专利名称：含有转白细胞介素-23基因的肿瘤细胞的制备方法及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于一种用于治疗恶性肿瘤的转基因肿瘤细胞的制备方法，特别涉及一种转白细胞介素-23基因的肿瘤细胞的制备方法。
背景技术：
目前，肿瘤的主要治疗手段包括手术切除、放射治疗和化学药物治疗，这些治疗方法对机体均有一定副作用，不具有长期改善预后的效果，如化学药物治疗及放射治疗常可抑制骨髓造血和机体免疫功能，导致易发感染和抗肿瘤免疫应答能力低下；手术创伤也可抑制机体的各种免疫功能，还有使微小转移灶扩大的危险。直接用细胞因子治疗肿瘤已取得了一定的疗效，但是，细胞因子在体内的半衰期较短，在血中很难维持一定的浓度，且投入量过大又有较强的副作用，所以，严格限制向体内直接投入重组细胞因子。同时，体外培养的免疫细胞也可用于肿瘤治疗，但往往不能达到预期结果。
最近，由树突状细胞分泌的新的细胞因子白细胞介素-23(IL-23)被鉴定，白细胞介素-23由p19和p40两个亚单位分子组成，白细胞介素-23与白细胞介素-12(由p35和p40两个亚单位分子组成)共有一个p40分子，p19亚单位与p35亚单位的氨基酸序列也有较高的同源性，构造也十分相似。用白细胞介素-12、白细胞介素-2、IFN-α、IFN-γ、TFN-α等重组细胞因子治疗肿瘤，都显示出一定的疗效，但是尚处于临床试验阶段，还没有取得临床疗效的结果。
发明内容
本发明的目的在于提供可用于治疗恶性肿瘤的含有转白细胞介素-23基因的肿瘤细胞的制备方法，以克服现有技术存在的不足。
含有转白细胞介素-23基因的肿瘤细胞的制备方法是利用载体将白细胞介素-23导入肿瘤细胞。
本发明的具体技术方案是载体选用病毒或脂质体。
脂质体选用lipofectin脂质体。
以病毒为载体将白细胞介素-23导入肿瘤细胞包括以下步骤(1)采用异硫氢酸胍一步法从小鼠脾细胞中提取组织总RNA；
(2)将通过反转录聚合酶链反应法获得小鼠白细胞介素-23p19和p40cDNA，将获得的cDNA插入TA Cloning试剂盒中的Pcr2.1载体，并行聚合酶链反应后用DNA测序仪进行测序验证cDNA的正确性；将验证序列后的cDNA用限制性核酸内切酶和DNA连接酶将其插入病毒载体；(3)利用试剂盒将步骤(2)获得的病毒载体导入包装细胞，该包装细胞能将病毒载体包装成完整的病毒并将其分泌到培养上清中；(4)收集步骤(3)培养上清，假如60％-70％融合生长PA317细胞的培养皿中，加入四聚季胺(终极浓度为8μg/ml)；37℃培养5-6小时后弃去上清，加入新鲜培养基继续培养24小时，收集并调整细胞浓度为1×106个/毫升，以10倍，100倍，1000倍，10000倍稀释培养基后，加入培养皿中继续培养并加入新霉素(终极浓度为600μg/ml)进行筛选，待单个细胞长成克隆，分别以37℃、5％CO2和相同细胞浓度培养各个克隆细胞并收集培养上清，以RNA印迹法鉴定白细胞介素-23基因转染是否成功及表达量的高低，选择高表达白细胞介素-23的PA317细胞的培养上清，以相同方法感染结肠癌细胞，选择高表达白细胞介素-23的结肠癌细胞，建立结肠癌细胞/白细胞介素-23的克隆肿瘤细胞。
所述的限制性核酸内切酶选用Ecol RI和Bam HI。
试剂盒选用lipofectamine试剂盒。
包装细胞选用Φ-2包装细胞。
培养基选用含10％胎牛血清，100单位/毫升青链霉素的RPMI1640或DMEM培养基。
该肿瘤细胞的用途是将其接种于荷瘤机体治疗恶性肿瘤。
具体接种方法为将0.2毫升含白细胞介素-23基因的肿瘤细胞(1×107个/毫升)直接接种于荷瘤小鼠皮下或肿瘤组织局部。
