Erbb3用于肿瘤治疗的方法和组合物的制作方法

专利名称：Erbb3用于肿瘤治疗的方法和组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及治疗哺乳动物肿瘤尤其是人类肿瘤的组合物和方法。更具体说，本发明涉及ErbB-3蛋白或其功能片段、编码ErbB-3蛋白或其功能片段的核酸，用于预防、治疗或延缓哺乳动物肿瘤的方法。同时，本发明提供了分离的编码ErbB-3胞外结构域的蛋白、功能片段的核酸，纯化的ErbB-3胞外结构域的蛋白、功能片段，以及与ErbB-3胞外结构域的蛋白或功能片段的抗原决定部位结合的抗体。本发明还提供包括ErbB-3胞外结构域的蛋白或功能片段，编码ErbB-3胞外结构域的蛋白、功能片段的核酸，与ErbB-3胞外结构域的蛋白或功能片段结合的抗体组成的药物组合物和(或)疫苗。
背景技术：
癌症是导致人类死亡的主要疾病，它因生理性细胞增殖失控引起。细胞增殖失控影响人体正常生理状态，导致严重病理反应，甚或导致死亡。尽管，人类在癌症研究和治疗方面取得了相当的进步，但癌症仍是导致人类死亡的主要原因。治疗癌症的方法有多种，主要包括手术治疗、放射治疗和化学治疗。手术与放疗不能彻底消灭癌细胞。因此，在癌症治疗中更多采用化疗或化疗与其它治疗方法结合使用。临床治疗使用的抗癌药物通常是靶向阻止癌细胞增殖或杀死分裂的细胞。
抗癌药在杀死癌细胞的同时也严重影响人体中那些维持人体功能必须的正常分裂细胞。因此，癌症研究的一个重要方向就是寻找能专一抑制癌细胞生长或杀死癌细胞而不影响正常细胞增殖的方法，这正是目前癌症治疗所需。
ErbBs是一类受体蛋白酪氨酸激酶。ErbB介导的细胞信号对胚胎发育和成体器官的功能具有重要作用。在细胞水平，ErbB受体介导细胞增殖、分化、迁移和细胞结构重塑的信号。存在四种结构相似的ErbB蛋白，即ErbB-1、ErbB-2、ErbB-3和ErbB-4。表皮生长因子(EGF)是识别并结合ErbB-1的配体之一。ErbB-3和ErbB-4能被多种配体识别，其中包括神经调节蛋白-1(NRG-1)。至今还未发现ErbB-2的配体。ErbB-2可以和ErbB-3、ErbB-4或ErbB-1形成异源二聚体，这些异源二聚体在NRG-1激活的细胞信号传导中起关键作用。
体内基因定位研究表明，ErbB-2基因或NRG-1基因失活，导致动物发育缺陷，均表现出颅神经节和心脏小梁发育缺陷。进一步研究发现，ErbB-3或ErbB-4基因失活小鼠也出现类似的发育缺陷。
除在发育中的作用外，ErbB-2基因在多种人腺瘤中扩增并导致其编码的ErbB-2蛋白过度表达。有关ErbB-2的研究发现，癌基因点突变促使ErbB-2同源二聚体形成，可使细胞内结构域的酪氨酸残基磷酸化。虽然在ErbB-2基因过度表达的人肿瘤细胞上没有发现相应的点突变发生，但ErbB-2增量促使同源二聚体形成，导致其细胞内结构域的酪氨酸残基磷酸化。因此假设该过程是触发细胞转化和(或)细胞生长的信号级联放大的起点，启动了肿瘤的发生。但，仍存在一些与ErbB-2同源二聚体启动肿瘤发生相矛盾的实验证据i)通过基因工程方法产生的ErbB-2突变体，可提高ErbB-2同源二聚体和自身磷酸化程度，却对细胞转化没有影响ii)一些与ErbB-2的胞外结构域结合的抗体，设想因促使ErbB-2同源二聚体的形成，会促进ErbB-2表达的肿瘤细胞的生长效应，却表现出抑制肿瘤细胞生长效应。上述数据表明ErbB-2同源二聚体不足以使促进细胞生长或细胞转化，而其他条件如特定二聚体或特定构象参与启动了肿瘤的发生。
ErbB-2与ErbB-3或ErbB-4受体结合形成异源二聚体。配体，神经调节蛋白-1(NRG-1)，具有两个独立的受体结合位点一个与ErbB-3或ErbB-4有较高的亲和性，另一个对所有ErbB蛋白有较低、不专一的亲和性。所以，将NRG-1与表达ErbB-3或ErbB-4和ErbB-2的细胞相接触时，会导致ErbB-3或ErbB-4和ErbB-2形成异源二聚体。但在无配体存在时，不清楚ErbB-2是否对其他ErbB蛋白具亲和性，它们的相互作用可能与肿瘤发生有关。在所有ErbB蛋白受体中，ErbB-3是独特的，在于i)ErbB-2较易和ErbB-3形成异源二聚体；ii)当用ErbB-2和ErbB-3同时转化细胞NIH3T3时获得的转化率比ErbB-2单独转化要高；iii)在ErbB-2过度表达的乳腺癌细胞中，ErbB-3也高表达；iv)在ErbB-2转基因小鼠中，ErbB-2高表达的肿瘤细胞，ErbB-3也高表达。
