结核分枝杆菌Wag31基因的免疫功能用图
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术和医药领域，涉及结核分枝杆菌基因Wag31其免疫功能应用。
【背景技术】
[0002]结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)是人类健康的严重威胁,近年来，中国结核分枝杆菌感染形式不容乐观，有愈演愈烈的趋势。结核分枝杆菌感染人体后，可侵入巨噬细胞并长期存活，导致结核病。
[0003]结核病疫苗是结核病防控的重中之重。
[0004]BCG菌株是bacillus Calmette_Gu6rin的简称，中文翻译成卡介苗,最早由法国科学家卡尔梅特(Calmette)和介朗(Gu6rin)研制成功的疫苗，即将有毒力的牛型结核分枝杆菌在甘油胆汁马铃薯培养基上长期培养传代，得到减毒菌株，可用于预防结核菌感染。但正在使用的结核病疫苗BCG存在保护效果不稳定的缺陷，仍有很大的提升空间。在小鼠模型中，利用BCG免疫后，可以观察到多种水平上的免疫增强，比如CD4+CD8+ T细胞水平提高，脾淋巴细胞刺激后分泌干扰素gamma，TNF-a水平提高等，在免疫后4?6周达到顶峰，之后逐渐回落。
[0005]利用重组结核病疫苗方法改善免疫效果有两种策略，一种是在BCG菌株中表达抗原性较高的抗原，以提高峰值的水平，一种是在BCG菌株中表达某种抗原，减缓免疫水平降低。这两种策略都依赖于抗原蛋白的筛选与检验。
[0006]Wag31，又名Ag84，是DivIVA同源蛋白，在结核分枝杆菌中保守存在。近年来的研究表明，wag31广泛参与到结核分枝杆菌的极点生长与细胞壁合成，对菌体生长分裂起到重要作用，对菌体形态的维持也有重要影响。同时也是较早发现的抗原蛋白之一。但是对于其确切的免疫原性并不清楚。
【发明内容】
[0007]本发明的一个目的在于提供结核分枝杆菌Wag31的新用途。
[0008]本发明的另一个目的在于提供在原核细胞中重组表达结核分枝杆菌Wag31，从而制备免疫效果较好的BCG疫苗的一种方法。
[0009]本发明提供了结核分枝杆菌Wag31蛋白的新应用，即结核分枝杆菌Wag31蛋白在制备重组BCG疫苗中的应用。
[0010]具体而言，结核分枝杆菌Wag31蛋白可以作为亚单位疫苗组分。
[0011]本发明的试验表明，第7周，重组BCG疫苗免疫组小鼠脾淋巴细胞分泌IFN-ga_a，TNF-a和IL-2的水平低于BCG对照组，但是第11周时，重组BCG疫苗免疫组的脾淋巴细胞分泌IFN-gamma，IL-2的水平优于BCG对照，这表明Wag31的过表达降低了小鼠中BCG免疫效果衰退的速度。因此，wag31可以作为优化BCG疫苗的一种另类的候选抗原，着眼于增强BCG后期的免疫效果。
[0012]结核分枝杆菌Wag31基因的NCBI登录号为NC_000962.2，蛋白的NCBI登录号为NP_216661.1。
[0013]本发明中的“Wag31基因序列”也包括对NC_000962.2中一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后产生的序列。由于密码子的简并性，所以与NC_000962.2核苷酸序列同源性低至约70%的兼并序列也能编码出相同的氨基酸序列，该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳地在高度严紧条件下，与NC_000962.2的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与NC_000962.2的核苷酸序列的同源性至少70%，较佳的至少80%，更佳的至少90%的核苷酸序列。
[0014]相应的，本发明提供了一种重组BCG疫苗，利用结核分枝杆菌Wag31的蛋白作为疫苗组分，构建重组BCG疫苗。
[0015]本发明提供了一种DNA疫苗，利用结核分枝杆菌Wag31的基因片段作为DNA疫苗基因片段的一部分，构建DNA疫苗。
[0016]将Wag31基因片段插入表达质粒,表达结核分枝杆菌Wag31蛋白，可以作为亚单位疫苗组分。
[0017]另一方面，本发明提供了一种在原核细胞中重组表达结核分枝杆菌Wag31，最终制备重组疫苗的方法。
[0018]本发明提供了一种重组质粒，其含有原核生物的启动子序列和结核分枝杆菌wag31的基因片段。
[0019]上述重组质粒的制备方法，主要包括如下步骤:
(O结核分枝杆菌H37RV菌株基因组的制备；
(2)Wag31基因的扩增；
(3)Wag31基因插入表达质粒，获得重组子。
[0020]随后，可以将(3)中所得的重组子转化入宿主细胞中。
[0021]较好的，所述的表达质粒含有真核生物的启动子序列。
[0022]在本发明的一个优选例中，结核分枝杆菌Wag31抗原的表达纯化方法是以标准毒株H37Rv的基因组作为模板，用PCR法扩增Wag31的基因片段，并将该基因重组到表达型质粒pMV261中，该重组质粒转化至分枝杆菌属菌株Mycobacterium bovis BCG获得过表达Wag31的重组BCG菌株。
