专利名称：应用pcr－sscp－str技术筛测21三体综合征的方法
技术领域：
分子生物学背景技术 21三体综合征(又称先天愚型或Down综合征)是人类最常见的染色体病，在活产婴中其发病率约为1/600-1/800，我国21三体综合征的总现患率为0.47‰，城市为0.26‰，农村为0.56‰[1]。患者主要症状为先天性智力发育低下，还常伴有先天性心脏病等疾患。目前尚无有效治疗方法，因此对Down综合征胎儿进行产前诊断具有重要意义，从70年代开始我国开展了对21三体综合征的产前诊断，主要是用细胞培养，染色体制备的方法，这种方法费时较长，技术要求较高，难于适用大规模的产前普查。90年代初国外学者报导了通过荧光标记技术，用PCR方法快速诊断Down综合征[5-10]。人类基因组的STR位点遵循孟德尔的遗传规律，STR具有高度的多态性，80年代后期许多研究开始使用STR作为DNA的标志物，设计引物进行PCR扩增特定染色体序列，应用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-single strand conformation polymorphism，PCR-SSCP)分析方法，来检测DNA中的微小碱基变化。这种方法能快速、灵敏地检测基因突变和多态性。正常人DNA的STR位点有2对等位基因，而21三体综合征患者因为多了一条染色体，所以DNA的STR位点。有6对等位基因。通过引物对进行PCR扩增多态性的DNA序列后，单链DNA在聚丙烯酰胺凝胶中电泳，DNA构象差异将出现泳动变位，表现出电泳带位置的差异。发明目的 本发明应用短串联重复序列(Short tandem repeat，STR)作为遗传标记，通过聚合酶链反应(Polymerase chain reaction，PCR)扩增，应用单链构象多态性(Single strand conformation polymorphism，SSCP)分析技术，能够在分子水平上简便、快速和准确地诊断21三体综合征。
发明内容
本发明应用短串联重点序列作遗传标记，在21三体综合征的关键区位选择了2个STR位点，它们分别位于D21S1414和D21S1411位点，与Down综合征核心区紧密连锁[11]。设计2对引物，通过聚合酶链反应，对这2对等位基因进行PCR扩增。具体步骤如下1、PCR扩增 采用2针对D21S1411和D21S11的特异引物[3]PCR扩增21号染色体2个短串联重复位点(short tandom repeat，STR)，反应体系总体积50μl，含基因组DNA 0.1μg，引物0.5μmol/L，dNTP 100μmol/L，TaqDNA聚合酶2.0U，缓冲液5μl，最后加灭菌蒸馏水使反应体积为50μl。所有样品统一混合反应液分装，用灭菌矿物油覆盖。反应条件为95℃变性5分钟，接着运行30个循环(95℃变性45秒钟-60℃退火35秒钟-70℃延伸45秒钟)，最后72℃延伸5分钟。引物序列为5’-atg-atg-aat-gca-tag-atg-gat-g-3’，5’-aat-gtg-tgt-cct-tcc-agg-c-3’，5’-tat-gtg-agt-caa-ttc-ccc-aag-tga-3’，5’-gtt-gta-tta-gtc-aat-gtt-ctc-cag-3’。2、低离子强度(low ironic strength，LIS)SSCP分析参照文献[4]LIS-PCR-SSCP方法制备8％聚丙烯酰胺凝胶，0.5×TBE电泳缓冲液。将扩增产物2ul加入20ul 1×LIS缓冲液混合，98℃变性5min，取10ul上样，25℃300V电压，预电泳15分钟，电泳分离5-9小时。电泳结束后，取下凝胶，放入1％冰乙酸中固定10分钟，然后放入0.2％硝酸银中染色20分钟，最后放入显色液(1.5氢氧化钠-0.4％甲醛)中显色。干胶。观察结果并照像，本发明对19例Down综合征患儿及其父母和3例Down综合征胎儿及其父母进行了检测分析。提取基因组DNA，进行PCR扩增，变性为单链DNA后，分别进行聚丙烯酰胺凝胶电泳5-9小时。经银染色后干胶，观察结果并照像。本发明对19例Down综合征患儿及其父母和3例Down综合征胎儿及其父母进行了检测分析。提取基因组DNA，进行PCR扩增，变性为单链DNA后，分别进行聚丙烯酰胺凝胶电泳6-15小时。经银染色后干胶，观察结果并照像。22例21三体综合征患者及其父母在D21S1414和D21S1414位点经一对引物(5’-aaa-tta-gtg-tct-ggc-acc-cag-ta-3’，5’-caa-ttc-ccc-aag-tga-att-gcc-ttc-3’)扩增后，片段长度约为239bp。21例患者PCR-SSCP构象与母源的构象完全相同，与父源的构象部分相同。一例与母源和父源的构象均相同，父母为纯合子。22例患者及其父母在D21S1414和D21S1411位点经一对引物(5’-atg-atg-aat-gca-tag-atg-gat-g-3’，5’-aat-gtg-tgt-cct-tcc-agg-c-3’)扩增后片段长度约为172bp。22例患者PCR-SSCP构象与母源的构象完全相同，与父源的构象部分相同。研究结果表明，21三体综合征患者因为较正常人多了一条染色体，用PCR扩增DNA上的STR位点，通过SSCP分析技术可明确患儿的染色体数目，并且明确确定多出来的染色体的父母来源。
