快速感应损伤性刺激且高效表达的一种植物基因启动子的制作方法

专利名称：快速感应损伤性刺激且高效表达的一种植物基因启动子的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种快速感应损伤性刺激且高效表达的植物基因启动子的DNA序列及其应用途径，属于植物基因工程领域。具体地说，经过损伤性诱导处理的水稻可以产生一种Bowman-Birk蛋白酶抑制剂基因的快速表达，利用该表达基因的序列可以从水稻中分离这种快速感应损伤性刺激且高效表达的水稻基因启动子的DNA序列，本发明还包括在该启动子的基础上可以衍生一系列具有启动子活性的DNA片段或组合，以及利用它们嵌合目的基因的抗虫、抗病或抗逆境伤害的抗性基因工程和分子育种途径。
背景技术：
水稻是世界上的最重要农作物之一。由于稻米具有高营养、可调理人体机能且多样化的特点，水稻已成为当今最受重视的禾谷类粮食。因此如何改进稻米的品质，提高水稻的抗病虫害能力，增加稻米产量等已经成为育种学家和植物病理学家研究的共同课题。水稻在生长过程中要经受多种病虫害的威胁我国1991年仅由于稻飞虱的大发生一项就造成稻谷损失约166万吨；此外以稻瘟病为代表的病害造成水稻减产可高达30％(Baker BP.，等，Science，1997，276736～728)。因此要使稻米达到高产和稳产就必须控制水稻病虫害。
众所周知，植物定植后位置是固定的，表现出其一生“被动”的适应环境，且无法逃逸侵害的状况。为此长期以来植物排除病虫等有害因子的主要方式是依靠人力的帮助，如使用农药等。但是农药的使用能够造成非靶标生物因素的伤害，特别是有益生物的误伤，以及带来环境污染等不良的后果，因此人们更注重从生物本身寻找有效的方法和途径进行病虫害的防治。实际上，植物的“被动”只是表面现象，植物的长期进化过程中形成了类似动物逃逸的保护机制一防卫反应，只是不同植物之间，植物个体之间存在差异。作物育种就是根据其差异选择优良的品种或通过杂交集中优良性状于一身的选育方法。勿容置疑传统的抗病虫育种措施给作物高产稳产作出了一定贡献，而且在一段时期内仍将起着重要作用。但也日渐暴露出其脆弱的一面，如周期长，持效短且抗性多为垂直抗性，因而会造成选择压力，促进病原菌或害虫的加速进化和优势小种的出现。随着分子生物学的发展，分子育种为传统育种注入了新的活力，从1983年第一例转基因植物出现，现在通过转基因的分子育种正日趋成熟。
实现植物广谱和持久抗病虫害一直是人们追求的理想目标利用分子育种手段，可以使这一目标的实现成为现实。孟山都公司将CaMV35s启动子驱动的Bt基因导入棉花，实现了棉花对棉铃虫等昆虫的有效控制。此外，抗病方面也有成功试验的报道，如用CaMV35s或其他组成型启动子驱动抗病或防卫基因表达对植物病原的有效控制(Anne Simon Moffat，Science，2001，2922270～2273)。但值得注意的是CaMV35s是组成型表达的启动子，在植物存活期内的长期表达不仅给致害生物因子可以造成强大的选择压力，而且对植物本身也可能造成生理影响(Aulbert SH.等，Annu.Rev.Phytopathol，2001，39285～312)。因此，理想的抗病策略应该是植物只有在受到病虫等因素危害时快速产生抗性物质或自身的保护物质从而使植物免受损害。Peng(Integrated ResourceManagement for Sustainable Agriculture，Ed.by Shi and Cheng.Beijing Agricultural University Press，1994，PP 450～453)设想利用诱导性表达基因的启动子嵌合抗性基因，转化植物从而达到广谱持效抗性的目的。很明显要实现这一设想，必须具备两个条件一是有可供选用的抗性基因，一是应该有侵害诱导性启动子。目前，有关抗性，防卫或信号传导等方面的基因报道较多，这为有效的进行抗病虫分子育种提供了丰富的目的基因材料，但侵害诱导性启动子，特别是能有效用于广谱抗病虫目的的且病虫侵害非特异诱导表达的启动子较少。本发明提供了一种从水稻中克隆的一段DNA序列，具有损伤性侵害的诱导表达的启动子活性一方面具有受稻瘟菌等病原菌的非特异侵害诱导表达的特点，因而可以用来抗病；另一方面由于具有伤害等损伤性刺激后的快速表达特点，而且依据害虫取食植物造成的损伤和其它伤害性损伤都是非特异性的特点(AndréKessler和Ian T.Baldwin，2002，Annu.Rev.Plant Biol.53299～328)，所以还可以用来作为抗害虫的启动子。