许多专利和专利申请公开了ErbB-2和(或)ErbB-3与肿瘤或癌症治疗相关的内容。例如，WO 00/78347公开了阻止或抑制细胞生长，尤其是阻止或抑制癌细胞生长的方法，该方法用阻止或减少ErbB-2/ErbB-3的异源二聚体的形成或干扰细胞中ErbB-2/ErbB-3的异源二聚体构象的药剂，达到阻止或抑制细胞生长。美国专利No.5,578,482涉及与erbB-2基因表达物结合的ErbB-2配体和其功能衍生物。美国专利No.5,820,859涉及筛选针对表达ErbB-3受体细胞治疗药物的方法。美国专利No.5,968,511涉及ErbB-3抗体。
在本技术领域，需要更有效和(或)更优性价比的与ErbB-3相关的肿瘤治疗方法。本发明涉及本技术领域的这方面及其相关需求。

发明内容
首先，本发明涉及预防、治疗和延缓哺乳动物肿瘤的方法。该方法包括用有效量的ErbB-3蛋白、功能片段，或编码ErbB-3蛋白、功能片段的核酸，给需要或希望使用的哺乳动物使用，使其产生免疫应答反应，以预防、治疗或延缓所述肿瘤。
其次，本发明涉及分离的核酸片段，分离的核酸片段包括编码ErbB-3胞外结构域的蛋白、功能片段的核苷酸序列，分离的核酸片段包括编码SEQID NO2(图5)、SEQ ID NO3(图11)、SEQ ID NO14中至少24-81氨基酸残基序列或SEQ ID NO16中至少2-139氨基酸残基序列的核苷酸序列。
第三，本发明涉及高度纯化的蛋白质或多肽，纯化的蛋白质或多肽包括ErbB-3胞外结构域的蛋白、功能片段，该ErbB-3胞外结构域的蛋白或功能片段包括SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO14中至少24-81的氨基酸残基序列或SEQ ID NO16中至少2-139的氨基酸残基序列。
第四，本发明涉及一种偶联物，该偶联物包括a)包含ErbB-3胞外结构域的蛋白、功能片段，该胞外结构域的ErbB-3蛋白或功能片段包括SEQ IDNO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO14中至少24-81的氨基酸残基序列或SEQID NO16中至少2-139的氨基酸残基序列；b)与ErbB-3胞外结构域的蛋白或功能片段直接或通过接头连接的促进剂，其中促进剂有助于i)亲和分离或纯化偶联物；ii)将偶联物吸附到表面上；或iii)检测偶联物。
第五，本发明涉及一种抗体，该抗体与ErbB-3胞外结构域的蛋白或功能片段的一个抗原决定部位结合。所述ErbB-3胞外结构域的蛋白或功能片段包括SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO14中至少24-81的氨基酸残基序列或SEQ ID NO16中至少2-139的氨基酸残基序列。
第六，本发明还提供了包括ErbB-3胞外结构域的蛋白或功能片段、编码ErbB-3胞外结构域的蛋白、功能片段的核酸，与ErbB-3胞外结构域的蛋白或功能片段结合的抗体组成的药物组合物和(或)疫苗。


图1.ErbB-3 cDNA序列(SEQ ID NO4)。
图2.限制性酶消化ErbB-3质粒。泳道11kb序列梯(NEB)，泳道2-9BamHI/XbaI对DNA进行鉴定消化。除泳道5的克隆外，其余克隆均正确。泳道10BamHI/XbaI对pCDNA3载体进行单独消化。
图3.ErbB3质粒的构建。
图4.分离和(或)纯化ErbB3蛋白及SDS-PAGE分析ErbB3蛋白。泳道1-4BSA对照，加样量依次是10μg、5μg、3μg、1μg。泳道5标准蛋白质，7708S，NEB。泳道6-7COS7诱导ErbB3蛋白表达。
图5.ErbB3的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。
图6.DE3-1 cDNA序列(SEQ ID NO5)。
图7.DE3-1质粒的构建。
图8.限制性内切酶消化DE3-1质粒。泳道1BamHI/XhoI消化DE3-1的pGEX4T-1。泳道2BamHI/XhoI消化DE3-1的pET32a。泳道31kb序列梯(NEB)。
图9.DE3-1的SDS-PAGE分析结果。泳道1、2、3、4分别依次为诱导前、诱导后、包涵体、超声处理后的上清。
