一种防龋齿蛋白疫苗及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药生物技术领域，特别涉及一种预防龋齿的蛋白疫苗及其制备方 法。
【背景技术】
[0002] 龋齿和心血管疾病、癌症并称为人类三大疾病。在中国，80%的儿童、50%的成人、 98%的老年人都不同程度受其困扰。要达到龋齿的有效预防，除了降低碳水化合物摄入、 利用氟化物增强牙齿对酸的抵抗力和采用密封剂减少致病菌在齿沟的定植之外，使用抗菌 物质减少或者消灭致龋微生物是科学家数十年来研宄的重点，龋齿疫苗的研发更是重中之 重，但到目前为止，仍然没有一种疫苗能够在临床应用。
[0003] 龋齿疫苗的研发是随着对致龋微生物的逐渐认识而进行的，变形链球菌 (Streptococcusmutans,S.Mutans)是主要的致願微生物，其致願性主要表现在对牙面的 黏附、产酸、耐酸以及产生多糖和细菌素等方面，针对变形链球菌的疫苗种类较多。早期，科 学家们尝试将完整的变形链球菌灭活，作为经口途径的疫苗使用，但是因为变形链球菌有 能与心肌特别是心脂质和肌纤维膜鞘交叉反应的抗原，导致接种者死亡的潜在危险而不被 接受；随后，DNA重组技术被用来将致龋微生物的抗原成分重组到非致龋、无交叉反应的良 性细菌（如乳酸杆菌等）中，但是没有足够证据能够保证所谓的良性细菌足够安全；20世 纪90年代初出现DNA疫苗，其基本原理是将外源性基因直接导入宿主细胞内，诱导宿主免 疫系统对目的基因所表达的蛋白发生免疫反应，达到预防疾病的目的。DNA疫苗具有免疫 原性强、可激发全面持久的免疫应答、可制备成多价疫苗、制备简单等优点。但是，目前为止 DNA免疫所得到的结果还很不均一，有的DNA疫苗能起到很好的保护作用，有的却保护不明 显，甚至还有免疫自然宿主反而加重了病毒感染的报道。因此，DNA免疫尚处于探索时期， 所有的动物、表达载体、基因片段等均不相同，结果差别甚大。
[0004] 近来，多种以S. Mutans抗原为基础的防龋疫苗可显著降低动物龋齿发生 率，抗原主要有：表面蛋白抗原I/II(Ag 1/11)、葡糖基转移酶（GTF)和葡聚糖结合 蛋白（GBP)等抗原分子（Hajishengallis G. Infect Immun, 1998,66(4) : 1740-1743 ; Katz J. Infect Immun, 1993,61 (5) : 1964-1971 ；Childers NK.Oral Microbiol Immunol, 2006, 21 (5) : 309-313 ；Childers NK. J DentRes, 2002, 81 (1) : 48-52.； Peacock ZS.Oral Microbiol Immunol, 2005, 20 (1) :60-64 ；Smith D J. Infect Immun, 2005, 73(5) : 2797-2804)。葡糖基转移酶（Glucosyltransferase，GTF)是变形链球 菌合成的重要致龋因子，催化蔗糖合成包括葡聚糖在内的多种胞外多糖。GTF结构包括催 化区（Catalytie，Cat)和葡聚糖结合区（Glucan binding，Glu)两个功能区段。催化活 性区具有催化蔗糖水解的活性，能够催化蔗糖产生葡聚糖；葡聚糖结合区与葡聚糖结合， 这种结合是特异性，不可逆的，且结合力非常强，由此介导了变形链球菌之间、菌体与葡聚 糖、菌体与牙面之间的相互作用，从而使变形链球菌粘附、聚集在牙齿的表面并产酸，酸引 起牙齿表面脱矿，最终导致龋病的发生，是龋病发生的主要因素。Glu具有良好的免疫原 性和免疫保护性，其可高效诱导抗GTF抗体，从而抑制GTF合成葡聚糖的能力，减少菌斑形 成（Xu QA，Vaccine. 2007Jan26 ;25(7):1191-5 ;Jespersgaard C，Infect Immun. 1999Feb ； 67(2) : 810-6 ;Taubman MA, Infect Immun. 2001 Jul ;69 (7) : 4210-6.)。因此，抑制 GTF 催化 合成葡聚糖有可能预防龋病的发生。
【发明内容】
[0005] 本发明的一个目的是提供一种防龋齿蛋白疫苗，其活性成分为SEQ ID N0 :1所示 的蛋白质。