发明内容
本发明提供了一种快速感应损伤性刺激且高效表达的植物基因启动子，该启动子为从水稻中分离获得，具有稻瘟菌浸染诱导性的特点，属于水稻Bowman-Birk蛋白酶抑制剂基因的上游调控序列，为SEQ ID NO1所示的核苷酸序列；当该启动子或其衍生变体重新导入水稻中时能够感应损伤性刺激，并启动其下游嵌合基因的表达。该启动子或其衍生变体中，针对驱动报告基因GUS的表达活性，PIPA具有最强的表达特点。
本发明同时提供了获得启动子衍生变体的途径和分析启动子活性区段的过程，通过启动子衍生变体驱动GUS表达活性的特点可以找到启动子的功能性区段。
本发明还提供了广谱持久抗病虫的双元表达载体，利用该表达载体可以嵌合使用者感兴趣的目的基因用于抗病虫害。
根据本发明的内容，目的在于提供广谱持久抗病虫害的育种途径，具体的说是利用本发明的广谱持久抗病虫的双元表达载体，用农杆菌介导法将嵌合基因导入植物中。
以下内容将对本发明中的常用术语进行解释，并结合附图更详细说明实施方案本发明中的术语“分离”为从自然存在的水稻中通过某手段独立获取。本发明中的获取手段为首先通过差异显示PCR法(DDRT-PCR)找到稻瘟菌侵染诱导表达的条带，以差异条带为探针筛选水稻cDNA文库，对阳性克隆序列分析，最后以此为探针筛选水稻基因组文库，获取差异基因的上游DNA调控序列。
本发明中的启动子区域或5′端调控序列指的是从转录起始位点 开始(记为1)其上游的部分。UTR部分为从A开始，延伸到下游翻译起始位点 之间的部分，这一部分序列的部分碱基或数目的非本质变化对启动子活性的改变不明显。这一部分序列为 TCACAAGCACCCACACCAACCAAAG 本发明中的启动子活性检测以报告基因GUS的表达为依据，通过构建启动子嵌合GUS的双元表达载体，并使之在水稻中的表达实现。本发明采用Jefferson等(EMBOJ.，1987，63901～3907)的方法，并稍加改进。
本发明中的快速感应损伤性刺激且高效表达目的基因的双元载体，为在pCAMBIA301(Jefferson教授提供)的基础上改造得到的。“损伤性刺激”指造成水稻叶片破坏的影响方式(如本发明实施中的接种稻瘟菌后的破坏，刀痕损伤等)。“目的基因”为使用者将要选用的抗性方面的基因，可以是基因组中得到的DNA序列，也可以是cDNA序列，一切都根据使用者的目的意图而定。构建双元载体和选用目的基因都是分子生物学的常用的方法，可参考Maniatis等(分子克隆实验指南，第二版，冷泉港实验室，1990)或Sambrook等(分子克隆实验指南，1989)等文献的相关内容进行操作。
本发明中启动子活性的验证是在水稻转化系统中进行的，所用方法为农杆菌介导的方法。当然也不排除其他方法如原生质体融合法、基因枪法轰击法、电激法、PEG法、叶盘法等(Horsch等，Science，1984，234496；Barton等，Cell，1983，321033)。
本发明中的启动子在转基因植株苗期有整株的、系统性、组成型表达现象，这可能对幼小植株更好的抵御损伤性侵害和健康生长发育有利。
本发明的一个主要目的是提供快速感应损伤性刺激且高效表达目的基因的一种植物基因启动子和该启动子驱动的双元表达载体，而本发明中的序列都可用做摸板或探针实施该序列的再次分离，当然也是本发明的保护范围。
根据以上的内容，该启动子可能具有广谱持效的抗病虫基因工程的应用潜力。
以下附图是为了更清楚和形象的说明本发明来由


附图1，接种稻瘟菌不同时间后水稻转录Bowman-Birk蛋白酶抑制剂的时间动态示意图(Northern分析)。图示说明0、4、8、12、36为接种时间，单位为小时(h)。
附图2，健康水稻叶片与接种稻瘟菌后水稻叶片的Bowman-Birk蛋白酶抑制剂基因表达的DD-PCR结果。图示说明泳道H和S分别指代以健康和接种稻瘟菌后水稻叶片为材料的结果，箭头所指为差异条带位置。
附图3，快速感应损伤性刺激且高效表达目的基因的双元载体示意图。图示说明“KAN”为抗卡那霉素基因；“HYG”为抗潮霉素基因；“pBR322ori”为复制起始位点；“LB”和“RB”分别是左右边界；MCS(Mul-Clone-Sites)为多克隆位点；Nos-T(Nos PolyA-T)为终止子；IG(Insert Gene)为插入的目的基因。