本发明取得的技术进步在于本发明不同于其他治疗使用的细胞因子，白细胞介素-23主要作用于免疫应答初期，活化树突状细胞以诱导自然杀伤细胞的活化。将白细胞介素-23基因导入细胞通过产生白细胞介素-23发挥较强的抗肿瘤效果，而且白细胞介素-23可诱导记忆性T细胞增殖与活化，分泌IFN-γ，调节免疫功能、抑制肿瘤部位血管的生成，达到治疗肿瘤效果。实际上是伴随着树突状细胞的活化产生肿瘤特异性获得性免疫应答反应，而且在T细胞缺乏的裸鼠，投入含白细胞介素-23基因的肿瘤细胞后也显示了显著的抗肿瘤效果。
图1 CD40配体刺激树突状细胞分泌白细胞介素-23 p40亚单位示意图。
图2 CD40配体刺激树突状细胞表达细胞因子示意图。
图3活化的树突状细胞白细胞介素-23 p19和p35亚单位表达的比较示意图。
图4白细胞介素-23基因插入的结肠癌细胞其细胞白细胞介素-23 p19和p35亚单位表达的比较示意图。
图5插入白细胞介素-23基因的结肠癌细胞的抗肿瘤效果示意图。
图6插入白细胞介素-23基因的结肠癌细胞的抗肿瘤效果(2)示意图。
图7插入白细胞介素-23基因的结肠癌细胞的抗肿瘤效果(3)示意图。
图8插入白细胞介素-23基因的结肠癌细胞的抗肿瘤效果(4)示意图。
图9拒绝白细胞介素-23基因插入结肠癌细胞的小鼠脾细胞IFN-γ产生示意图。
图10插入白细胞介素-23基因的结肠癌细胞在裸鼠中的抗肿瘤效果示意图。
图11插入白细胞介素-23基因的AcPC-1细胞其白细胞介素-23 p19、p40亚单位分子的基因表达示意图。
图12插入白细胞介素-23基因的AcPC-1细胞接种裸鼠后的抗肿瘤效果示意图。
图13插入白细胞介素-23基因的AcPC-1细胞接种SCID小鼠后的抗肿瘤效果示意图。
图14裸鼠脾细胞的细胞杀伤活性示意图。
具体实施例方式
以下结合附图对本发明的实施例做进一步描述本实施例的整体构思如下所述的载体选用逆转录病毒。
利用逆转录病毒为载体将白细胞介素-23导入肿瘤细胞包括以下步骤(1)采用异硫氢酸胍一步法从小鼠脾细胞中提取组织总RNA；(2)将通过逆转录聚合酶链反应法获得小鼠白细胞介素-23p19和p40cDNA，将获得的cDNA插入TA Cloning试剂盒中的Pcr2.1载体，并行聚合酶链反应后用DNA测序仪进行测序验证cDNA的正确性；将验证序列后的cDNA用限制性核酸内切酶和DNA连接酶将其插入病毒载体；(3)利用试剂盒(美国invitrogen公司产品)将步骤(2)获得的病毒载体导入包装细胞，该包装细胞能将病毒载体包装成完整的病毒并将其分泌到培养上清中；(4)收集步骤(3)培养上清，加入65％融合生长PA317细胞的培养皿中，加入四聚季胺(终极浓度8μg/ml，sigma公司产品)；37℃培养5.5小时后弃去上清，加入新鲜培养基继续培养24小时，收集并调整细胞浓度为1×106个/毫升，以10倍，100倍，1000倍，10000倍稀释培养基后，加入培养皿中继续培养并加入新霉素(终极浓度为600μg/ml)进行筛选，待单个细胞长成克隆，分别以37℃、5％CO2和相同细胞浓度培养各个克隆细胞并收集培养上清，以RNA印迹法鉴定转染是否成功及表达量的高低，选择高表达白细胞介素-23的PA317细胞的培养上清，以相同方法感染结肠癌细胞，选择高表达白细胞介素-23的结肠癌细胞，建立结肠癌细胞/白细胞介素-23的第1、4、9、12号克隆肿瘤细胞。
所述的限制性核酸内切酶选用Ecol RI和Bam HI。
试剂盒选用lipofectamine试剂盒(Invitrogen公司产品)。
包装细胞选用φ-2包装细胞(购自美国菌种管理保存中心，AmericanType Culture Collection.ATCC)。
培养基选用含10％胎牛血清，100单位/毫升青链霉素的RPMI1640或DMEM培养基(美国GIBCO公司产品)。
