专利名称：用于检测溶血性链球菌全族群的荧光pcr引物、探针及方法
技术领域：
本发明属于检验检疫领域，尤其涉及用于检测溶血性链球菌全族群的荧光PCR引物、探针及方法。
背景技术：
溶血性链球菌是重要的食源性致病菌，能导致化脓、败血等症状。在日常检验中的溶血性链球菌属于常规检验项目，检测任务繁重。在溶血性链球菌引起的食品安全事件中， 大部分是由A群溶血性链球菌感染引起的，但是近年来C、G群溶血性链球菌所引起的感染案例呈递增趋势。目前，溶血性链球菌的检测方法主要依据国家标准《GB/T 4789. 11-2003食品卫生微生物学检验溶血性链球菌检验》，以下简称为国标方法。国标方法通过革兰氏染色、观察溶血、杆菌肽敏感试验及链激酶试验对溶血性链球菌进行微生物学检验。国标方法进行溶血性链球菌的检测需经选择性增菌、分离纯化、生化鉴定等步骤， 检测周期通常需要5 7天。对于污染严重的样品，混杂了大量环境细菌，而在培养过程中， 由于目前的增菌液并非很好的选择性培养基，导致一些非目标菌的大量繁殖，增加了目标菌的分离纯化难度，若是检验人员没有足够丰富的工作经验则容易导致漏检。对于一些复杂样品(如食品)，不同的加工工艺导致了其内在成分差异很大，例如含糖量、PH值、含盐量等，其自身的这些复杂情况可能会改变培养基的成分、PH值、盐分等，从而干扰细菌的培养， 可能导致漏检。因此，现有的国标方法存在检测周期长，检测步骤繁琐，对检验人员的经验要求较高，容易导致漏检的缺点。
发明内容
为解决现有技术中存在的问题(检测周期长，检测步骤繁琐，对检验人员的经验要求较高，容易导致漏检)，本发明提供用于检测溶血性链球菌全族群的荧光PCR引物、探针及方法。本发明以A、C、G群溶血性链球菌的溶血素S为靶基因位点，通过在NCBI数据库中下载溶血素S的靶基因序列进行序列比对，找到了保守于A、C、G群溶血性链球菌中的序列，根据该序列设计荧光PCR引物和探针。一个方面，本发明提供用于检测溶血性链球菌全族群的荧光PCR引物和探针，引物和探针的核苷酸序列为
正向引物 Pl :5，-GCTACTAGTGTAGCTGAAACAA-3，(SEQ ID NO 1)； 反向引物 P2 :5，-AGCAACAAGTAGTACAGCAGCA -3，(SEQ ID NO 2)； 探针5，-AAACAACTCAAGTTGCTCCTGGAGG-3，(SEQ ID NO 3)； 该探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。
作为本发明的进一步改进，所述荧光报告基团选自FAM、HEX、TET或JOE ；所述荧光淬灭基团为TAMRA。作为本发明的进一步改进，所述荧光报告基团选自FAM、HEX、ΤΕΤ、JOE、CY3、CY5、 ROX, TAMRA或iTexas Red ；所述荧光淬灭基团为BHQ。作为本发明的进一步改进，所述荧光报告基团选自FAM、HEX、ΤΕΤ、JOE、TAMRA或 ROX ；所述荧光淬灭基团为ECLIPSE。另一方面，本发明提供一种用于检测溶血性链球菌全族群的荧光PCR检测方法， 其特征在于包括如下步骤
A)DNA模板的制备；
B)配制含有如权利要求1至4中任一项所述引物和探针的反应体系，对DNA模板进行 PCR扩增，在ABI7500荧光定量PCR仪上的运行条件为95°C 3min ；95°C 15s，60°C 34s, 40 个循环，每个循环结束后收集荧光信号；
C)反应结束后，读取并记录扩增循环数(Ct)，根据扩增循环数进行检测结果的判断。探针荧光基团标记在探针的5’端，而淬灭基团则在3’端。当完整的探针与目标序列配对时，5’端发光基团因与3’端的淬灭基团接近，其发射的荧光被淬灭。当PCR反应到延伸步骤时，DNA聚合酶的5’外切酶活性将探针酶切断裂，使发光基团与淬灭基团分离， 从而使发光基团发出荧光信号。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累，因此荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系。Ct值(cycle threshold, Ct)的定义为每个反应管内荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数。阈值的设定一般是将其设定为恰好可以覆盖住阴性对照和空白对照的荧光值处，因此可以很好的去除反应管荧光值即背景。检测结果的判定标准为Ct值< 35时，可判定检测结果为阳性；Ct值> 40时，可判定检测结果为阴性；35<Ct值<40时，需适当增加模板量重复扩增，如果得到Ct值> 40， 则可判定检测结果为阴性，否则判定检测结果为阳性。与现有技术相比，本发明的有益效果有
