专利名称：COL1A2基因中与中国人群腰椎和髋部骨表型关联的MspI分子标记的制作方法
技术领域：
本发明公开了COL1A2基因中与中国人群腰椎和髋部骨表型(骨密度、骨矿含量、骨大小)关联的MspI分子标记，可用于中国人群骨质疏松症临床早期诊断。
背景技术：
骨质疏松症是以低骨密度和骨组织微细结构退化为特征，导致骨脆性增加，易发生骨折的一种疾病，多发生在髋骨、腰椎骨和腕骨，特别是在绝经后的妇女中。骨质疏松症已成为一种大众健康问题，根据美国NOF(National Osteoprosis Fundation)2002年报导，1995年美国为此投入的费用超过140亿美元。到2020年，此费用将上升到300亿美元。随着中国人口的老龄化，2050年60岁以上的老人将达4亿，骨质疏松症将危及数亿老年人的健康。因此，开展骨质疏松症的研究极其紧迫。
骨表型主要包括骨密度、骨矿含量和骨大小等。它们是骨质疏松性骨折的危险因子，三者均受遗传因素的影响，因此被广泛地当做替代表型用来开展骨质疏松症的遗传学研究，用来寻找骨质疏松症的易患基因。
I型胶原a2多肽链是骨基质中不可缺少的成份，对骨的生成和构建有重要作用。并且已有研究表明COL1A2基因内的突变可引起骨遗传病如成骨不全等，可见该基因与骨组织的生长发育有密切关系。
COL1A2基因全长36kb，位于7q21.3-22.1，由52个外显子组成。COL1A2基因中有很多多态性位点已被鉴定出来，包括EcoRI、RsaI、MspI、PvuII、Bg1II等限制性片段长度多态性位点和(CA)n、(GT)n、(ACT)n等微卫星多态性位点。MspI多态性位点具有较高的杂合性，我们选取该标记位点来研究该基因与骨表型的关系。
与其它方法相比，传递不平衡检测法具有以下特点关联分析易产生假阳性结果；连锁分析不能进行精确定位；传递不平衡检测是近来发展的一种统计力较强的定位方法，且不易受群体分层和混杂的影响，特别适合检测候选基因。
发明内容
本发明的目的是在中国人群中运用传递不平衡检测法，检测与中国人群骨表型关联的COL1A2基因分子标记。
本发明的技术解决方案COL1A2基因中与中国人群的骨表型(骨密度、骨矿含量和骨大小)关联的Msp1分子标记是通过传递不平衡检测法获得的。
(1)采样约400个以上中国人群核心家庭1200个以上个体，核心家庭包含父、母及至少1个健康女儿(2)采用骨密度仪测量骨表型，并记录样本身高、体重、年龄、性别等信息(3)提取受试者的外周血DNA，采用PCR-RFLP方法对COL1A2基因MspI分子标记进行基因分型(4)应用QTDT程序进行关联和连锁检测，获得COL1A2基因中与中国人群腰椎和髋部骨表型(骨密度、骨矿含量和骨大小)关联的MspI分子标记。
具体实施例方式样本收集收集407个中国人群核心家系(父母和至少一个健康女儿)共1280个样本，采用骨密度仪测量骨表型(骨密度、骨矿含量、骨大小)并记录身高、体重、年龄、性别等信息。
基因分型提取各受试者的外周血DNA，采用PCR-RFLP方法对COL1A2基因内的MspI标记位点进行基因分型。所用引物序列5’-TGTAAGTTTGTGAATACCAGT-3’和5’-CATCAACTTCATAGTCCTTGG-3’。基因组DNA(0.1-0.3ug)在25ul终体积的混合物中扩增，其中包括0.2mMdNTP，用PE9700热循环仪进行PCR反应，反应条件a)95℃，3分钟；b)30个循环，93℃，0.5分钟，55℃，1.5分钟，70℃，1分钟；c)70℃，6分钟。扩增后，PCR产物用MspI限制性内切酶酶切，在加溴化乙啶的3％的琼脂糖凝胶电泳。
利用QTDT和SAS统计学软件包对骨表型和基因型数据进行分析腰椎和髋部骨表型用协变量年龄、身高、体重进行校正调节，由于子女均为女性，不存在性别差异，因此未用性别进行调整。
分析结果检测到了显著的家庭内关联包括腰椎骨密度(p＝0.0054)和骨大小(p＝0.00483)；转子骨密度(p＝0.0037)，股骨颈骨矿含量(p＝0.0568)，转子间区的骨矿含量(p＝0.0054)和骨大小(p＝0.0241)。
该研究第一次在中国人群中对COL1A2基因与骨表型的关系进行研究，并采用TDT法得到了与中国人群腰椎与髋骨表型关联的阳性结果。
本发明的价值与意义本发明采用传递不平衡检测方法在中国人群核心家庭中检测了COL1A2基因与骨表型(骨密度、骨矿含量、骨大小)关联的MspI分子标记，为克隆该数量性状位点并对其进行功能研究从而最终揭示COL1A2基因的作用机制打下了良好的基础。本发明的成果可应用于分子标记从人的早年时期来诊断哪些人可能患有骨质疏松症，以便对其采取早期预防及治疗；这一发明成果也可为进一步基因治疗骨质疏松症提供分子遗传学依据。本发明有助于更深一步了解骨质疏松症的发病机制，对治疗和预防骨质疏松症，降低由骨质疏松引起的骨折风险，提高中国人群的健康和身体素质具有重要的实际意义。
权利要求
1.COL1A2基因中与中国人群腰椎和髋部骨表型(骨密度、骨矿含量和骨大小)关联的MspI分子标记，该分子标记与中国人群腰椎和髋部骨表型关联是通过传递不平衡检测法检测获得的。(1)采样约400个以上中国人群核心家庭1200个以上个体，核心家庭包含父、母及至少1个健康女儿(2)采用骨密度仪测量骨表型，并记录样本身高、体重、年龄、性别等信息(3)提取受试者的外周血DNA，采用PCR-RFLP方法对COL1A2基因MspI分子标记进行基因分型(4)应用QTDT程序进行关联和连锁检测，获得COL1A2基因中与中国人群腰椎和髋部骨表型(骨密度、骨矿含量和骨大小)关联的MspI分子标记。
全文摘要
本发明COL1A2基因中与中国人群腰椎和髋部骨表型(骨密度、骨矿含量和骨大小)关联的MspI分子标记，对于中国人群中早期诊断、治疗、预防骨质疏松症有重要意义，它是通过选取400个以上中国人群核心家庭、1200个以上男、女个体人实例，运用传递不平衡检测法在骨密度候选基因COL1A2基因中检测得到的。本发明的意义在于本发明的成果可应用该分子标记从人的早年时期来诊断哪些人可能患有骨质疏松症，以便对其采取早期预防及治疗；本发明有助于深一步了解骨质疏松症的发病机制，对治疗和预防骨质疏松症，降低由骨质疏松引起的骨折风险，提高中国人群健康和身体素质具有重要的实际意义。
文档编号C12Q1/68GK1439725SQ03118228
公开日2003年9月3日 申请日期2003年4月1日 优先权日2003年4月1日
发明者邓红文, 邓飞艳, 刘曼缓, 李淼新 申请人:邓红文