1、活化树突状细胞应用抗体将小鼠骨髓中的T细胞、B细胞和单核细胞去除后，粘附于培养皿的细胞中加入白细胞介素-4和GM-CSF(各20ng/ml)，培养10天，诱导树突状细胞产生，通过流式细胞仪测定分析MHC II类分子、CD86等细胞活化标志物均呈弱阳性，即为未成熟的树突状细胞。将该细胞加于24孔板(6×105/孔)培养，加入CD40配体基因导入的肺癌细胞株(A11/CD40L)(2×105/孔)，经24小时共同培养后，树突状细胞的CD86等标记物表达增强，表明被活化。用ELISA法检测培养上清中的p40亚单位分子有较高水平的表达；对照组与Fas配体基因导入的A11细胞(A11/FasL)共培养的培养上清中的p40检测为阴性(图1)。用RT-PCR法对这些细胞中基因表达进行了检测，白细胞介素-23的亚单位p19和白细胞介素-12的亚单位p35的RNA表达被检出(图2)。将RNA作成cDNA，稀释后用RT-PCR定量检测，白细胞介素-23p19的表达量与白细胞介素-12p35的表达量相比显著增高(图3)，提示在抗肿瘤的效应细胞诱导初期，作为必须条件的树突状细胞活化中，与白细胞介素-12相比，白细胞介素-23的分泌量明显增多，显示白细胞介素-23在抗肿瘤作用更重要。
白细胞介素-23基因导入细胞的建立从BALB/C小鼠脾细胞中，通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法分离p19和p40cDNA，在Ecol RI和Bam HI作用下插入腺病毒载体LXSN(Miller AD，Rosman GJ，Bi oTechniques.7；980-990，1989)的internal ribosomal entrysite(IRES)(Duke Gmetal，Jvirol 661602-1609；1992)。在5’LTR下游按p19-IRES-p40顺序排列基因，在5’LTR作用下p19和p40DNA共同复制，尔后在lipofectine(Invit rogen公司产品)存在下，导入Φ2包装细胞(Americar Type Culture Collect ion，ATCC)，用新霉素(400ng/ml，Aldrich公司)存在下，进一步导入PA317细胞(ATCC)，再经新霉素选择后，PA317细胞的培养上清中有包装成含白细胞介素-23基因的逆转录病毒。将该病毒感染结肠癌细胞，筛选高表达白细胞介素-23基因的克隆，树立了结肠癌细胞/白细胞介素-23第1、4、9、12号高表达白细胞介素-23的克隆细胞。这些细胞的p19、p35、p40基因的表达(代表高表达克隆的Northern blot结果如图4)，其培养上清中p40分子的分泌量为0.8-1.1ng/ml/1×106细胞/48小时)。而MHCI类分子的H-2K/H-2D表达在野生型及白细胞介素-23表达株之间未见差异；而且两者之间的体外增殖实验也未见差异。
2、白细胞介素-23基因导入细胞的抗肿瘤效果将两克隆(1号和9号)结肠癌细胞/白细胞介素-23细胞接种于同种小鼠(BALB/c)皮下，4-5天后可见较小肿块长出，但肿块很快退缩，最终全部消失(图5)。但插入空载体DNA的结肠癌细胞及未插入任何基因的野生型结肠癌细胞接种小鼠后，4-5天开始形成肿块，而后逐渐增大，最终导致小鼠死亡。其他克隆的(第4号和第12号)白细胞介素-23/结肠癌细胞(5×106)接种小鼠后，显示同样的效果(图6)。另外，结肠癌细胞(1×106个细胞)注射同种小鼠腹腔后，20天内全部死亡。结肠癌细胞/白细胞介素-23第9或第12克隆用同种数量细胞接种小鼠腹腔后，多数小鼠的生存期超过了40天(p＜0.05)。即白细胞介素-23基因导入细胞发挥了显著的抗肿瘤效果。
3、白细胞介素-23基因导入细胞的抗肿瘤效果将结肠癌细胞/白细胞介素-23第9克隆与野生型结肠癌细胞按1∶9比例混合后(细胞总数1×106)，接种同种小鼠皮下，虽然也形成肿瘤，但与单纯接种野生型结肠癌细胞(1×106)相比，生存期显著延长(p＜0.05)(图7)。即白细胞介素-23分泌细胞在肿瘤局部投入后，产生了抗肿瘤效果。
4、白细胞介素-23基因导入细胞的治疗效果同种小鼠腹腔皮下接种野生型结肠癌细胞(1×106个)，另一侧接种结肠癌细胞/白细胞介素-23第9克隆细胞(1×106个)，该小鼠不但拒绝了结肠癌细胞/白细胞介素-23第9克隆细胞，使对侧野生型结肠癌细胞的增殖，与单纯接种结肠癌细胞的小鼠相比，显著减慢(图8)。即白细胞介素-23基因导入细胞投入后对远处存在的肿瘤细胞也能诱导充分的免疫应答，产生治疗效果。