图10.DE3-1蛋白的分离和(或)纯化以及SDS-PAGE分析。泳道1全蛋白。泳道2-8经过NTA组氨酸标记亲和层析柱的洗脱液。
图11.DE3-1氨基酸序列(SEQ ID NO3)图12.不同疫苗对FVB/N转基因小鼠发病率的作用。
图13.不同药物对小鼠肿瘤生长的作用(5周)。
图14.不同药物对肿瘤生长抑制率(5周)。
图15.DE3-1对小鼠乳腺癌生长的作用(5周)。
图16.DE3-1对肿瘤生长的抑制率的影响(5周)。
图17.ErbB2和ErbB3交叉免疫原性实验(ErbB3蛋白包被)。
图18.ErbB2和ErbB3交叉免疫原性实验(ErbB2蛋白包被)。
图19.ErbB3-f12的PCR结果。泳道2-3为192bp的ErbB3-f12基因片段。泳道1DNAmarker。
图20.ErbB3-f12表达的结果。泳道1Marker；泳道2空白载体转化菌；泳道3-8经IPTG诱导的目的蛋白。
图21.ErbB3-f12对肿瘤生长的抑制作用。
图22.ErbB3-f78对肿瘤生长的抑制作用。
图23.ErbB3-f12氨基酸序列(SEQ ID NO14)。
图24.ErbB3-f78 cDNA序列(SEQ ID NO15)。
图25.ErbB3-f78氨基酸序列(SEQ ID NO16)。
具体实施例方式
为清楚公开发明内容而不是限制发明，分以下小节详细说明。
A.释义除另有定义，这里使用的所有科技术语与本发明所属技术领域的普通技术人员理解含义相同。所有专利文献、专利申请文献、公开的专利文献和其它出版物均作为参考。如本节阐述的定义与上述参考文献所述的定义不一致或相反时，以本节阐述的定义为准。
在此所用“一个”的意思是“至少一个”或“一个或多于一个”。
在此所用“肿瘤”是指不正常的新生长，包括良性和恶性肿瘤。不同于增生，在没有原有刺激后，肿瘤仍会继续增殖。
在此所用“癌症”是指任何类型恶性肿瘤所致疾病的总称。
在此所用“恶性的”用于肿瘤，是指原发性肿瘤，其丧失生长控制和位置控制，具有转移能力。
在此所用“erb”指两种癌基因，erb A和erb B，与骨髓成红血细胞增多症病毒相关(一种急性的转化性逆转录病毒)。
在此所用“免疫反应”指生物体免疫系统对抗原应答反应。在脊椎动物体内，该过程可能涉及抗体产生，细胞介导的免疫反应，补体激活或免疫耐受性的形成。
在此所用“免疫反应增强剂”是指免疫反应中能增强抗原效应的物质。
在此所用“疫苗”是指具有免疫预防作用的任何组合物。疫苗可用于治疗、预防疾病，或预先或感染后以减轻病情。典型的疫苗包括，但不限于，如灭活的有毒菌株或减毒菌株(变种或突变体)的活菌体，微生物、真菌、植物、原生动物或后生动物的衍生物或产品。“疫苗”也包括由蛋白质/肽和核酸/寡聚核苷酸组成的疫苗。
在此所用“抗肿瘤药剂(与抗癌药剂含义相同)”是指用于抗肿瘤治疗的任何药剂。抗肿瘤药剂可单独或与其它化合物联合使用，能够减轻、减少、改善、预防或维持无临床症状状态，或用于肿瘤、癌症诊断的相关标志。抗肿瘤药剂可用在这里所述的方法、联合用药或组合物中。抗肿瘤药剂包括，如抗血管生成剂、烷化剂、抗代谢剂、天然产品、铂配位络合物、蒽二酮、取代尿素、甲肼衍生物、肾上腺皮质抑制剂、激素和拮抗剂、抗癌多聚糖和某种草药提取物例如中草药提取物，但抗肿瘤药剂不限于此。
在此所用“抗肿瘤治疗”是指任何减轻或改善肿瘤或癌症症状的治疗方法。预防肿瘤或癌症的发生或减轻其病情的治疗也包括在内。
在此所用“抗肿瘤药剂(或抗癌药剂)或抗肿瘤治疗”不包括ErbB-3蛋白、功能片段或编码ErbB-3蛋白、功能片段的核酸。但包括本领域技术人员所知减轻肿瘤、癌症症状的所有药剂和治疗手段。
在此所用“用于治疗特定疾病的化合物有效用量”是指足以改善或以某种方式减少与该疾病相关症状的用量。该用量可为单一剂量或根据疗程确定的有效剂量。该用量可以治愈疾病，但通常是减轻病情。为减轻病情，可能需要连续服用。
在此所用“治疗”的意思是使任何临床症状、不适或疾病的症状得到改善或有益改变的方法。治疗也包括任何药物组合物的应用。
在此，通过服用特定的药物组合物治疗达到特定不适的症状“改善”是指任何的减轻，不管是永久还是暂时，持续还是短暂，可归于或与服用药物组合物有关系。