附图4，PIPA、PIPH、PIPX驱动GUS在水稻叶片中表达的组织染色和荧光分析。每一结构中的处理从左至右依次为水，刀具损伤，接种稻瘟菌等处理。上部分为GUS荧光分析柱状图，纵轴为GUS表达量，单位是4-MU nmol/min/mg total proteins；下部分为GUS的组织染色照片，PIPW为去掉35s启动子的pCAMBIA1301的载体，PIPK为原始的pCAMBIA1301的载体。
具体实施方案以下实施例只是作为事例说明发明人的实施过程，并不限制本发明的实施范围，也不排除使用者可使用其它有效的方案。
实施例1稻瘟菌侵染诱导的水稻Bowman-Birk蛋白酶抑制剂基因5′端上游调控片段的克隆及其衍生变体的获得活体接种稻瘟菌于4叶抽出时的爱知旭品种水稻，36小时取发病叶片，立即液氮冷冻后保存；同时，取未接种的健康植株叶片作为对照，同样方法保存备用。分别获取纯净的总RNA，用SuperscripII Kit合成cDNA，用作PCR扩增的模板。扩增产物经聚丙烯电泳后可以压膜并放射自显影(附图2)，然后切取在接种叶片中的差异表达cDNA条带，经二次PCR扩增后回收并克隆到T-easy载体上，测序结果在Gen Bank数据库中作BLAST处理，推测为一种水稻Bowman-Birk蛋白酶抑制剂基因的部分片段(SEQID NO2)。以此cDNA为模板合成探针，筛选水稻基因组文库。经亚克隆，酶切鉴定以及测序确认，克隆获得了5′端上游大约2000bp的DNA片段。
序列同源性比较由软件DNASTAR完成，启动子区域的TATA盒及转录启始位点由软件推定，上游顺式元件检索在TRANSFAC数据库中的植物基因顺式元件范围进行(http//transfac.gbf.de/cgi-bin/mat Search/matesearch.pl)，由MatInspector V2.2软件对比顺式元件的核心序列(coresequence)及其两侧的序列，通过矩阵运算得到相似性数据。本发明检索参数的设置为核心序列相似性为1.0，即查询序列与已知顺式元件的核心序列一致；矩阵运算相似性(matrix similarity)为0.9 0，即核心序列两侧的序列在0.90水平上与已知顺式元件相似(该参数最大值为1.00)。启动子区域检索所得的顺式元件应满足以上参数设置。基于以上分析，在这些位置之前找合适酶切位点酶切获得其衍生变体。
实施例2
稻瘟菌侵染诱导的水稻Bowman-Birk蛋白酶抑制剂基因5′端上游调控片段与GUS基因嵌合的双元载体的构建以克隆在T-easy载体上的预测的调控片段为摸板，用以下一对引物(阴影部分是添加的酶切位点)进行PCR扩增，回收扩5-ACT GGGTGATACCCGTA-3(SalI)5-AAT TTGGTGTGGGTGCT-3(NcoI)增片段并用SalI，NcoI双酶切6小时，加入3倍体积的无水乙醇后快速在冰上沉淀10分钟，然后将4度低温下13000g离心10分钟后的沉淀用双蒸水溶解并与用同样酶切的pCAMBIA1301剩余载体连接(用T4连接酶)，取一定量连接产物电击法导入XLI-Blue大肠杆菌中，酶切鉴定后并测序确认。该载体记为PIPA(所有含有该载体的宿主也以此记，其它同)。
在载体PIPA的基础上，用HpaI和SmaI酶切，然后回收剩余载体自连后按上述同样方法导入大肠杆菌，并测序确认。所得载体记为PIPH。PIPX的获得同样以PIPA为基础，用XbaI酶切，然后回收剩余载体自连，测序确认正确性。
实施例3稻瘟菌侵染诱导型水稻蛋白酶抑制剂基因启动子活性分析分别将上述双元载体质粒DNA用电激法导入EHA105感受态细胞，并确认转化的正确性。然后用根癌农杆菌介导的方法转化水稻，进行启动子活性分析。具体做法是准备水稻未成熟种子，经表面消毒后挤出水稻幼胚置于固体诱导培养基(NB)上，暗培养诱导愈伤组织。一定时间剥下愈伤组织，转入新鲜配制的继代培养基(NB)上，在相同条件下继代培养相同时间。挑选状态较好的愈伤组织与适量农杆菌悬浮液(OD 0.3-0.5)在液体共培养基上共培养20分钟，转入固体共培养基上，26℃黑暗培养3天。然后转放在含有50mg/l潮霉素的筛选培养基上，26℃暗培养14天，已后再在相同的筛选培养基上继续筛选至长出抗性愈伤组织。挑选乳黄色致密的抗性愈伤组织转至含有50mg/L潮霉素的分化培养基上，先暗培养3天，然后转至15h/d光照条件下培养，直至分化并长出小苗。将小苗移到生根培养基上复壮后移栽到温室内。10天左右即作为转基因材料供启动子活性分析。