5、白细胞介素-23基因导入细胞接种小鼠后产生肿瘤特异性获得性免疫反应在拒绝了白细胞介素-23基因导入的结肠癌细胞的小鼠，于最初接种肿瘤细胞60天后，再次接种致死量(1×106个)结肠癌细胞后，小鼠不形成肿瘤。我们观察了120天小鼠仍然存活。但是，拒绝了结肠癌细胞/白细胞介素-23肿瘤细胞的小鼠接种致死量(1×106个)同种小鼠由来的其他肿瘤细胞Lmale-1，则形成肿瘤而且大部分小鼠死于肿瘤。即导入肿瘤细胞的白细胞介素-23发挥的免疫应答，是以T细胞为中心的肿瘤特异性获得性免疫应答。
6、白细胞介素-23基因导入细胞接种小鼠后产生IFN--γ接种结肠癌细胞/白细胞介素-23第9号克隆细胞后，肿瘤退缩时，取小鼠脾细胞(1×107/ml)与用50Gy的放射线处理的结肠癌细胞(1×106/ml)共培养24小时，培养上清中的IFN-γ大量产生。但是与放射线处理过的Rlmale-1细胞共同培养后，产生的IFN--γ甚微。未接种肿瘤的小鼠脾细胞与肿瘤细胞共同培养后，未检测到IFN-γ的产生。而且，白细胞介素-23产生细胞接种后，也可诱导产生肿瘤特异性的杀伤细胞。
为确认以上实验，接种结肠癌细胞/白细胞介素-23第9号克隆小鼠的脾细胞用抗asial GM2抗体，抗CD4 T细胞抗体、抗CD8抗体及补体处理后，NK细胞、CD4阳性细胞和CD8阳性细胞被除去后，再次检测了IFN-γ产生(图9)。与放射线处理的结肠癌细胞共培养时，经抗CD8抗体处理的脾细胞，IFN-γ产生显著低下。由此可知，经白细胞介素-23诱导的抗肿瘤效果是由CD8阳性的杀伤细胞引起的。
7、免疫缺陷状态下的白细胞介素-23基因导入细胞的抗肿瘤效果T细胞缺损的BALB/C裸鼠，用结肠癌细胞/白细胞介素-23第9号克隆细胞(1×106/ml个)接种后，有肿瘤形成(图10)。说明白细胞介素-23基因导入的肿瘤细胞抗肿瘤效果是由α/βT细胞参与的。另外，结肠癌细胞/白细胞介素-23第9号克隆肿瘤的增殖，与野生型结肠癌细胞接种的BALB/C裸鼠相比，肿瘤的生长速度明显减慢(p＜0.001，图10)。而且，白细胞介素-23基因导入细胞的抗肿瘤效果在不存在α/βT细胞的免疫缺陷小鼠中也被观察到。
人类胰腺癌细胞(Aspc-1)用白细胞介素-23基因导入细胞的抗肿瘤效果中的方法，树立了白细胞介素-23基因导入的细胞克隆(Aspc-1/白细胞介素-23克隆10号和6号)。这两克隆细胞均表达p19和p40基因(图11)。Aspc-1/白细胞介素-23第10号克隆培养上清中p40分子有较高水平的产生(2mg/ml/5×105/48小时)。用抗p40抗体免疫沉淀测定结果，确认了培养上清中有大量p19+p40复合物(白细胞介素-23)产生。另外，体外实验检测结果显示，MHCI类分子(HLA-A，B，C)的表达，在基因导入细胞与野生型细胞之间未见有较大变化。将这种细胞(1×106)接种BALB/C裸鼠皮下，肿瘤的增殖与接种野生型肿瘤细胞(1×106)相比明显减弱(图12)。Aspc-1/白细胞介素-23第10克隆细胞接种于T、B和NK细胞缺陷的SCID小鼠后，没有观察到抗肿瘤效果(图13)。我们推断抗肿瘤效果是由α/βT细胞和NK T细胞产生的。另外，Aspc-1/白细胞介素-23第10号克隆接种的BALB/C裸鼠的脾细胞(2×107)与经50Gy放射线照射的Aspc-1细胞(2×106)经5天共同培养，与未接种肿瘤细胞的小鼠脾细胞或野生型肿瘤细胞接种小鼠的脾细胞相比，对Aspc-1细胞的杀伤活性显著增高(图14)。同样条件下，24小时培养上清中IFN-γ没有被检出，与经50Gy放射线处理后的人肺癌细胞QG-56共培养上清中IFN-γ的含量较少。而且在α/βT细胞缺失裸鼠中投入白细胞介素-23导入肿瘤细胞后产生了杀伤性T细胞的，即产生了抗肿瘤效果。
权利要求