1)特异性强本发明摒弃了以往研究中采用的溶血素0、链激酶、M蛋白等常用靶基因位点，以A、C、G群溶血性链球菌的溶血素S为靶基因位点，通过在NCBI数据库中下载溶血素S的靶基因序列进行序列比对，找到了保守于A、C、G群溶血性链球菌中的序列，根据该序列设计荧光PCR引物及探针，因此能够对A、C、G群溶血性链球菌进行特异的检验；
2)检测范围广可同时对A、C、G群溶血性链球菌进行检验，可防止漏检；
3)灵敏度高增菌18h，可在含有初始浓度为3CFU/mL的样品增菌液检出A群溶血性链球菌，可在含有初始浓度为2 CFU/mL的样品增菌液检出G群溶血性链球菌，可在含有初始浓度为50 CFU/mL的样品增菌液检出C群溶血性链球菌；
4)检测效率高检测周期由国标方法的5 7天缩短为增菌1 后经历Ih左右的PCR反应程序，检测时间短，且可同时检测96个样品，检测量大；
5)操作简单且结果直接客观操作步骤简单，自动化程度高，Ct值为仪器自动生成，结果直接客观，对操作人员的经验要求不高；
6)安全性好由于操作时所处理的菌需经过水煮法制备DNA，因此操作人员可避免直接接触高浓度的活菌，对操作人员有一定的保护性。
图1荧光PCR检测溶血性链球菌的特异性。图2荧光PCR检测样品的结果。
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。实施例1引物和探针的设计和合成。具有乙型溶血特征的链球菌主要为A、B、C、G群链球菌，而具有链激酶阳性特征的链球菌为A、C、G群链球菌，对于具有杆菌肽阳性特征的链球菌为哪几群则未在文献中发现相关报道，因此开展杆菌肽敏感实验。结果如表1所示，杆菌肽纸片抑菌圈直径大于IOmm判定为杆菌肽敏感即杆菌肽敏感实验阳性，用+表示；杆菌肽纸片抑菌圈小于等于IOmm判定为杆菌肽耐药即杆菌肽敏感实验阴性，用-表示。结果表明同时具有杆菌肽实验阳性和乙型溶血特征的菌株为A、C、G 群溶血性链球菌。
权利要求
1.用于检测溶血性链球菌全族群的荧光PCR引物和探针，其特征在于引物和探针的核苷酸序列为引物 Pl :5’ -GCTACTAGTGTAGCTGAAACAA-3’ ； 引物 P2 :5’ -AGCAACAAGTAGTACAGCAGCA-3’ ； 探针5，-AAACAACTCAAGTTGCTCCTGGAGG-3，； 该探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。
2.根据权利要求1所述的用于检测溶血性链球菌全族群的荧光PCR引物和探针，其特征在于所述荧光报告基团选自FAM、HEX、TET或JOE ；所述荧光淬灭基团为TAMRA。
3.根据权利要求1所述的用于检测溶血性链球菌全族群的荧光PCR引物和探针，其特征在于所述荧光报告基团选自FAM、HEX、ΤΕΤ、JOE、CY3、CY5、ROX, TAMRA或Texas Red ；所述荧光淬灭基团为BHQ。
4.根据权利要求1所述的用于检测溶血性链球菌全族群的荧光PCR引物和探针，其特征在于所述荧光报告基团选自FAM、HEX、ΤΕΤ、JOE、TAMRA或ROX ；所述荧光淬灭基团为 ECLIPSE。
5.一种用于检测溶血性链球菌全族群的荧光PCR检测方法，其特征在于包括如下步骤A)DNA模板的制备；B)配制含有如权利要求1至4中任一项所述引物和探针的反应体系，对DNA模板进行 PCR扩增，运行条件为95°C 3min ；95°C 15s,60°C 34s，40个循环，每个循环结束后收集荧光信号；C)反应结束后，读取并记录扩增循环数(Ct)，根据扩增循环数进行检测结果的判断。
全文摘要
本发明涉及用于检测溶血性链球菌全族群的荧光PCR引物、探针及方法，属于检验检疫领域。本发明以A、C、G群溶血性链球菌的溶血素S为靶基因位点，设计荧光PCR引物及探针，建立了用于检测溶血性链球菌全族群的荧光PCR检测方法。本发明主要应用于溶血性链球菌的检测。
文档编号C12Q1/14GK102226215SQ201110131978
公开日2011年10月26日 申请日期2011年5月20日 优先权日2011年5月20日
发明者严琼英, 兰全学, 李意, 杨国武, 林霖, 祝仁发, 赖心田, 陈国培, 陈血建 申请人:深圳市计量质量检测研究院