在此所用“抗体”以广泛的含义使用，包括完整单克隆抗体、多克隆抗体、从至少两种完整抗体形成的多专一性抗体，例如双特异性抗体和只要表现期望的生物学活性的抗体片段。抗体可以是IgM、IgG，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4、IgD、IgA或IgE。
在此所用“抗体片段”包括完整抗体的一部分，通常是完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；双体、单链抗体分子以及由抗体片段形成的多专一性抗体。
在此所用“单克隆抗体”是指高度同源的抗体，即，除非发生极少量的自然突变，组成单克隆抗体群的抗体是相同的。单克隆抗体是高度专一的，只针对一个抗原位点。与典型的针对不同决定簇(抗原决定部位)的传统抗体(多克隆抗体)不同，每个单克隆抗体只针对抗原上的单一决定簇。除专一性外，单克隆抗体具有的优点是它们通过杂交瘤培养合成，不会被其它免疫球蛋白污染。
在此所用“多克隆抗体”是指就像在动物体内的情况相同，由几个B淋巴细胞克隆产生的抗体。通常是指出现在免疫动物体内的抗体，而单克隆抗体通常是由体外培养的单克隆B淋巴细胞的产物。
在此所用“杂交瘤”是指杂交细胞，其中肿瘤细胞为原始细胞之一。典型的杂交瘤是由T淋巴细胞或B淋巴细胞与适当的骨髓瘤细胞系形成杂交细胞，该杂交瘤产生单克隆抗体。
在此所用“人源化抗体”是指经过修饰含有“人的”氨基酸序列的抗体，人体使用时不引起免疫反应。这种抗体的制备方法是已知的。例如，用重组DNA技术改变表达单克隆抗体的杂交瘤细胞，使其表达人抗体非可变区的氨基酸序列。已有计算机程序用于区分这样的区域。
在此所用“重组方法生产”是指用重组核酸方法的生产方法。本方法是以众所周知的用克隆核酸表达其所编码蛋白质的分子生物学方法。
在此所用“互补的”当是指两个核酸分子的核苷酸序列能杂交，优选是低于25％，更优选是低于15％，更加优选是低于5％，最优选是在相对核苷酸处不存在错误配对。优选在严格条件下，这两个分子杂交。
在此所用决定错误配对百分率的“杂交的严格性”规定如下高严格性0.1xSSPE，0.1％SDS，65℃；中等严格性0.2xSSPE，0.1％SDS，50℃；(也指适度严格性)低严格性1.0xSSPE，0.1％SDS，50℃；应理解为使用对等的缓冲液、盐和温度，可以获得相当的严格性。
在此所用“载体(或质粒)”是指用于将外源DNA导入细胞进行表达或复制的不连续元件。本领域技术人员熟知选择及使用这些载体的方法。表达载体包括DNA表达载体，该载体有效与调控序列，例如启动子区域连接在一起调控该DNA片段的表达。所以，一个表达载体是指重组DNA或RNA构建物，例如质粒、噬菌体、重组病毒或其它载体，当它们导入适当的宿主细胞中，可使克隆的DNA表达。本领域技术人员清楚适当的表达载体、能在真核细胞和(或)原核细胞中复制的载体以及保持游离态或整合进宿主细胞基因组的载体。
在此所用“启动子区域或启动子元件”是指调控DNA或RNA转录并与其有效连接的DNA片段或RNA片段。启动子区域是RNA聚合酶识别、结合和转录起始的特定序列，这部分启动子区域特指启动子。同时，启动子区域还包括调控RNA聚合酶识别、结合和转录起始活动的序列。这些序列可以对顺式作用因子或对反式作用因子作出响应。根据调控性质，启动子可以是组成型或调控型。用于原核生物典型的启动子包括噬菌体T7和T3启动子和类似的启动子。
在此所用“有效连接和有效结合”是具有调控和效应功能的DNA，如启动子、增强子、转录和翻译终止位点及其它信号序列的核苷酸序列与功能的关系。例如，DNA和启动子的有效连接是指DNA和启动子间结构和功能的关系，RNA聚合酶能够专一识别启动子、结合和转录该段DNA，并从启动子开始该段DNA转录。为优化表达和(或)体外转录，有必要去掉、增加或改变克隆的5′不翻译部分，以消除多余、潜在不适当的替代性翻译(如起始)密码子或其它不论是在转录或翻译水平上干扰或减少表达的序列。而其它方法包括将核糖体结合位点共有序列紧接起始密码子的5′插入，可增强表达(参见，Kozak.生物化学杂志(J.Biol.Chem.)1991；26619867-19870)。这一纠正的愿望(或需要)可由经验来决定。
在此所用“蛋白质结合序列”是指具备与一组蛋白或多肽序列或特定蛋白或多肽序列的专一结合能力的蛋白或多肽。
在此所用“抗原决定部位标签”是指对应于抗原决定部位的氨基酸残基短序列，其有助于随后对“抗原决定部位标记”的蛋白或多肽的生物化学和免疫学分析。“抗原决定部位标签标记”是通过在合适表达载体的蛋白编码序列上附加“抗原决定部位标签”序列实现的。“抗原决定部位标记”的蛋白能使用由标签产生的高度专一性的抗体进行亲和纯化。