[0006] 本发明的另一个目的是提供以上防龋齿蛋白疫苗的制备方法，其主要包含步骤：
[0007] 1)通过PCR方法，从变形链球菌UA159基因组扩增水不溶性葡萄糖基转移酶葡萄 糖结合区Glu基因片段，扩增引物序列如下：
[0008] 上游引物
[0009] 5'-CGC GGATCC ATGGGCTATCAAGCCAAAG-3r
[0010] 下游引物
[0011] 5'-CCG CTCGAG AATCCGAACTCGTTCTCCAG-3r
[0012] 2)将所述Glu基因片段构建到含有6-His组氨酸标签的表达载体上，得到重组质 粒，转化至表达菌，酶切鉴定；
[0013] 3)诱导表达可溶性的重组蛋白；
[0014] 4)纯化步骤3获得的重组蛋白，冰浴搅拌透析换液，除去咪唑。
[0015] 所述步骤（2)中的含6-His组氨酸标签的表达载体为pET28a质粒，表达菌为 E. coli DH5 a 〇
[0016] 优选的，步骤（3)具体为：挑取含有目的蛋白的重组子的单克隆，转入卡那霉素阳 性的LB液体培养基，37°C过夜震荡培养；再接种至新鲜配制的卡那霉素阳性的LB液体培养 基中，37°C摇床震荡过夜，增菌，待A6000D值为0. 4-0. 6时，加入IPTG终浓度为0. lmmol/ L-l. Ommol/L，15°C -37°C继续培养 4-16 小时。
[0017] 优选的，步骤（3)具体为：挑取含有目的蛋白的重组子的单克隆，转入卡那霉素阳 性的LB液体培养基，37°C过夜震荡培养；再接种至新鲜配制的卡那霉素阳性的LB液体培养 基中，37°C摇床震荡过夜，增菌，待A6000D值为0. 4-0. 6时，加入IPTG终浓度为0. 3mmol/L， 15°C继续培养16小时。
[0018] 优选的，步骤（4)具体为：4°C，8000rpm离心5分钟收集诱导后的菌体，去上清，用 binding buffer洗绦一次，根据菌体的量，选择适量的binding buffer重悬菌体；冰浴环 境下，超声破碎，收集蛋白粗液；l〇〇〇〇rpm，30min，4°C离心破碎液，收集上清，并经0. 45 y m 过滤器过滤，冰浴备用；使用lml HisTrap FF镍柱以及AKTApurifier 10仪器进行纯化， SDS-PAGE电泳，分析目的蛋白的纯度；冰浴搅拌透析换液，除去咪唑。
[0019] 本发明通过对新型防龋重组蛋白疫苗的构建，同时对可溶性蛋白疫苗的表达和纯 化步骤进行优化，建立了一种新型防龋蛋白疫苗的规模化制备方法，该方法适用于大规模 制备人用防龋蛋白疫苗，安全高效，具有良好的开发和应用前景。本发明所构建和纯化得到 的重组蛋白疫苗，将为后续研宄蛋白疫苗的免疫效应提供充足的物质基础。
【附图说明】
[0020] 图1为Glu基因PCR扩增结果图，图中M为DNA marker，1为Glu基因目的片段；
[0021] 图2为Xholl和BamHI双酶切质粒、Glu基因PCR扩增片段结果，图中M为DNA marker，1为载体pET28a经Xholl和BamHI双酶切，2为Glu经BamHI和Xholl双酶切；
[0022] 图3为不同温度下诱导表达蛋白的SDS-PAGE图，M为蛋白分子量，1、3、5分别代 表未经IPTG诱导，30°C，37°C，15°C下含pET28a-Glu的大肠杆菌的蛋白带；2、4、6分别代表 30°〇，371：，151：下用111111?了6诱导含口￡了28&-6111的大肠杆菌的蛋白带 ；
[0023] 图4为Glu在15°C时经不同IPTG浓度诱导表达重组蛋白的SDS-PAGE图，M为蛋 白分子量，1为诱导前的细菌裂解液，2为经IPTG = 0.1 mM诱导的细菌裂解液上清，3为经 IPTG = 0.1 mM诱导的细菌裂解沉淀，4为经IPTG = 0. 3mM诱导的细菌裂解液上清，5为经 IPTG = 0. 3mM诱导的细菌裂解液沉淀；
[0024] 图5为Glu金属螯合层析SDS-page结果，图中M为蛋白Marker，1为Glu诱导前， 2为Glu超声上清，3为Glu超声沉淀，4为Glu流穿峰，5为Glu洗涤峰，6为Glu洗脱峰；
[0025] 图6蛋白疫苗Glu纯化后SDS-PAGE图；
[0026] 图7为蛋白疫苗免疫小鼠后血清中特异性抗体产生水平，A为PCIA-P DNA疫苗免 疫组，B为rPAc蛋白免疫，