副结核分枝杆菌感染的诊断和疫苗的制作方法

专利名称：副结核分枝杆菌感染的诊断和疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及编码鸟分枝杆菌副结核亚种(Mycobacterium aviumsubspecies paratuberculosis)蛋白的核酸序列，这种核酸序列的一部分，它编码这种蛋白的免疫原性片段，包含这种核酸序列或其一部分的DNA片段、重组DNA分子、活重组载体和宿主细胞。本发明也涉及这种序列编码的鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白及其免疫原性部分。此外，本发明涉及包含这种核酸序列或其一部分、包含这种核酸序列或其一部分的DNA片段、重组DNA分子、活重组载体和宿主细胞、蛋白或其免疫原性部分和抗这种蛋白或其免疫原性部分的抗体的疫苗。而且，本发明涉及所述蛋白在疫苗和制备疫苗中的用途。而且，本发明涉及所述核酸序列、蛋白或抗体用于诊断或接种目的的用途。而且，本发明涉及制备这种疫苗的方法。最后本发明涉及包含这种核酸、蛋白或抗这种蛋白的抗体的诊断试剂盒。
分枝杆菌属的细菌是革兰氏阳性抗酸生物体。该属包括许多重要的人和动物病原体。其中，鸟分枝杆菌副结核亚种是副结核或Johne’s疾病的病因物质，引起很多反刍动物疾病的慢性肉芽肿感染，目前对很多肉类和牛奶工业造成基本上是全世界的经济损失。全世界很大比例的兽群(在21-70％之间)被感染。在欧洲，估计每年的损失是大约GBP207/奶牛。在美国，估计每年的损失是大约15亿美元。(Harris，N.B.和Barletta，R.G.，Clinical Microbiology Reviews 14489-512(2001))。
除了其对反刍动物的明显致病性之外，怀疑鸟分枝杆菌副结核亚种是Crohn′s病的原因，Crohn′s病是一种人的非特异性慢性透壁炎性疾病，最常影响末端回肠和结肠，但也可以发生在从口至肛门的胃肠道的任何部分和肛周区域。(P.Quirke，Gut 2001，49755-760(2001))(″Possible links between Crohn′s disease and Paratuberculosis″，European Commission，D-G Health and Consumer Protection，Reportof the Scientific Committee on Animal Health and Animal Welfare，2000年3月21日)。Crohn′s病的主要问题之一是对该病不能治愈的事实。这种疾病状况一旦积聚，一生保持存在，引起很大的发病率。
巴氏消毒过的牛奶中存在意外的鸟分枝杆菌副结核亚种的比较耐热菌株连同怀疑其在Crohn′s病发展中的作用也越来越引起关于其对人群潜在健康的影响的关注。Sung，N.和Collins，M.T.in Appl.Environm.Microbiol.64999-1005(1998)已经描述了这个最新的和意外的发现。
对该问题的认识的增加引起了发展控制和消灭副结核的有效诊断学和疫苗的重新紧迫需要。
鸟分枝杆菌包括一大组分枝杆菌，可以分成三个亚种，鸟分枝杆菌鸟亚种，鸟分枝杆菌唾液亚种和鸟分枝杆菌副结核亚种。鸟分枝杆菌鸟亚种广泛分布在自然环境中，包括土壤和表面健康的动物，以及鸟类和人类中。鸟分枝杆菌鸟亚种分离株是机会病原体并且通常对无免疫应答的宿主引起感染和疾病。目前测定了鸟分枝杆菌鸟亚种菌株104的完整基因组序列。鸟分枝杆菌唾液亚种可对鹿引起类似于副结核的疾病。尽管多数反刍动物在六个月龄前感染鸟分枝杆菌副结核亚种，但是临床病变通常仅在在至少两岁后或更晚发生。在这期间，据信细菌存活在宿主细胞内，但是确实也发生胃肠腔中感染的细胞外发作(感染晚期频率增加)，期间细菌变得可以检测到。目前可利用的针对鸟分枝杆菌副结核亚种的(免疫学)诊断学敏感性相对较低，特别是关于感染早期或潜伏期感染的检测，因此不能有效作为疾病控制的工具。虽然可以获得在某些检测上认为可有效使自由兽群不发生临床疾病的全细胞分枝杆菌疫苗，但是这些疫苗基本上都干扰牛肺结核的免疫诊断并且不抑制疾病的传播。迄今为止，已经鉴定了鸟分枝杆菌副结核亚种的抗原成分。以前描述的鸟分枝杆菌副结核亚种的抗原分子包括糖脂和用小试验动物中产生的基本上单一特异性早期血清鉴定的蛋白抗原。细胞壁糖脂分子脂质阿拉的甘露聚糖(lipoarabinomannan)(LAM)是通过其被产生的抗细菌释放的细胞滤液的单克隆抗体识别而鉴定到的，并且随后被纯化和用于血清诊断学ELISA的开发(Mutharia等，Infect.Immun.1997.65387-394；Jark等，1997.Vet.Microbiol.57189-198)。