专利名称：提高链霉菌种发酵液中分泌的抗肿瘤抗生素含量的方法
技术领域：
本发明涉及一种提高链霉菌种发酵液中分泌的抗肿瘤抗生素含量的方法。属于利用链霉菌种制备抗肿瘤抗生素的技术。
背景技术：
本申请人所申请的“一种微生物发酵制备的抗肿瘤抗生素”，申请号为01141443.x，该申请专利中提及的抗肿瘤抗生素其分子式为C32H44N2O9，分子量为600，熔点为240℃，外观呈淡亮黄色结晶，它在药学上接受的盐是盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐。我们把这种抗肿瘤抗生素称为AGPM。它的制备是以我国海南省三亚地区土壤中筛选得到的链霉菌菌株，经菌种的培养、发酵、发酵液的过滤、吸附洗脱、萃取、浓缩、层析分离纯化、冷冻干燥等步骤而得到纯的抗肿瘤抗生素。现有上述的制备过程中发酵液中的抗肿瘤抗生素的含量很低，在单位发酵液中该抗生素含量仅为7.8mg/l，难以实现规模化生产。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高链霉菌种发酵液中分泌的抗肿瘤抗生素含量的方法，该方法不但能够提高菌株发酵液中分泌的抗肿瘤抗生素的含量，而且制备方法简单，易于规模化生产。
为了达到上述目的，本发明是通过下述技术方案加以实现的以我国海南省三亚地区土壤中筛选得到的链霉菌菌株，经菌种的培养、发酵得到含有抗肿瘤抗生素链霉菌的发酵液，其特征在于以硫酸二乙酯为诱变剂对孢子进行30-40分钟的化学诱变，或者采用15-30W紫外线对孢子进行40-20秒的物理诱变，或者利用硫酸二乙酯、紫外线对孢子进行化学、物理联合诱变；采用的发酵培养基的组成为玉米淀粉2-3％，蛋白胨0.2-0.6％，玉米桨0.2-1％，磷酸氢二钾0.05-0.15％，葡萄糖0.5％，氯化钠0.05％，硫酸镁0.05％，淀粉酶0.005％，其余成分为水；发酵培养条件培养温度为26-30℃，发酵培养基的初始pH值为5.5-6.5，通气量为0.8-1.2vvm，搅拌转速为400-600rpm。
本发明的优点在于，诱变后孢子在其发酵培养液中分泌的抗肿瘤抗生素的含量明显高于现有方法发酵液中分泌的抗肿瘤抗生素的含量，有效地提高了抗肿瘤抗生素的总含量，适用于批量生产。
具体实施例方式
下面再以实施例对本发明作进一步说明。
实施例一将新鲜健壮的斜面孢子以生理盐水洗下，移至液体培养基中，培养4小时，使孢子萌发，离心并以生理盐水洗涤孢子，转移至装有玻璃珠的三角瓶中，剧烈振荡15分钟，用无菌玻璃棉过滤获得单孢子悬浮液，并调整孢子浓度为108个/ml，取4ml菌悬液，加入16mlpH7.0磷酸缓冲溶液，加入0.2ml硫酸二乙酯，硫酸二乙酯相对密度为1.18，相对分子量为154，在30℃下诱变处理35分钟，将诱变后的菌液经10倍系列稀释达到孢子浓度为10-100个/ml后，涂布于分离平板上，28℃培养5天，将得到的单菌落挑至初筛平板上，32℃培养20小时，将产生较大抑菌圈的菌落转移至斜面上，待菌种长成后接于初始发酵培养基中进行复筛，测得抗肿瘤抗生素含量为13.35mg/l，是处理前的7.8mg/l的1.71倍，将该种菌株接于斜面上进行保藏传代，待菌株长满斜面后将其接于10瓶装有种子培养基的三角瓶中，种子培养基的组成为葡萄糖0.5％，可溶性淀粉2％，蛋白胨0.4％，玉米桨1％，磷酸氢二钾0.05％，硫酸镁0.05％，氯化钠0.05，酵母膏0.2％。每瓶装培养基为50ml，在28℃下，220转/分钟，培养48小时后，转入装有5升发酵培养基的发酵罐中，发酵培养基组成为葡萄糖0.5％，玉米淀粉4％，蛋白胨0.4％，玉米桨1％，磷酸氢二钾0.05％，硫酸镁0.05％，氯化钠0.05％，淀粉酶0.005％。控制通气量为1.2vvm，搅拌转速为400转/分钟，在28℃下培养96小时后，用高效液相色谱测定发发酵液中的抗肿瘤抗生素含量为18.89mg/l，是现有的技术制备的发酵液中含有的抗肿瘤抗生素7.8mg/l的2.42倍。