本发明的方法采用多个位点的STR作为21三体综合征的遗传标记，应用PCR-SSCP分析技术，诊断21三体综合征是定性方法，敏感性强，准确率较高，且方法简便、快速，避免了细胞培养、荧光杂交等复杂实验操作。一次性可同时完成多个标本的检测，可作为大规模的产前普查的方法。
图PCR-SSCP-STR分析21三体综合症泳道1-3扩增D21S1411的分析结果，泳道4-6分别扩自D21S11，1和4，2和5，3和6分别扩增自为母亲、父亲、21三体患儿。Fig.1Analysis trisomy 21 by PCR-SSCP-STR.Lane 1，4 amplifiedfrom the mother of arisomy 21 child，lane2，5 amplified from the father，lane3，6 from trisomy 3，6.LIS-SSCP实施例应用D21S1411和D21S11-SSCP分析结果，PCR扩增产物单链DNA构象凝胶电泳检测结果，22例患者及其父母PCR扩增产物单链DNA电泳后，21例Down综合征患者PCR扩增产物单链DNA构象与母源的构象完全相同，与父源的构象部分相同。一例与母源和父源的构象均相同。如图所示为典型的SSCP分析结果(Fig.l)，LIS-SSCP-STR显示，21三体患儿的电泳带型包含母亲的全部带型，而仅含父亲的部分带型，提示在所分析的21号染色体STR位点中，患儿均有母亲2个等位STR位点，而仅含1个父亲的等位STR位点，即遗传了母亲的2条21号染色体和父亲的1条染色体，为21三体患儿。
权利要求
1.一种应用PCR-SSCP-STR技术分子筛查21三体综合征的方法，其特征是应用短串联序列作遗传标记，在21三体综合征的关键区位选择STR位点，设计2对引物，通过聚合酶链反应，对这2对等位基因进行PCR扩增。具体步骤如下1)、PCR扩增 采用2针对D21S1411和D21S11的特异引物[3]PCR扩增21号染色体2个短串联重复位点(short tandom repeat，STR)，反应体系总体积50μl，含基因组DNA 0.1μg，引物0.5μmol/L，dNTP 100μmol/L，TaqDNA聚合酶2.0U，缓冲液5μl，最后加灭菌蒸馏水使反应体积为50μl。所有样品统一混合反应液分装，用灭菌矿物油覆盖。反应条件为95℃变性5分钟，接着运行30个循环(95℃变性45秒钟-60℃退火35秒钟-70℃延伸45秒钟)，最后72℃延伸5分钟。引物序列为5’-atg-atg-aat-gca-tag-atg-gat-g-3’，5’-aat-gtg-tgt-cct-tcc-agg-c-3’，5’-tat-gtg-agt-caa-ttc-ccc-aag-tga-3’，5’-gtt-gta-tta-gtc-aat-gtt-ctc-cag-3’。2)、低离子强度(low ironic strength，LIS)SSCP分析参照文献[4]LIS-PCR-SSCP方法制备8％聚丙烯酰胺凝胶，0.5×TBE电泳缓冲液。将扩增产物2ul加入20ul 1×LIS缓冲液混合，98℃变性5min，取10ul上样，25℃300V电压，预电泳15分钟，电泳分离5-9小时。电泳结束后，取下凝胶，放入1％冰乙酸中固定10分钟，然后放入0.2％硝酸银中染色20分钟，最后放入显色液(1.5氢氧化钠-0.4％甲醛)中显色。干胶。观察结果并照像。
2.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于在21三体综合征的关键区位，选择了两个STR位点，分别位于D21S1411和D21S11，与Down综合征核心区紧密连锁。
全文摘要
本发明属于分子生物学。21三体综合征(又称先天愚型综合征)，是人类最常见的染色体病，现有的检测方法费时较长，技术要求高，不适合大规模的产前普查。本发明提出一种应用PCR－SSCP－STR技术筛查21三体综合征的方法，该方法敏感性强，准确率较高，且方法简便、快速，避免了复杂的手续，可作为大规模产前普查的方法。
文档编号C12Q1/16GK1390952SQ02134208
公开日2003年1月15日 申请日期2002年6月18日 优先权日2002年6月18日
发明者杨琳琳 申请人:杨琳琳