此外，分子量14kD(Olsen等Clin.Diagn.Lab.Immunol.2001.8797-801)、18kD(bacterioferritin；Elsaghier等Clin.Exp.Immunol.1992 90503-508)、19kD(AhpD；Olsen等，Infect.Immun.2000.68801-808)、24kD(p24BCD；Elsaghier等Clin.Exp.Immunol.1992 90503-508)、30kD(p30；Burrels等；Vet.Immunol.Immunpathol.1995.45311-320)、34kD(Gilot等J.Bact.1993.1754930-4935；De Kesel等J.Clin.Microbiol.1993.31947-954；Coetsier等，Clin.Diagn.Lab.Immunol.1998.5446-451)、34.5kD(Mutharia等，Infect.Immun.1997.65387-394)，)、35kD蛋白(Dheenadhayalan和Chang，未发表数据)、38kD(Elsaghier等Clin.Exp.Immunol.199290503-508)、44.3kD(Mutharia等，Infect.Immun.1997.65387-394)、45kD(AhpC；Olsen等，Infect.Immun.2000.68801-808)、65kD(hsp65；Koets等，Vet.Immunol.Immunopathol.1999.70105-115)、70kD(hsp70；Stevenson等，1991.Nucleic Acids Res.194552；Koets等，Vet.Immunol.Immunopathol.1999.70105-115)的蛋白抗原和过氧化物歧化酶分子(Mullerad等，FEMS Immunol.Med.Microbiol 3481(2002))已经被鉴定和描述了(部分)特性。这些中仅少数被估价用于诊断学或疫苗(34kD；Coetsier等，Clin.Diagn.Lab.Immunol.1998.5446-451)。因此目前的诊断学和疫苗仍基于相当粗的抗原物质。DE19621488和中W09216628已描述了脂质阿拉伯甘露聚糖(Mutharia等，Infect.Immun.1997.65387-394；Jark等，1997.Vet.Microbiol.57189-198)和34 kD抗原(Gilot等J.Bact.1993.1754930-4935；De Kesel等J.Clin.Microbiol.1993.31947-954；Coetsier等，Clin.Diagn.Lab.Immunol.1998.5446-451)用于诊断和疫苗。已经提出几个其它分子用于诊断学、疫苗和治疗。有插入序列ISM-1(EP0288306和US5225324；)的编码蛋白，分枝杆菌DAP分子(US9523226)，36kD抗原(US5776692)，可溶性抗原制剂(RU2118538)，具有还原铁的能力的细胞外蛋白(DE19728834)和酰基转移酶(WO9949054)。
本发明的一个目的是提供能够有助于保护哺乳动物，特别是人和牛不受鸟分枝杆菌副结核亚种感染的致病影响的多肽。而且，很多这些多肽和抗这些多肽的抗体提供了有效的诊断工具。
现在首次惊奇地发现在表达文库中可特异性鉴定和分离的九个不同的多肽，和在proteomics中可鉴定的两个另外的多肽，这些不同多肽中的每一个都能够诱导抗鸟分枝杆菌副结核亚种的免疫应答并适合作为疫苗成分。本发明已发现这些多肽可以单独或与彼此组合用作疫苗成分，提供确实有助于保护哺乳动物，特别是人和牛不受鸟分枝杆菌副结核亚种感染并且有助于降低鸟分枝杆菌副结核亚种引起的损害的疫苗。
三种不同的方法用于根据本发明的(编码疫苗成分的基因)疫苗成分和诊断学工具的检测。实施例中更详细地介绍这些方法。一个方法使用非常特异的抗血清检测表达文库中编码免疫反应性鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白的基因。使用的抗血清在某种意义上不同于通常用于筛选表达文库的抗血清，即从感染鸟分枝杆菌副结核亚种很长时期的牛获得。而且，这些抗血清取自发现自然感染鸟分枝杆菌副结核亚种，但是没有感染肺结核、布鲁氏杆菌病或造白细胞组织增生(leucosis)的历史的牛。这通过下列发现证实，获得测试血清前大约两年长时间内的至少两个鸟分枝杆菌副结核亚种阳性粪便样品用于筛选，和基本上没有与副结核抗原发生交叉反应的抗引起肺结核的物质的抗体或其它免疫反应。由此获得的血清在鸟分枝杆菌副结核亚种抗原的免疫筛选中非常有效，因为它们非常广泛地反应对抗相关的鸟分枝杆菌副结核亚种肽片段，然而在另一方面，它们与引起肺结核、布鲁氏杆菌病或造白细胞组织增生(leucosis)的病原体显示基本上无或仅很低的特异反应性。
这个方法导致发现三个新的免疫原性蛋白，其编码序列在下面给出的SEQ ID NO1、3和5中描述。
现在已经克隆和测序了编码第一个蛋白的基因，包含免疫原性决定簇的该基因的核酸序列在SEQ ID NO1中描述。全长基因编码分子量28kD的蛋白(如SEQ ID NO2中描述)。
本领域熟知，很多不同的核酸序列可编码一个和相同的蛋白。普遍已知这个现象是编码氨基酸的每个三联体的第二和特别是第三个碱基的波动。这个现象可产生仍编码相同蛋白质的两个核酸序列的异种性。因此，原则上，具有低如70％序列同源性的两个核酸序列仍可编码一个和相同的蛋白。
因此，本发明的一个实施方案的一个形式涉及编码鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白的核酸序列或编码所述蛋白的免疫原性片段的所述核酸序列的一部分，其中所述核酸序列或所述其一部分与SEQ ID NO1中描述的鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白基因的核酸序列具有至少85％的同源性。