在此所用“蛋白A或蛋白G”是指能与许多IgG同形体的Fc区域结合的蛋白。蛋白A或蛋白G典型地存在于葡萄状球菌的某些菌株的细胞壁中。应在蛋白A或蛋白G中包含确实不影响其活性的保守氨基酸替代序列。
在此所用“核苷酸结合序列”是指具备与核苷酸序列、一组核苷酸序列或特定核苷酸序列的专一结合能力的蛋白或多肽序列。
在此所用“脂类结合序列”是指具备与脂类、一组脂类或特定脂类物质的专一结合能力的蛋白或多肽序列。
在此所用“多糖结合序列”是指具备与多糖、一组多糖或特定多糖物质的专一结合能力的蛋白或多肽序列。
在此所用“金属结合序列”是指具备与金属离子、一组金属离子或特定金属离子的专一结合能力的蛋白或多肽序列。
B.ErbB-3预防、治疗或延缓肿瘤的方法、本发明提供了预防、治疗和延缓哺乳动物肿瘤的方法。该方法包括用有效量的ErbB-3蛋白、功能片段，或编码ErbB-3蛋白及其功能片段的核酸，给需要或希望使用的哺乳动物使用，使其产生免疫应答反应，以预防、治疗或延缓所述肿瘤。
本发明的方法能用于任何哺乳动物肿瘤的预防、治疗或延缓，例如小鼠、大鼠、兔、猫、狗、猪、奶牛、牛、绵羊、山羊、马、猴子和其它非人的灵长类。本发明的方法优选用于人类肿瘤的预防、治疗或延缓。
任何能引发针对要治疗、预防或延缓的肿瘤出现免疫反应适当的ErbB-3蛋白、功能片段及编码ErbB-3蛋白或其功能片段的核酸，都能用于本方法中。ErbB-3可在细胞水平、体液水平或细胞及体液均引起免疫反应。例如，美国专利No.5,820,859公开的ErbB-3蛋白、功能片段，编码ErbB-3蛋白或其功能片段的核酸，能用于本方法中。其它，如来源于大鼠的ErbB-3蛋白、功能片段，编码ErbB-3蛋白或其功能片段的核酸(GenBank Accession No.U29339；Hellyer，等。基因(Gene)1995；165(2)279-284)，Fugu rubripes ErbB-3(GenBank Accession No.AF056116；Gellner，Brenner，基因组研究(GenomeRes.)1999；9(3)251-258)，人ErbB-3(GenBank Accession No.M29366；Kraus等。美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)1989；869193-9197)能够用于本方法中。人ErbB-3蛋白、功能片段，编码ErbB-3蛋白或其功能片段的核酸，优选用于本方法中。存在保守核苷酸序列替换但不严重影响其活性的任何ErbB-3蛋白或其功能片段能用于本方法中。
在优选实施方案中，施用有效量的ErbB-3胞外结构域的蛋白或功能片段，或编码ErbB-3胞外结构域的蛋白或功能片段的核酸。另一优选实施方案中，施用有效量ErbB-3蛋白或其功能片段包括SEQ ID NO1、SEQ ID NO14中至少24-81的氨基酸序列或SEQ ID NO16中至少2-139的氨基酸序列。在另一优选实施方案中，施用有效量ErbB-3胞外结构域的蛋白、功能片段，该ErbB-3胞外结构域的蛋白或功能片段包括SEQ ID NO2或SEQ ID NO3。
本方法还包括给哺乳动物施用免疫反应增强剂。免疫反应增强剂可在施用ErbB-3蛋白、功能片段，编码ErbB-3蛋白或其功能片段的核酸之前、同时或随后进行。典型的免疫增强剂包括卡介苗(BCG)(Ratliff，Eur.Urol.1992，217-21())、小棒状杆菌(Lillehoj et al.，Avian Dis.，37(3)73 1-40(1993))、布鲁菌流产胎提取物(Brucella abortus extract)、葡聚糖、左旋咪唑、双二乙氨乙基芴酮、酶、无毒病毒、多糖、药草提取物例如中草药提取物。
