三元聚电解质复合物及其制备和在副结核疫苗中的应用

1.本技术属于医药生物领域中的疫苗技术领域，具体地，本技术提供了一种壳聚糖-海藻酸钠-穿膜肽三元聚电解质复合物及其制备和在副结核疫苗中的应用。


背景技术：

2.副结核病(paratuberculosis)是由禽分枝杆菌亚种的副结核分枝杆菌(mycobacterium aviumsubsp paratuberculosis，map)引起的普通家畜和反刍动物慢性消化道疾病，严重影响畜牧业发展，亟需开发防治副结核分枝杆菌的新方法。map是一种肠道病原体，肠道黏膜的宿主-病原体相互作用是最终疾病进程的首要决定因素。黏膜免疫系统具有机体最大的免疫细胞库，因此利用黏膜免疫来提高免疫效应是本研究的主要宗旨。
3.口服疫苗可触发全身和黏膜免疫反应，有效抵御大多数病原性细菌感染，并显着减少胃肠粘膜的细菌定植。与其他进入黏膜表面的潜在途径(如鼻腔或直肠给药)相比，考虑到对大量动物给药的便利性，口服途径仍然更具吸引力。但是，亚单位疫苗通过口服途径免疫面临着一些挑战，影响口服药物或者疫苗的影响因素：生化屏障，即ph屏障，从强酸性的胃液至弱碱性的肠液；蛋白酶屏障；黏液屏障；肠上皮细胞屏障。