下面定义了免疫原性片段的概念。编码免疫原性片段的核酸序列的长度通常至少18或更常21个核苷酸，但是优选24、27、30、33或甚至36个核苷酸。
由于本领域经常遇到的分子量测定的细微变异性，当在聚丙烯酰胺凝胶上凝胶电泳测定时，根据本发明的所有蛋白的分子量可以在一定程度上变化。因此根据本发明的蛋白的分子量应该解释为其理论分子量+/-5kD。
优选，编码鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白的根据本发明的核酸序列或编码那个蛋白的免疫原性片段的核酸序列的一部分与SEQ ID NO1中描述的鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白基因的核酸序列具有至少90％、优选93％、更优选95％的同源性。
甚至更优选的是98％，99％或甚至100％的同源性水平。
可以用可在www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bl2.html.找到的计算机程序″BLAST 2 SEQUENCES″通过选择子程序″BLASTN″确定核苷酸同源性的水平。这个程序的参考文献是Tatiana A.Tatusova，Thomas L.Madden FEMS Microbiol.Letters 174247-250(1999)。使用的参数是缺省参数匹配奖励分+1.不匹配罚分-2开放gap5延伸gap2.Gapx_dropoff50.
与SEQ ID NO 1或将在下面描述的SEQ ID NO 3、5、7、9、11、13、15或17中任何一个描述的序列互补的核苷酸序列，或包含根据本发明的序列串联排列的核苷酸序列，也包括在本发明范围内。
这个实施方案的另一个形式涉及编码14kD鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白的核酸序列或编码所述蛋白的免疫原性片段的所述核酸序列的一部分，其中所述核酸序列或所述其一部分与SEQ ID NO3中描述的鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白基因的核酸序列具有至少85％的同源性。
优选，编码14kD鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白的本发明的核酸序列或编码该蛋白的免疫原性片段的核酸序列的一部分与SEQ ID NO3中描述的鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白基因的核酸序列具有至少90％、优选93％、更优选95％的同源性。
甚至更优选的是98％、99％或甚至100％的同源性水平。
这个实施方案的另一个形式还涉及编码9kD鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白的核酸序列或编码所述蛋白的免疫原性片段的所述核酸序列的一部分，其中所述核酸序列或所述其一部分与SEQ ID NO5中描述的鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白基因的核酸序列具有至少85％的同源性。
优选，编码该9kD鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白的本发明的核酸序列或编码该蛋白的免疫原性片段的该核酸序列的一部分与SEQ IDNO5中描述的鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白基因的核酸序列具有至少90％、优选93％、更优选95％的同源性。
甚至更优选的是98％、99％或甚至100％的同源性水平。
用于检测免疫学重要的多肽的另一个方法基于使用抗鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白的高度特异性单克隆抗体。这个方法具有甚至比使用上述抗鸟分枝杆菌副结核亚种的特异性抗血清的方法更特异的优点。
这些单克隆抗体的使用导致六个另外的免疫原性鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白的鉴定和分离。
因此，这个实施方案的另一个形式涉及编码47kD鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白的核酸序列或编码所述蛋白的免疫原性片段的所述核酸序列的一部分，其中所述核酸序列或所述其一部分与SEQ ID NO7中描述的鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白基因的核酸序列具有至少85％的同源性。
优选，编码该47kD鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白的本发明的核酸序列或编码该蛋白的免疫原性片段的该核酸序列的一部分与SEQ IDNO7中描述的鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白基因的核酸序列具有至少90％、优选93％、更优选95％的同源性。
甚至更优选的是98％、99％或甚至100％的同源性水平。