ErbB-3蛋白、功能片段，编码ErbB-3蛋白或其功能片段的核酸的使用配方、剂量和给药途径，尤其作为药物组合物时，可根据本技术领域普通技术人员所知的方法确定(参见Alfonso R.Gennaro，雷明顿药剂学科学与实践(RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy)，Mack出版社，1997年4月；Banga，治疗用多肽和蛋白的配方、加工和传递系统(TherapeuticPeptides and ProteinsFormulation，Processing，and Delivery Systems)，1999；Hovgaard和Frkjr，肽和蛋白制药配方的发展(Pharmaceutical FormulationDevelopment of Peptides and Proteins)，Taylor & Francis公司，2000；Lasic和Papahadjopoulos，脂质体的医学应用(Medical Applications of Liposomes)，Elsevier Science，1998；Jain，基因治疗教程(Textbook of Gene Therapy)，Hogrefe & Huber出版社，1998；Seth，腺病毒基因治疗的基本生物学(AdenovirusesBasic Biology to Gene Therapy)，15卷，Landes Bioscience，1999；Wu-Pong和Rojanasakul，生物制药的药物设计和发展(Biopharmaceutical Drug Design and Development)，Humana出版社，1999；治疗学上的血管发生Dole等，从基础科学到临床(Therapeutic AngiogenesisFrom Basic Science to the Clinic)，28卷，Springer-Verlag New York，1999)。ErbB-3蛋白或其功能片段，或者编码ErbB-3蛋白或其功能片段的核酸，可配制成用于口服，直肠给药，局部用药，吸入用药，口腔用药(例如舌下)，注射用药(例如，皮下、肌内、皮内、静脉用药)，经皮或其他适合的给药途径。在任何给定的情况下，最合适的给药途径取决于要治疗性质和严重程度以及所用的特定ErbB-3蛋白或其功能片段，或者编码ErbB-3蛋白或其功能片段核酸的性质。
ErbB-3蛋白、功能片段，编码ErbB-3蛋白或其功能片段的核酸，能用于哺乳动物任何适当的部位。优选地，ErbB-3蛋白、功能片段，或编码ErbB-3蛋白或其功能片段的核酸在原位给药，即用于肿瘤发生的地方或其邻近部位。优选地，本方法包括在肿瘤原位使用免疫反应增强剂。
ErbB-3蛋白、功能片段及编码ErbB-3蛋白或其功能片段的核酸，可单独使用，也可选择和优选与药物治疗上可接受的载体或者赋形剂共同使用。任何合适的药物治疗可以接受的载体或者赋形剂能用于本方法中(参见，Alfonso R.Gennaro，雷明顿药剂学科学与实践(RemingtonThe Science andPractice ot Pharmacy)，Mack出版社，1997年4月)。
本方法可单独使用，也可与其它抗肿瘤方法，例如放射治疗、化疗和手术治疗联合使用。本方法可与其它抗肿瘤药剂联合使用。其它抗肿瘤治疗方法或药剂能够用于ErbB-3蛋白或其功能片段，编码ErbB-3蛋白或其功能片段的核酸之前、同时或之后使用。如，ErbB-3蛋白、功能片段，编码ErbB-3蛋白或其功能片段的核酸能与抗肿瘤药剂共同使用。
任何合适的抗肿瘤药剂能用于本方法中。典型的抗肿瘤药剂包括抗血管生成剂(参见，Auerbach，Pharmacol.Ther.，1994，63(3)265-311)、烷化剂、抗代谢剂、天然产品、铂配位络合物、蒽二酮、取代尿素、甲肼衍生物、肾上腺皮质抑制剂、激素、拮抗剂、肿瘤基因抑制剂、肿瘤抑制基因或蛋白、抗癌基因抗体、抗癌基因反义寡聚核苷酸、抗癌细胞表面抗原抗体和其它抗肿瘤疫苗。
编码ErbB-3蛋白或其功能片段的核酸，任何肿瘤抑制基因能以裸露DNA、复合DNA、cDNA、质粒DNA、RNA或其它混合物形式作为基因转移系统的成分使用。在另一实施方案中，编码ErbB-3蛋白或其功能片段的核酸，或肿瘤抑制基因包含于病毒载体中。任何适合于基因治疗的病毒载体能联合使用。例如，腺病毒载体(美国专利No.5,869,305)、猴病毒载体(美国专利No.5,962,274)、条件复制型人免疫缺陷型病毒载体(美国专利No.5,888,767)、反转录病毒、猿猴病毒-40、单纯性疱疹病毒扩增子载体和牛痘病毒载体。而且，这些基因能转入非病毒载体系统，例如脂质体，脂质在凝聚过程中保护DNA或其它生物物质不受氧化。