技术实现要素：

4.基于上述考虑，本本技术设计了一种ph敏感性壳聚糖/海藻酸钠/穿膜肽聚电解质复合物，通过纳米递送系统保护抗原，使抗原成分在胃肠道充分发挥作用。其中，壳聚糖(chitosan)为天然的阳离子多糖，由葡萄糖胺和n-乙酰葡萄糖胺随机排列而成，具有低毒、低生物降解性和低免疫原性等优点，被认为是一种很有前途的药物缓释载体，此外，壳聚糖有一个独特的特性，可以粘附在黏膜表面并打开紧密之间的上皮细胞；海藻酸钠(alginate)是一种水溶性的天然线性阴离子多糖，能在较低的ph收缩，使包封的药物滞留在胃，同时保护药物免受酶的作用而失活，因此在ph响应性聚合物中得到了广泛的应用。将壳聚糖和海藻酸钠分别包覆在plga纳米颗粒表面后，将两种带相反电荷的纳米颗粒混合，通过分子间的氢键和氨基与羧基之间的静电相互作用，使两种纳米粒相互交联，形成一个以纳米粒为单位的网状复合体系，并以此聚电解质复合物作为载体口服递送药物，提高包载药物的稳定性和缓释性。再者，我们利用具有较强的细胞膜穿透能力和较强的阳离子特性的穿膜肽r8与抗原蛋白通过静电自组装作用结合，能进一步提高抗原蛋白被肠道免疫细胞摄取的机会。
5.本技术将穿膜肽r8与抗原蛋白通过静电自组装作用结合，形成穿膜肽r8-抗原蛋白复合物，再使用高分子材料plga将上述r8-抗原蛋白复合物包埋，分别使用壳聚糖或海藻酸钠包覆于载有抗原蛋白的plga纳米颗粒表面，形成了两种表面包覆相反电荷的纳米颗粒，之后将这两种纳米颗粒混合即制备成壳聚糖-海藻酸钠-穿膜肽三元聚电解质复合物。本发明的三元聚电解质复合物可以成功克服胃肠道屏障，保护抗原蛋白不被胃肠道环境降解并增强其穿透肠道屏障的能力，激活高效的黏膜免疫应答，可作为一种口服疫苗递送载
体，通过包载副结核抗原蛋白，有望成为防治肠道病菌副结核的新方法。
6.一方面，本技术提供了一种三元聚电解质复合物，所述三元聚电解质复合物为壳聚糖-海藻酸钠-穿膜肽三元聚电解质复合物。
7.进一步地，所述三元聚电解质复合物是将电荷特性不同的壳聚糖和海藻酸钠包覆于plga纳米颗粒表面后，通过静电混合形成的聚电解质复合物；所述plga纳米颗粒包载抗原蛋白和穿膜肽的复合物。
8.进一步地，所述穿膜肽为穿膜肽r8。
9.进一步地，所述抗原蛋白为副结核分枝杆菌抗原。
10.进一步地，所述抗原蛋白为融合蛋白hbha-ag85b-bfra。
11.另一方面，本技术提供了所述三元聚电解质复合物的制备方法，包括：
12.1)将抗原蛋白与穿膜肽r8混合，通过静电自组装成抗原-穿膜肽(ag-r8)复合物；
13.2)制备壳聚糖包覆的plga纳米颗粒：
14.将上述第1)步制得的ag-r8溶液倒入溶解有plga的油相中，超声乳化，制得初乳；将初乳加入的pva和壳聚糖混合溶液中，超声乳化，制得复乳；将复乳加入pva溶液中，搅拌，挥发有机相；离心洗涤；
15.3)制备壳聚酸钠包覆的plga纳米颗粒：
16.将上述第1)步制得的ag-r8溶液倒入溶解有plga的油相溶液中，超声乳化，制得初乳；将初乳加入海藻酸纳溶液中，超声乳化，制得复乳；将复乳加入泊洛沙姆f68溶液中，搅拌，挥发有机相；离心洗涤；
17.4)将第2)步和第3)步制得的纳米颗粒重悬于pbs溶液，混合，即得壳聚糖-海藻酸钠-穿膜肽三元聚电解质复合物。
18.进一步地，所述油相为乙酸乙酯或二氯甲烷。
19.进一步地，
20.另一方面，本技术提供了所述方法包括：
21.1)将抗原蛋白与穿膜肽r8混合按质量比1：1，溶解于pbs溶液中，通过静电自组装成抗原-穿膜肽复合物；
22.2)制备壳聚糖包覆的plga纳米颗粒：
23.将上述第1步制得的2mg/ml的ag-r8溶液500μl，倒入5ml溶解有100mg plga的二氯甲烷溶液中，超声乳化，制得初乳；将初乳加入10ml 2％的pva和0.5％的壳聚糖混合溶液中，超声乳化，制得复乳；将复乳加入10ml 0.5％的pva溶液中，室温搅拌5小时，挥发有机相；离心洗涤；
24.3)制备海藻酸钠包覆的plga纳米颗粒：
25.将上述第1步制得的2mg/ml的ag-r8溶液500μl，倒入溶解有100mg plga的二氯甲烷溶液中，超声乳化，制得初乳；将初乳加入10ml 0.5％的海藻酸纳溶液中，超声乳化，制得复乳；将复乳加入10ml 2％的泊洛沙姆f68溶液中，室温搅拌5小时，挥发有机相；离心洗涤；
26.4)将第2)步和第3)步制得的纳米颗粒重悬于pbs溶液，混合，即得壳聚糖-海藻酸钠-穿膜肽三元聚电解质复合物。上述三元聚电解质复合物或者根据上述方法制备的三元聚电解质复合物在制备副结核病疫苗中的应用。
27.进一步地，所述疫苗能降低接种对象感染副结核分支杆菌后的载菌量。
28.进一步地，所述疫苗能提升接种对象免疫后肠道黏膜iga分泌以及脾脏t细胞增殖。
29.另一方面，本技术提供了副结核病疫苗，其包含上述三元聚电解质复合物或者根据上述方法制备的三元聚电解质复合物。
30.本技术中的抗原蛋白不限于hbha-ag85b-bfra，其他map的抗原蛋白也可以使用。
31.本技术所述的穿膜肽r8为8个精氨酸组成的功能性短肽，即八聚精氨酸，本领域技术人员可以市售或者自制获得。
32.本技术中的纳米颗粒/疫苗优选以口服方式使用，但不排除选择适合的载体和配方后以注射、喷鼻等方式施用。
33.本技术中的辅料本领域技术人员可以根据疫苗领域的常规知识选用已知或在研的品种，包括但不限于佐剂、溶剂、助溶剂、缓冲剂、抗氧化剂、防腐剂。
附图说明
34.图1为通过sds-page和western blot验证纯化的重组融合蛋白hbha-ag85b-bfra；
35.图2为新型共装载纳米颗粒的表征；
36.图3为三元聚电解质复合物在不同条件下的形态；
37.图4为纳米颗粒的免疫性评价；
38.图5为小鼠肝脏载菌量。
具体实施方式
39.实施例1重组融合蛋白的表达
40.复苏保存的转入有hbha-ag85b-bfra-pet-30a(+)原核表达质粒的大肠杆菌，用含卡那霉素(终浓度为50μg/ml)的lb培养基培养细菌至对数生长期(od600nm为006-008)，加入iptg(终浓度为1mm)，30℃摇床，160rpm，诱导表达4h，4℃，8000rpm离心3min收集菌体，并用预冷pbs洗两遍，菌体用pbs重悬并超声，裂解，10000rpm离心10min，获取裂解上清。将裂解上清通过ni柱亲和层析法纯化，获得重组融合蛋白hbha-ag85b-bfra。重组融合蛋白核酸序列如下：
41.cttagagggattcattccctctagaataattttgtttaactttaagaaggagatatacatatgcaccatcatcatc