启动子活性的分析以GUS的表达活性为标准。GUS活性的检测采用组织染色法和荧光定量法(Jefferson，EMBOJ.，1987，63901～3907)。选取一定数目且株形一致的独立转基因植株分别用接种稻瘟菌、金属刀具划伤，对照处理为喷布蒸馏水。稻瘟菌孢子悬浮液制备和接种按Peng(Can.J.Bot.1988，66730-735)的方法。取材时间均在处理后12小时进行，材料一部分用于GUS组织染色，另一部分用于GUS的荧光定量。结果显示(见附图4)稻瘟菌或刀具划伤等处理12小时后，转PIPA、PIPH、PIPX三结构的水稻同对照比较都具表达GUS活性的特点，其中PIPA的启动子活性最高，不仅具有较高的稻瘟菌侵染诱导活性，而且其对损伤(刀具划伤)特别敏感，表达量大约是CaMV35s启动子的3倍。此处需要补充说明的是，接种和损伤处理要受处理强度、范围和时间长度的限制，只是局部的和一定时间的表达，根据该蛋白酶抑制剂基因转录RNA的时间动态(Northern分析，附图1)结果可以推测，稻瘟菌诱导36小时后GUS的表达量要远远高于12小时的表达。PIPA受稻瘟菌侵染和损伤诱导高效表达的特点说明其可能作为抗虫害与病害的理想启动子。PIPH、PIPX因缺失了部分片段，而降低了表达活性，说明缺失部分可能含有与损伤刺激相关调控元件。
实施例4快速感应损伤性刺激且高效表达目的基因的双元载体构建可以按以下路线，在PIPA双元载体的基础上进行。将PIPA质粒用BstEII酶切6小时，然后用T4 DNA polymerase补平，酚仿抽提后溶于双蒸无菌水中用NcoI酶切后即去掉PIPA下游的GUS基因，从而获得可嵌合抗病相关基因的双元载体(线形)。将嵌合的目的基因在5′端可以带有既有的或后来增加的NcoI位点接头，其3′端应该是平滑末端。另外，为了可以嵌合各类基因，可以用BstEII和NeoI双酶切后补平，即将嵌合的基因应不含ATG密码子，并鉴定连入方向(附图3)。
序列表<110>中国农业大学<120>快速感应损伤性刺激且高效表达的一种植物基因启动子<130>PIPA启动子专利申请<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1520<212>DNA<213>Oryza sativa<400>SEQ ID NO1caatacgata cgtcgacgat ccagttctat ccgagaagga ctcttcccat ctgtagattt 60cgtgaaaggt ttccttagga tatgtagaaa acatccgcgt gcgcgtgggt atgccatatc 120gatatgtaac gtatatcgaa gggtagaggg tatgcctgac ccgtaaccct gacacgaacg 180cccaccccta ttcctgcata catccatgca tatatatcag catatcctct tacttctaac 240gtacgttgaa ccatcctcct ctcatgtctc acgtaccgga acacatatgc ttgcacaggt 300atgaacatat gcttgcacag tatgtgaaag ggatacgtac tttctttttt ttctctctcc 360ttccattaca tgaaagattt atacgtaacg cgcgcgaaga tggattctaa tatctcgggt 420agacgtctac cagttttttg catgttaact aaataattat tgaaaaattt caaaaaaact 480ttacaacata gattaatatg taatatatca cttaacaaac atgcaagttc aaattcgact 540tctacaagtt ttaacaaaaa taacaaatta aagtctaact agtatataca tatattcaga 600gtcaaatttg ttatttttgt tacaactagt agaagtcgaa tttgaacttg catgtttgtg 660aagtgatata ctccctccat ctacaaaagt tacacatatt actttttaca tcaagaccaa 720tgagaaatta aatcaccttg gatgttacaa aatcaaagaa tgaatgcaag catgcaacta 780atgagtatct agatgactcc ttgagttcta ataaaacatt tagtttgtct cttcatttaa 840gtcttaaata cataaagatt acaaatagga acaggttatt tggaaaaact