本方法能用于治疗、预防或延缓任何肿瘤或癌症。优选地，本方法用于治疗、预防或延缓肿瘤或癌症，这里ErbB-2和ErbB-3的相互作用是导致肿瘤或癌症的发生、发展关键的原因。例如，本方法能用于治疗、预防或延缓肾上腺、肛门、听觉神经、胆小管、膀胱、骨、脑、乳房、脸颊、中枢神经系统、宫颈、结肠、耳、子宫内膜、食管、眼睛、眼睑、输卵管、胃肠道、头颈部、心脏、肾、喉、肝、肺、下颚、下颚外侧髁、上颌骨、口、鼻咽、鼻、口腔、卵巢、胰腺、腮腺、阴茎、耳廓、垂体、前列腺、直肠、视网膜、唾液腺、皮肤、小肠、脊髓、胃、睾丸、甲状腺、扁桃腺、尿道、阴道、耳蜗前庭神经和阴户肿瘤。优选地，本方法能用于治疗、预防或延缓乳腺、卵巢、胃、前列腺、结肠和肺部癌症。更优选地，本方法用于治疗、预防或延缓乳腺癌。
根据本发明，无论单独或与其它药剂、载体或赋形剂联合使用ErbB-3蛋白、功能片段，或者编码ErbB-3蛋白或其功能片段的核酸，可以任何给药途径，诸如海绵体内注射、皮下注射、静脉注射、肌肉注射、皮内注射、口服或局部用药。本方法可以单位剂量、一次用量针剂或备有添加防腐剂容器的多剂量制剂使用。该配方可以采用悬浊液，溶液或油质或水质赋形剂的乳浊液形式，并且可包含悬浮剂、稳定剂和(或)分散剂。例如，活性成分也可是粉状，在使用前与适合的载体、无菌不含热源的水或其他溶剂混合。本发明的局部用药可以采用泡沫状物、凝胶体、霜、药膏、透皮药膏或软膏。
用于本发明的药物学上可接受的组合物和方法包括但不限于美国专利Nos.5,736,154、6,197,801 B1、5,741,511、5,886,039、5,941,868、6,258,374 B1和5,686,102中。
用于治疗、预防的药物剂量大小将随治疗疾病的严重程度和给药途径变化。剂量和剂量频率也将根据病人自身年龄、体重、疾病状况和反应相适应。
主治医生应当知道怎样和何时由于药物毒性或副作用终止、中断或将治疗调整到低剂量。相反，医生应当知道怎样和何时由于临床作用不足(排除毒性副效应)将治疗调整到高水平。
任何适合的给药途径可以使用。剂型包括片剂、锭剂、扁囊剂、分散体、悬浊液、溶液、胶囊、药膏和类似形态(参考，雷明顿药物治疗科学)。
在实际应用时，ErbB-3蛋白、功能片段，编码ErbB-3蛋白或其功能片段的核酸可单独使用或作为活性成分与如β-环糊精和2-羟基-丙基-β-环糊精的药物治疗载体或赋形剂，根据传统药物混合技术形成紧密混合物与其它药剂联合使用。载体根据可能的使用方式，局部或注射用药，采取多种配制形式。在制备用于注射剂的组合物时，例如静脉注射或静脉输液，制药介质可使用水、乙二醇、油、缓冲液、糖、防腐剂、脂质体和其他本领域技术人员所知的介质。注射组合物的实例包括但不限于，5％w/v的葡萄糖、生理盐溶液或其他溶液。无论单独或是与其它药剂联合使用，待给药的ErbB-3蛋白、功能片段，编码ErbB-3蛋白或其功能片段的核酸的总剂量可以在瓶含有体积从1mL到2000mL的静脉注射液中使用。根据所用总剂量，稀释液体积有所变化。
本发明还提供了进行本发明治疗方案的试剂盒。该试剂盒包括置于一个或多个容器中的单独或与其它药剂联合使用的有效量的ErbB-3蛋白、功能片段，编码ErbB-3蛋白或其功能片段的核酸。优选的药物形式是与无菌生理盐水，葡萄糖溶液、缓冲液溶液或制药上可以接受的其它无菌液联合使用。该药物组合物可用冻干或干燥方法产生；试剂盒可包括存于一个容器中的药学上可接受的溶液、优选无菌液，以形成复合物注射溶液。典型的药学上可接受的溶液是生理盐水和葡萄糖溶液。
在另一个实施方案中，本发明的试剂盒包含用于注射组合物的无菌包装的注射针或注射器和(或)包装的酒精衬垫。适合于医生或病人使用本组合物的指示性说明包含在试剂盒中。
C.ErbB-3胞外结构域的蛋白或功能片段，编码ErbB-3胞外结构域的蛋白或其功能片段的核酸本发明涉及分离的核酸片段。在低、中和高严格条件下，分离的核酸片段与编码ErbB-3胞外结构域的蛋白或其功能片段的核苷酸序列或其互补链杂交，该ErbB-3胞外结构域的蛋白或其功能片段包括在SEQ ID NO2或SEQID NO3中所述的氨基酸序列，SEQ ID NO14中至少24-81的氨基酸序列或SEQ ID NO16中至少2-139的氨基酸序列。