1.含有转白细胞介素-23基因的肿瘤细胞的制备方法，其特征在于利用载体将白细胞介素-23导入肿瘤细胞。
2.根据权利要求1所述的含有转白细胞介素-23基因的肿瘤细胞的制备方法，其特征在于所述的载体选用病毒或脂质体。
3.根据权利要求2所述的含有转白细胞介素-23基因的肿瘤细胞的制备方法，其特征在于所述的脂质体为选用lipofectin脂质体。
4.根据权利要求1或2所述的含有转白细胞介素-23基因的肿瘤细胞的制备方法，其特征在于以病毒为载体将白细胞介素-23导入肿瘤细胞包括以下步骤(1)采用异硫氢酸胍一步法从小鼠脾细胞中提取组织总RNA；(2)将通过反转录聚合酶链反应法获得小鼠白细胞介素-23p19和p40cDNA，将获得的cDNA插入TA Cloning试剂盒中的Pcr2.1载体，进行插入并行聚合酶链反应后用DNA测序仪进行测序验证cDNA的正确性；将验证序列后的cDNA用限制性核酸内切酶和DNA连接酶将其插入病毒载体；(3)利用试剂盒将步骤(2)获得的病毒载体导入包装细胞，该包装细胞能将病毒载体包装成完整的病毒并将其分泌到培养上清中；(4)收集步骤(3)培养上清，假如60％-70％融合生长PA317细胞的培养皿中，加入四聚季胺(终极浓度为8μg/ml)；37℃培养5-6小时后弃去上清，加入新鲜培养基继续培养24小时，收集并调整细胞浓度为1×106个/毫升，以10倍，100倍，1000倍，10000倍稀释培养基后，加入培养皿中继续培养并加入新霉素(终极浓度为600μg/ml)进行筛选，待单个细胞长成克隆，分别以37℃、5％CO2和相同细胞浓度培养各个克隆细胞并收集培养上清，以RNA印迹法鉴定白细胞介素-23转染是否成功及表达量的高低，选择高表达白细胞介素-23的PA317细胞的培养上清，以相同方法感染结肠癌细胞，选择高表达白细胞介素-23的结肠癌细胞，建立结肠癌细胞/白细胞介素-23的克隆肿瘤细胞。
5.根据权利要求4所述的含有转白细胞介素-23基因的肿瘤细胞的制备方法，其特征在于所述的限制性核酸内切酶选用Ecol RI和Bam HI。
6.根据权利要求4所述的含有转白细胞介素-23基因的肿瘤细胞的制备方法，其特征在于所述的试剂盒选用lipofectamine试剂盒。
7.根据权利要求4所述的含有转白细胞介素-23基因的肿瘤细胞的制备方法，其特征在于所述的包装细胞选用Φ-2包装细胞。
8.根据权利要求1或4所述的含有转白细胞介素-23基因的肿瘤细胞的制备方法，其特征在于所述的培养基选用含10％胎牛血清，100单位/毫升青链霉素的RPMI1640或DMEM培养基。
9.含有转白细胞介素-23基因的肿瘤细胞的用途，其特征在于可将其接种于荷瘤机体治疗恶性肿瘤。
10.根据权利要求8所述的含有白细胞介素-23基因的肿瘤细胞的用途，其特征在于所述的接种方法为将0.2毫升含白细胞介素-23基因的肿瘤细胞(1×107个/毫升)直接接种于荷瘤小鼠皮下或肿瘤组织局部。
全文摘要
本发明属于一种用于治疗恶性肿瘤的转基因肿瘤细胞的制备方法，特别涉及一种含有转白细胞介素－23基因的肿瘤细胞的制备方法。主要利用载体将白细胞介素－23导入肿瘤细胞用于治疗恶性肿瘤。本发明解决了其他肿瘤治疗方法对机体产生的副作用及不具有长期改善预后的效果，如化学药物治疗及放射治疗常可抑制骨髓造血和机体免疫功能，导致易发感染和抗肿瘤免疫应答能力低下；手术创伤也可抑制机体的各种免疫功能，还有使微小转移灶扩大的危险等缺点。具有可主要作用于免疫应答初期，活化树突状细胞以诱导自然杀伤细胞活化的特性。将白细胞介素－23基因导入肿瘤细胞通过产生白细胞介素－23发挥较强的抗肿瘤效果。而且白细胞介素－23可诱导记忆性T细胞增殖与活化，分泌IFN－γ，调节免疫功能、抑制肿瘤部位血管的生成，从而达到治疗恶性肿瘤效果。
文档编号C12N15/88GK1482238SQ03130830
公开日2004年3月17日 申请日期2003年5月8日 优先权日2003年5月8日
发明者田川雅敏, 单保恩 申请人:单保恩