caaatgtgaa 900attggtgtaa cttttgtgga tggagggagt attacatatt aacctatcat gccaattttt 960ttgaaaaatt tttataatta tttagataac atgtaagaaa catgtggacg ttcacccgag1020tatttaaaac agtttccgtg tgcgcacaca tataaataca tgcaacacca ccctcatagg1080taaggtaaga atccgaccac caaaaacatg ttaaaaaaaa acaaaaccaa caacaaatct1140ttaatgtcac taaaatcaaa ctactcgagt attattgaaa acatactcga gtacttgtgt1200atgtgtaaat attcgagcgc acctagtttt aaaccacctt gtaatttgtg catagtcaca1260tttgtgtcaa ttaaattcca ctgtgagtat gcatatggaa gaaagcgtca aattaattaa1320tcagcactga tatagtagtg gcaaagccag gaagaaggga atcagagtag acagatgcgt1380ggcaaatggg gcctccacgt gctcttatcc tcatgcaagt cagcatttgt gattgggtag1440tatgggttgc tcgatctttc tataaataat aacgctactc agtactcacc catcacaagc1500acccacacca accaaagatg1520
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1.来源于植物并从中分离的一DNA片段，它属于一种水稻Bowman-Birk蛋白酶抑制剂基因的上游调控序列，具有受损伤性刺激后诱导表达的启动子活性，其最明显的特征是利用该调控序列嵌合目的基因再次导入植物后可以快速感应损伤性刺激信号，并驱动目的基因的高效表达，该启动子序列为SEQ IDNO1的序列。
2.在SEQ ID NO1的基础上可以获得一系列具启动子活性的衍生变体，其特征在于每一衍生变体可以单独或组合起来用于目的基因的启动。
3.根据权利要求1和2的DNA序列，可以对它们进行加工、改造、或碱基的修饰。
4.根据权利要求1、2和3的DNA序列，其特征是包含与损伤性刺激相关的所有核心序列，或核心序列的非本质性的碱基改变或组合。
5.根据权利要求4的内容，损伤性刺激是指植物受到外界的刺激，特别是对植物的正常生长造成一定的影响的因素。
6.根据权利要求5的内容，这些刺激可以是害虫的取食造成的，可以是病原菌侵染造成的，也可以是逆境或其它因素造成的。
7.根据权利要求4的DNA序列，其特征在于该序列与报告基因嵌合后重新导入植物具有受损伤性、病原菌、化学物质诱导的启动子活性。
8.根据权利要求7的DNA序列，其特征在于PIPA的启动子活性高于PIPH和PIPX。
9.根据权利要求8的DNA序列，其特征在于在-1500到1之间包括重要的与损伤性刺激有关的顺式元件。
10.根据权利要求8的DNA序列，PIPA可以直接用于嵌合目的基因进行抗虫、抗病、甚至抗逆境的基因工程。
11.根据权利要求8的DNA序列，PIPA可以用于驱动目的基因的高效表达，从而研究目的基因的表达对植物的影响，而这种表达是可以用损伤性刺激来控制的。
12.根据权利要求6、7、8、9、10、11的序列，可以构建损伤性诱导表达的双元表达载体，其特征是具有启动子活性的上述DNA序列驱动目的基因的转录和表达。
13.根据权利要求12的序列，双元载体中的目的基因是可以用于抗虫的目的基因。
14.根据权利要求12的序列，双元载体中的目的基因是可以用于抗病的目的基因。
15.用含有权利要求12所述双元表达载体的农杆菌可以介导植物的转化。
16.根据权利要求13、14、15， 一种含有转基因的植物或细胞。
全文摘要
来源于水稻的一种基因启动子，具有快速感应外界损伤性刺激，并驱动其下游基因高效表达的特点；利用该启动子嵌合目的基因可以用于植物抗病、虫害的基因工程，也可用于植物逆境条件下的抗性基因工程。
文档编号C12N15/82GK1513990SQ0313105
公开日2004年7月21日 申请日期2003年5月16日 优先权日2003年5月16日
发明者彭友良, 张世宏, 范军, 孙宗修 申请人:中国农业大学