实施例二将新鲜健壮的斜面孢子以生理盐水洗下，移至液体培养基中，培养4小时，使孢子萌发，离心并以生理盐水洗涤孢子，转移至装有玻璃珠的三角瓶中，剧烈振荡15分钟，用无菌玻璃棉过滤获得单孢子悬浮液，并调整孢子浓度为108个/ml，取10ml菌悬液于带磁棒的Φ90mm的培养皿内，磁力搅拌下在距离15W紫外线灯30cm处用紫外线照射30秒，将诱变后的菌液经10倍系列稀释达到孢子浓度为10-100个/ml后，涂布于分离平板上，28℃避光培养5天，将得到的单菌落挑至初筛平板上，32℃培养20小时，将产生较大抑菌圈的菌落转移至斜面上，待菌种长成后接于初始发酵培养基中进行复筛，测得抗肿瘤抗生素AGPM含量为14.20mg/l，是处理前的7.8mg/l的1.82倍，将该菌株接于斜面上进行保藏传代，待菌株长满斜面后将其接于10瓶装有种子培养基的三角瓶中，种子培养基的组成为葡萄糖0.5％，可溶性淀粉2％，蛋白胨0.4％，玉米桨1％，磷酸氢二钾0.05％，硫酸镁0.05％，氯化钠0.05，酵母膏0.2％。每瓶装培养基为50ml，在28℃下，220转/分钟，培养48小时后，转入装有5升发酵培养基的发酵罐中，发酵培养基组成为葡萄糖0.5％，玉米淀粉3.5％，蛋白胨0.4％，玉米桨0.5％，磷酸氢二钾0.05％，硫酸镁0.05％，氯化钠0.05％，淀粉酶0.005％。控制通气量为1.2vvm，搅拌转速为500转/分钟，在28℃下培养96小时后，用高效液相色谱测定发发酵液中的抗肿瘤抗生素含量为19.45mg/l，是现有的技术制备的发酵液中含有的抗肿瘤抗生素7.8mg/l的2.5倍。
实施例三将新鲜健壮的斜面孢子以生理盐水洗下，移至液体培养基中，培养4小时，使孢子萌发，离心并以生理盐水洗涤孢子，转移至装有玻璃珠的三角瓶中，剧烈振荡15分钟，用无菌玻璃棉过滤获得单孢子悬浮液，并调整孢子浓度为108个/ml，取4ml菌悬液，加入16mlpH7.0磷酸缓冲溶液，加入0.2ml硫酸二乙酯，硫酸二乙酯相对密度为1.18，相对分子量为154，在30℃下诱变处理25分钟，取10ml上述用硫酸二乙酯酯处理过的菌悬液于带磁棒的Φ90mm的培养皿内，磁力搅拌下在距离15W紫外线灯30cm处用紫外线照射25秒，将诱变后的菌液经10倍系列稀释达到孢子浓度为10-100个/ml后，涂布于分离平板上，28℃避光培养5天，将得到的单菌落挑至初筛平板上，32℃培养20小时，将产生较大抑菌圈的菌落转移至斜面上，待菌种长成后接于初始发酵培养基中进行复筛，测得抗肿瘤抗生素AGPM含量为16.45mg/l，是处理前的7.8mg/l的2.1倍，将该种菌株接于斜面上进行保藏传代，待菌株长满斜面后将其接于10瓶装有种子培养基的三角瓶中，种子培养基的组成为葡萄糖0.5％，可溶性淀粉2％，蛋白胨0.4％，玉米桨1％，磷酸氢二钾0.05％，硫酸镁0.05％，氯化钠0.05，酵母膏0.2％。每瓶装培养基为50ml，在28℃下，220转/分钟，培养48小时后，转入装有5升发酵培养基的发酵罐中，发酵培养基组成为葡萄糖0.5％，玉米淀粉4％，蛋白胨0.6％，玉米桨0.2％，磷酸氢二钾0.1％，硫酸镁0.05％，氯化钠0.05％，淀粉酶0.005％。控制通气量为1.2vvm，搅拌转速为600转/分钟，在28℃下培养96小时后，用高效液相色谱测定发发酵液中的抗肿瘤抗生素含量为20.14mg/l，是现有的技术制备的发酵液中含有的抗肿瘤抗生素7.8mg/l的2.58倍。
权利要求
1.一种提高链霉菌种发酵液中分泌的抗肿瘤抗生素含量的方法，该方法以海南省三亚地区土壤中筛选得到的链霉菌菌株，经菌种的培养、发酵得到含有抗肿瘤抗生素链霉菌的发酵液，其特征在于以硫酸二乙酯为诱变剂对孢子进行30-40分钟的化学诱变，或者采用15-30W紫外线对孢子进行40-20秒的物理诱变，或者利用硫酸二乙酯、紫外线对孢子进行化学、物理联合诱变；菌种的发酵培养基的组成为玉米淀粉2-3％，蛋白胨0.2-0.6％，玉米桨0.2-1％，磷酸氢二钾0.05-0.15％，葡萄糖0.5％，氯化钠0.05％，硫酸镁0.05％，淀粉酶0.005％，其余成分为水；发酵培养条件培养温度为26-30℃，发酵培养基的初始pH值为5.5-6.5，通气量为0.8-1.2vvm，搅拌转速为400-600rpm。
全文摘要
本发明公布了一种提高链霉菌种发酵液中分泌的抗肿瘤抗生素含量的方法。属于利用链霉菌种制备抗肿瘤抗生素技术。该方法对筛选得到的链霉菌菌株进行诱变,经菌种的培养及发酵过程,得到含有抗肿瘤抗生素的发酵液,其特征在于以硫酸二乙酯为对孢子进行化学诱变,或者采用紫外线对孢子进行物理诱变,或者利用硫酸二乙酯、紫外线对孢子进行化学、物理联合诱变;发酵培养基的组成为:玉米淀粉2－3%,蛋白胨0.2－0.6%,玉米浆0.2－1%,磷酸氢二钾0.05－0.15%,葡萄糖0.5%,氯化钠0.05%,硫酸镁0.05%,淀粉酶0.005%培养温度为26－30℃,培养基的初始pH值为5.5－6.5,通气量为0.8－1.2vvm,搅拌转速为400－600rpm。本发明发酵液中的抗肿瘤抗生素含量能够达到18.34mg/l,该方法可适用于规模化生产。
文档编号C12P1/06GK1385536SQ02121140
公开日2002年12月18日 申请日期2002年6月10日 优先权日2002年6月10日
发明者元英进, 牛晋阳, 石炳兴, 陈贵斌, 张建勇, 马忠海 申请人:天津大学