42.atcattcttctggtctggtgccacgcggttctggtatgaaagaaaccgctgctgctaaattcgaacgccagcacatggac
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47.ggacgactacaacggctgggacatcaacaccccggccttcgagtggtactaccagtccggcctgtcggtgatcatgcccg
48.tcggcggacagtccagcttctacgcggactggtaccagcccgcgtgcggcaaggccggttgctccacttataagtgggag
49.accttcctgaccagcgagctgccgtcgtacctggcctccaacaagggtgtgaagcgcaccggcagcgccgcagtcggcat
50.ttcgatgtccggatcctcggcgatgatcctggccgtcaaccatcccgaccaattcatctatgccggatcgctctcggcgc
51.tgctcgacccgtcccagggcatggggccgtcgctgatcggtctggcgatgggtgacgccggcggctacaaggccgacgcc
52.atgtggggcccgtccagcgacccggcctggcagcgcaacgacccgagcctgcacatccccgagctggtcggccacaacac
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55.aacggaacgcacagctgggagtactggggagcccagctcaacgccatgaagcccgacctgcagggcaccctgggcgcgtc
56.cccgggcggcggcggaggaattcatggcggaaaacccgaacatcgacgacttgcgagccccgctgctcgcggccctgggc
57.gcggccgacctggccctggccacggtcaacgacctgatcgccaacctgcgcgagcgggccgaggagacccgcgccgagac
58.ccgcacccgggtcgaggagcgccgcgcccggctgaccaagttccaggaggacctgcccgagcagttcaccgagctgcgcg
59.acaagttcaccaccgaggagctgcgcaaggcggccgagggctacctggaggcggcgaccaaccggtacaacgagctggtc
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61.ggaccaggccgtcgagctgacccaggaggcgctgggcaccgtcgcgtcgcagacccgcgcggtcggtgagcgcgccgcca
62.agctggtgggcatcgagctgccgggcaaggccgaggccgccggcaagaaggcccagaaggccatcgccaaggcccccgcc
63.aagaaggcgccggccaagaaggtcacccagaaggaagcttgcggccgcactcgagcaccaccaccaccaccactgagatc
64.cggctgctaacaaagcccgaaagaagcgtaggtcccg(seq id no01)
65.将纯化后的重组蛋白进行sds-page凝胶电泳和用小鼠感染map阳性血清进行western blot鉴定，结果显示nc膜上可见单一条带，符合预期大小(图1)。
66.实施例2纳米颗粒的制备
67.1)将抗原蛋白与穿膜肽r8混合按质量比1：1，溶解于pbs溶液中，通过静电自组装
成抗原-穿膜肽(ag-r8)复合物；
68.2)制备壳聚糖包覆的plga纳米颗粒：
69.将上述第1步制得的ag-r8溶液(500μl，2mg/ml)倒入5ml溶解有plga(100mg，)的二氯甲烷溶液中，超声乳化(300w，6min,超声2s，停3s)，制得初乳；将初乳加入2％的pva和005％的壳聚糖混合溶液(10ml)中，超声乳化(300w，8min,超声2s，停3s)，制得复乳；将复乳加入005％的pva溶液(10ml)中，室温搅拌5小时，挥发有机相；离心洗涤。
70.3)制备海藻酸钠包覆的plga纳米颗粒：
71.将上述第1步制得的ag-r8溶液(500μl，2mg/ml)倒入溶解有plga(100mg，)的二氯甲烷溶液中，超声乳化(300w，6min,超声2s，停3s)，制得初乳；将初乳加入005％的海藻酸纳溶液(10ml)中，超声乳化(300w，8min,超声2s，停3s)，制得复乳；将复乳加入2％的泊洛沙姆(f68)溶液(10ml)中，室温搅拌5小时，挥发有机相；离心洗涤。；
72.4)将第2步和第3步制得的纳米颗粒重悬于pbs溶液，混合，即得壳聚糖-海藻酸钠-穿膜肽三元聚电解质复合物。
73.实施例3纳米颗粒的表征
74.取适量微球粉末，用少量去离子水分散，均匀铺布在仪器相应金属板上，常温干燥，喷金，扫描电镜下观察微球形貌。取少量微球粉末，去离子水复溶，使之分散均匀，按说明放入动态光粒子分析仪中，运用malvern instrument软件分析数据。
75.如图2所示，制备的壳聚糖-plga纳米微粒平均粒径约429nm，电位为+2506mv；制备的壳聚糖-plga纳米微粒平均粒径约432nm，电位为-30.3mv。如图3，扫描电镜结果显示在酸性条件(ph 1.2)下，聚电解质复合物为相互交联的网状，在模拟肠液(ph 6.8)条件下，聚电解质复合物开始解离，在模拟血液(ph 7.4)中，复合物已经解离为单个的纳米粒子。
76.实施例4纳米颗粒的免疫性和保护性评价
77.将c57bl/6小鼠随机分为4组，每组12只，分别为pbs组(control)、抗原蛋白+穿膜肽+壳聚糖plga组(ag/r8-csplga)、抗原蛋白+壳聚糖/海藻酸纳/plga组(ag-pec)、ag+三元聚电解质复合物组(ag/r8-pec)和抗原蛋白组(ag)。免疫方式为口服灌胃(10mg/只)，每组免疫三次，每次间隔两周，最后一次免疫后，每组随机选取3只小鼠进行相关免疫指标的检测。攻毒方式为：最后一次免疫两周后，每组小鼠腹腔注射100μl 108cfu/只map(2015wd-1菌株)；攻毒8周后，每组随机选取5只小鼠剖检采样进行后续检测。
78.图3结果表明，bfra-plga免疫后能显著促进肠道黏膜iga的分泌和脾脏t细胞的增殖(图4)。
79.map攻毒8周后检测小鼠肝脏载菌量，结果(图5)显示，灌胃该三元聚电解质复合物后可显著减少小鼠肝脏载菌量。