这个实施方案的另一个形式涉及编码鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白的核酸序列或编码所述蛋白的免疫原性片段的所述核酸序列的一部分，其中所述核酸序列或所述其一部分与SEQ ID NO9中描述的鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白基因的核酸序列具有至少85％的同源性。
优选，编码这个鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白的本发明的核酸序列或编码该蛋白的免疫原性片段的该核酸序列的一部分与SEQ ID NO9中描述的鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白基因的核酸序列具有至少90％、优选93％、更优选95％的同源性。
甚至更优选的是98％、99％或甚至100％的同源性水平。
这个实施方案的另一个形式涉及编码鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白的核酸序列或编码所述蛋白的免疫原性片段的所述核酸序列的一部分，其中所述核酸序列或所述其一部分与SEQ ID NO11中描述的鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白基因的核酸序列具有至少85％的同源性。
优选，编码这个鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白的本发明的核酸序列或编码该蛋白的免疫原性片段的该核酸序列的一部分与SEQ ID NO11中描述的鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白基因的核酸序列具有至少90％、优选93％、更优选95％的同源性。
甚至更优选的是98％、99％或甚至100％的同源性水平。
这个实施方案的另一个形式涉及编码鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白的核酸序列或编码所述蛋白的免疫原性片段的所述核酸序列的一部分，其中所述核酸序列或所述其一部分与SEQ ID NO13中描述的鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白基因的核酸序列具有至少85％的同源性。
优选，编码这个鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白的本发明的核酸序列或编码该蛋白的免疫原性片段的该核酸序列的一部分与SEQ ID NO13中描述的鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白基因的核酸序列具有至少90％、优选93％、更优选95％的同源性。
甚至更优选的是98％、99％或甚至100％的同源性水平。
这个实施方案的另一个形式涉及编码鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白的核酸序列或编码所述蛋白的免疫原性片段的所述核酸序列的一部分，其中所述核酸序列或所述其一部分与SEQ ID NO15中描述的鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白基因的核酸序列具有至少85％的同源性。
优选，编码这个鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白的本发明的核酸序列或编码该蛋白的免疫原性片段的该核酸序列的一部分与SEQ ID NO15中描述的鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白基因的核酸序列具有至少90％、优选93％、更优选95％的同源性。
甚至更优选的是98％、99％或甚至100％的同源性水平。
这个实施方案的另一个形式涉及编码鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白的核酸序列或编码所述蛋白的免疫原性片段的所述核酸序列的一部分，其中所述核酸序列或所述其一部分与SEQ ID NO17中描述的鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白基因的核酸序列具有至少85％的同源性。
优选，编码这个鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白的根据本发明的核酸序列或编码该蛋白的免疫原性片段的该核酸序列的一部分与SEQ IDNO17中描述的鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白基因的核酸序列具有至少90％、优选93％、更优选95％的同源性。
甚至更优选的是98％、99％或甚至100％的同源性水平。
第三个方法，基于鸟分枝杆菌副结核亚种的proteome的仔细分析产生了再两种新疫苗成分的检测。这个方法基于在2D凝胶中免疫原性蛋白的鉴定。它具有胜过其它方法的优点，即表达文库中尚未发现或鉴定的蛋白现在可以明确地鉴定为疫苗成分。下列实施例2给出了该方法的详细内容。
因此，本发明的另一个实施方案还涉及具有5.60-6.15的pI的60kD鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白。