[0023]本发明提供了一种新的重组质粒，即将Wag31基因序列插入一般的商用表达质粒(包括但不限于PMV261)中。
[0024]本发明的重组质粒，通常将Wag31基因插入表达质粒的多克隆位点既得。
[0025]本发明的重组质粒制备过程中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，然后将编码本发明的核苷酸序列可操作的连于表达调控序列，可以形成蛋白表达载体。
[0026]本发明中，可采用的载体有pMV261，pMV361等。在本发明的一个实施例中，所用的质粒是PMV261。
[0027]所用的宿主细胞应当与表达质粒相匹配，可使用多种BCG亚型等。
[0028]本发明的一个实施例中用的是BCG丹麦菌株。
[0029]本发明的一个实施例中，提供了一种在分枝杆菌属菌株Mycobacterium bovisBCG中表达Wag31的方法。
[0030]Wag31是结核分枝杆菌抗原，以标准毒株H37Rv的基因组DNA作为模板，用PCR法扩增Wag31的基因片段,并插入到原核表达质粒pMV261中,在分枝杆菌菌株Mycobacteriumbovis BCG中过表达Wag31，利用此重组BCG疫苗免疫小鼠，发现第7周，重组BCG疫苗免疫组小鼠脾淋巴细胞分泌TNF-a和IL-2的水平低于BCG对照组，但是第11周时，重组BCG疫苗免疫组的脾淋巴细胞分泌IL-2的水平优于BCG对照，这表明Wag31的过表达降低了小鼠中BCG免疫效果衰退的速度。因此，wag31可以作为优化BCG疫苗的一种另类的候选抗原，着眼于增强BCG后期的免疫效果。
【附图说明】
[0031]图1:第7周，不同免疫组小鼠(n=5)脾细胞刺激后分泌的TNF_a的水平。BCG+ffag31表示Wag31过表达重组BCG疫苗。
[0032]图2:第7周，不同免疫组小鼠(n=5)脾细胞刺激后分泌的IL-2的水平。BCG+ffag31表示Wag31过表达重组BCG疫苗。
[0033]图3:第11周，不同免疫组小鼠(n=5)脾细胞刺激后分泌的IL_2的水平。BCG+ffag31表示Wag31过表达重组BCG疫苗。
【具体实施方式】
[0034]本发明的前期实验中发现，wag31可以结合淋巴细胞趋化因子XCL2。XCL2由巨噬细胞产生，可以趋化影响树突状细胞，T细胞等多种免疫细胞，可能介导肉芽肿的形成。进一步的研究表明，Wag31可以诱导XCL2在巨噬细胞中的表达。为了进一步探索wag31的免疫原性，我们构建了过表达Wag31的重组BCG菌株，并以此菌株免疫小鼠，发现虽然第7周的免疫水平低于BCG对照菌株，但是第11周免疫水平优于BCG对照菌株。本发明在此基础上进一步研究完成。
[0035]本发明提出的结核分枝杆菌Wag31抗原的表达纯化方法是以标准毒株H37Rv的基因组作为模板，用PCR法扩增Wag31的基因片段，并将该基因重组到表达型质粒pET30a中，该重组质粒转化至大肠杆菌表达株BL21 (DE3)中表达蛋白Wag31。表达的Wag31蛋白携带6X his-tag，分子质量29.7kd，用亲和纯化法得到的蛋白Wag31蛋白纯度好，得率高，可为进一步的生物学研究创造条件。
[0036]本发明的一个方面，提供了一种新的重组质粒，即将Wag31基因序列插入一般的商用表达质粒中。
[0037]Wag31 基因的 NCBI 登录号为 NC_000962.2，蛋白的 NCBI 登录号为 NP_216661.1。
[0038]本发明中的“Wag31基因序列”也包括对NC_000962.2中一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后产生的序列。由于密码子的简并性，所以与NC_000962.2核苷酸序列同源性低至约70%的兼并序列也能编码出相同的氨基酸序列，该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳地在高度严紧条件下，与NC_000962.2的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与NC_000962.2的核苷酸序列的同源性至少70%，较佳的至少80%，更佳的至少90%的核苷酸序列。
[0039]本发明的重组质粒，通常将Wag31基因插入表达质粒的多克隆位点既得。
[0040]本发明的重组质粒制备过程中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，然后将编码本发明的核苷酸序列可操作的连于表达调控序列，可以形成蛋白表达载体。
[0041]本发明中，可采用的载体有pET32a，pET28a，pET30a等。在本发明的一个实施例中，所用的质粒是pET30a。
[0042]本发明的另一方面，提供了一种结核分枝杆菌相关的重组蛋白，即重组蛋白是将插入Wag31基因片段的重组表达质粒转化入宿主细胞而得到的。
[0043]在本发