特异 性标记片段大小为703bp。八、分子标记的SCAR转换根据RAPD标记特异性片段DNA测序结果，设计特异性引物SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0. 2。用特异性引物对15株不抗株DNA和15株抗性单株DNA进行PCR，体系为10 X buffer 2uL,2. 5mM dNTP 2uL,IOpM primer 各 IuL,总 DNA(20 50ng/uL)luL，Ex Taq (0. 5u/uL)2uL，加 ddH20 补足至 20uL。反应程序为95°C预变性 5min，94°C 30s, 50°C 30s, 72°C Imin 30个循环，然后72°C延伸lOmin。PCR反应扩增产物用1. 0%琼脂糖凝胶电泳然后经EB染 色检测。结果在抗性单株中扩增出了 703bp的特异带，而在不抗单株中没有检测到相应的
市ο
权利要求
一种与水稻抗褐飞虱基因连锁的SCAR分子标记，其特征在于，由序列表中的SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2组成的引物对PCR扩增得到。
2.权利要求1所述的分子标记，是用RAPD分子标记方法筛选出S229TO3分子标记，再将 S229703转换成稳定的SCAR标记，该SCAR标记采用下列方法步骤获得(1)所用材料为药用野生稻1665(Oryza officinals Waii Ex Wat t)与栽培稻桂99 远缘杂交的B3F4代自交分离群体，(2)用CTAB法提取水稻总DNA，分别溶于IXTE中220°C保存备用，经1.0%的琼脂糖 凝胶电泳检测水稻总DNA的完整性，并根据EB染色强度计算其浓度，(3)采用RAPD分子标记方法，对与水稻抗褐飞虱相关的分子标记的筛选，(4)选出一个RAPD分子标记S2297Q3，该标记与水稻抗褐飞虱基因相连锁，与抗性基因 的遗传距离为10. 1CM，(5)将S229703克隆测序后，根据所测序列，设计引物SEQID NO. 1和SEQID NO. 2，以水 稻总DNA为模板，PCR扩增得到SCAR标记，即SCAR694。
3.按照权利要求1所述的与水稻抗褐飞虱基因连锁的SCAR分子标记，其特征在于， 用RAPD分子标记方法，进行与水稻抗褐飞虱相关的分子标记，其筛选的具体做法是选取 B3F4代自交分离群体中10株不抗褐飞虱植株总DNA混合作为不抗池DNA，10株抗褐飞虱 植株总DNA混合作为抗池DNA，用每一条RAPD引物分别对不抗池DNA和抗池DNA分别进行 RAPD PCR，PCR 扩增反应体系建立10 X buffer 2uL 2. 5mM dNTP 2uL IOpM RAPD primer IuL 总 DNA (20 50ng/uL) IuL ExTaq (0. 5u/uL) 2uL,加 ddH20 补足至 20uL，95 "C 预变性 5min，94°C 30s, 36°C 30s, 72°C Imin 40 个循环，然后 72°C延伸 lOmin，PCR 反应扩增产物用 1. 5%琼脂糖凝胶电泳然后经EB染色检测。
4.按照权利要求2所述的与水稻抗褐飞虱基因连锁的SCAR分子标记，其特征在于，将 S229703转换成稳定的SCAR694标记，具体做法为首先将标记S229TO3克隆至克隆载体pGEM T-Easy vector上，按照BIORAD公司电脉冲仪的操作程序，采用电激法转化E. coliDH5 α， 在含有X-gal和IPTG的氨苄青霉素LA选择培养基上挑选白色菌落，并用限制性内切酶 EcoRI酶切鉴定重组质粒，送宝生物工程大连有限公司测序，测序后，根据该序列设计2个 SCAR引物Pl和P2，在B3F4代自交分离群体的抗性单株中分别进行PCR扩增，均能扩增出 预计的SCAR标记SCAR6941全文摘要
一种与水稻抗褐飞虱基因连锁的SCAR分子标记，采用282个随机引物对药用野生稻1665和栽培稻桂99远缘杂交的抗褐飞虱近等基因系B3F4分离群体的不抗池DNA和抗池DNA进行了特异性RAPD标记筛选，从中筛选到一个具有明显的特异性扩增带谱的RAPD标记S229，S229序列长度为703bp，与基因库中已报道的水稻第四号染色体的BAC克隆(编号OS JNBa0070011)序列(67114269100)有51.86％的同源性。将RAPD标记转化为稳定的SCAR标记。该标记可用于水稻抗褐飞虱的辅助选择育种，为克隆新的抗褐飞虱基因奠定了基础。
文档编号C12P19/34GK101880710SQ20101010121
公开日2010年11月10日 申请日期2010年1月26日 优先权日2010年1月26日
发明者梁肖仍, 武波, 申佩弘, 蒋承建, 金科, 韦东 申请人:广西大学