图1b和d中可见到这个蛋白是大约5个斑点的水平行(由于表现出如不同翻译后修饰或2D凝胶电泳样品制备引入的假象(artifacts)的同工形式的微小差异)。
另外，另一个实施方案涉及具有4.20-4.75的pI的33kD鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白。图1b和d中可见到这个蛋白是大约3个斑点的水平行(由于表现出如不同翻译后修饰或2D凝胶电泳样品制备引入的假象的同工形式的微小差异)。
既然这些蛋白现在已被明确鉴定，那它们就可以被测序，如根据本领域已知的标准步骤可确定N末端的前15个氨基酸。现在这种N末端测序已商业化并且在标准基础上由专门蛋白测序的公司进行。接着可使用简并探针容易地鉴定编码这些蛋白的基因。这些技术是本领域熟知的。
由于本发明公开了编码新的鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白的核酸序列，现在首次可能获得足够量的这些蛋白。这可以如使用表达系统表达根据本发明的编码该蛋白或其免疫原性片段的全部或部分基因来进行。因此，在涉及核酸序列的该实施方案的更优选形式中，本发明涉及包含根据本发明的核酸序列的DNA片段。DNA片段是作为根据本发明核酸序列的载体起作用的一段核苷酸。这种DNA片段可以是如质粒，其中克隆根据本发明的核酸序列。例如这种DNA片段可有效增加用作引物，DNA接种疫苗目的和表达根据本发明核酸序列的DNA量，如下所述。
表达核酸序列的必要条件是适当启动子与核酸序列功能性连接，使得该核酸序列处于启动子控制之下。对本领域技术人员来说，启动子的选择扩展到能够指导基因在用作蛋白表达的宿主细胞的细胞中转录的任何真核、原核或病毒启动子是显而易见的。
因此，这个实施方案的甚至更优选形式涉及包含根据本发明的DNA片段和/或核酸序列的重组DNA分子，其中根据本发明的核酸序列置于功能性连接的启动子控制之下。这可依靠如标准分子生物学技术完成。(Maniatis/Sambrook(Sambrook，J.Molecular cloningalaboratory manual，1989.ISBN 0-87969-309-6).
功能性连接的启动子是能够控制与它们连接的核酸转录的启动子。这种启动子可以是根据本发明的新基因的天然启动子或鸟分枝杆菌副结核亚种的另一个启动子，只要那个启动子在用于表达的细胞中是有功能的。它也可以是异源启动子。当宿主细胞是细菌时，可以使用的有用的表达控制序列包括Trp启动子和操纵子(Godeddel等，Nucl.Acids Res.，8，4057，1980)；1ac启动子和操纵子(Chang，等，Nature，275，615，1978)；外膜蛋白启动子(Nakamura，K.和Inoμge，M.，EMBO J.，1，771-775，1982)，λ噬菌体启动子和操纵子(Remaut，E.等，Nucl.Acids Res.，11，4677-4688，1983)；α-淀粉酶(枯草芽孢杆菌)启动子和操纵子，与所选宿主细胞相容的终止序列和其它表达增强和控制序列。
当宿主细胞是酵母时，有用的表达控制序列包括如α-交配因子。对于昆虫细胞，可以使用多角体蛋白或杆状病毒的p10启动子(Smith，G.E.等，Mol.Cell.Biol.3，2156-65，1983)。当宿主细胞是脊椎动物时，示例的有用表达控制序列包括(人)巨细胞病毒即早启动子(Seed，B.等，Nature 329，840-842，1987；Fynan，E.F.等，PNAS 90，11478-11482，1993；Ulmer，J.B.等，Science259，1745-1748，1993)，鲁斯氏肉瘤病毒LTR(RSV，Gorman，C.M.等，PNAS 79，6777-6781，1982；Fynan等，前述；Ulmer等，前述)，MPSV LTR(Stacey等，J.Virology 50，725-732，1984)，SV40即早启动子(Sprague J.等，J.Virology 45，773，1983)，SV-40启动子(Berman，P.W.等，Science，222，524-527，1983)，金属硫蛋白启动子(Brinster，R.L.等，Nature 296，39-42，1982)，热休克启动子(Voellmy等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，4949-53，1985)，Ad2的主要晚期启动子和β-肌动蛋白启动子(Tang等，Nature 356，152-154，1992)。调节序列也可以包括终止和聚腺苷酸序列。其中可使用的序列是熟知的牛生长激素聚腺苷酸序列，SV40聚腺苷酸序列，人巨细胞病毒(hCMV)终止子和聚腺苷酸序列。
细菌、酵母、真菌、昆虫和脊椎动物细胞表达系统是很常使用的系统。这种系统是本领域熟知的并且通常可以从商业上获得，如从Clontech Laboratories，Inc.4030 Fabian Way，Palo Alto，California94303-4607，美国。仅次于这些表达系统，基于寄生虫的表达系统是有吸引力的表达系统。这种系统如在法国专利申请，
发明者P·T·J·威廉姆森, S·F·维斯特芬, D·巴克尔, F·G·范兹德维尔德, J·E·R·瑟尔 申请人:动物饲养与动物健康研究有限公司