在优选实施方案中，在高严格条件下分离的核酸片段与编码ErbB-3胞外结构域的蛋白或其功能片段的核苷酸序列或其互补链杂交，该ErbB-3胞外结构域的蛋白或其功能片段包括SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO14中至少24-81的氨基酸序列或SEQ ID NO16中至少2-139所述的氨基酸序列。在另外的优选实施方案中，分离的核酸片段包括编码ErbB-3蛋白的胞外结构域或其功能片段的核苷酸序列或其互补链，该ErbB-3胞外结构域的蛋白或其功能片段包括在SEQ ID NO2或SEQ ID NO3或SEQ ID NO14中至少24-81的氨基酸序列或SEQ ID NO16中至少2-139的所述的氨基酸序列。在另一优选的实施方案中，分离的核酸片段包括编码SEQ ID NO4(图1)或SEQ ID NO5(图6)中，SEQ ID NO14中至少24-81的氨基酸序列或SEQ IDNO16中至少2-139的所述的氨基酸序列所对应的核苷酸序列或其互补链。
分离的核酸片段可以适当的形式存在。例如，分离的核酸片段包括DNA、RNA、PNA或其衍生物。此外，分离的核酸片段可以包含DNA和RNA或其衍生物。分离的核酸片段能够是单链形式并且适合杂交分析。另外，分离的核酸片段也可以是双链形式并在杂交分析前变性成单链结构。
分离的核酸片段可以是遗传编码和(或)自然产生的寡聚核苷酸或核酸链的结构。分离的核酸片段包括非自然结构，例如非自然碱基，例如次黄嘌呤和黄嘌呤，非自然糖类，例如2’-甲氧基核酸，或非自然磷酸二酯键，例如甲基膦酸酯、偶磷酯和多肽。
分离的核酸片段能用任何适合的方法产生。例如，分离的核酸片段由化学合成(参见，Ausubel，分子生物学流行方法(Current Protocols in MolecularBiology)，2.11.寡核苷酸的合成和纯化(Synthesis and purification ofoligonucleotides)，John Wiley & Sons公司(2000))、自然物中分离、由重组方法产生或由上述方法结合产生。优选用重组方法产生分离的核酸片段。
分离的核酸片段因不同目的标记，例如方便检测、纯化和(或)与表面的附着。标记物可以是化学物、酶、免疫原、放射性物质、荧光物质、发光物质或荧光共振能量转移标记(FRET)。
本发明还提供了包括上述核酸片段的质粒。同时，提供了包括上述质粒的细胞，任何适合的细胞，例如，细菌细胞、酵母细胞、真菌细胞、植物细胞、昆虫细胞、动物细胞和人细胞。
本发明涉及生产ErbB-3胞外结构域的蛋白或其功能片段的方法，该方法包括培养表达ErbB-3胞外结构域的蛋白或其功能片段的细胞，以及回收表达的ErbB-3胞外结构域的蛋白或其功能片段。
本发明涉及高度纯化的蛋白质或肽，包括ErbB-3胞外结构域的蛋白或其功能片段，ErbB-3胞外结构域的蛋白或其功能片段包括SEQ ID NO2、SEQID NO3、SEQ ID NO14中至少24-81的氨基酸序列或SEQ ID NO16中至少2-139的氨基酸序列。任何合适的方法能产生ErbB-3胞外结构域的蛋白或其功能片段。例如，ErbB-3胞外结构域的蛋白或其功能片段能化学合成、从自然材料中分离、用重组方法产生或由上述方法结合生产。优选用重组方法生产ErbB-3胞外结构域的蛋白或其功能片段。
本发明涉及一种偶联物，该偶联物包括a)包括SEQ ID NO2、SEQ IDNO3、SEQ ID NO14中至少24-81的氨基酸序列或SEQ ID NO16中至少2-139的氨基酸序列的ErbB-3胞外结构域的蛋白或其功能片段b)与ErbB-3胞外结构域的蛋白或其功能片段直接或通过接头连接的促进剂，其中促进剂有助于i)亲和分离或纯化偶联物ii)将偶联物吸附到表面上或iii)检测偶联物。该偶联物可以是一种融合蛋白。当该偶联物是一种融合蛋白时，促进剂还可以是i)在细胞内合成后的亚细胞定位序列ii)增强免疫原性的序列或iii)其它蛋白类的肿瘤抗原。此外，ErbB-3蛋白或其功能片段和促进剂能够用其他方法连接。当偶联物是融合蛋白时，同时也包括编码融合蛋白的核酸。
偶联物能用化学偶联产生，例如通过硫醇连接。但优选用重组方法，如融合蛋白。在融合蛋白中，多肽或多肽片段连接到ErbB-3蛋白的胞外结构域或其功能片段的氨基端(N-端)或羧基端(C-端)。在化学偶联物中，多肽或多肽片段可以连接在影响偶联物的任何地方，多个多肽或多肽片段连接到一个、多个ErbB-3蛋白或功能片段上。
本领域技术人员熟知影响偶联反应的所有方法。如下所述，偶联反应能够受到通过共价键、离子键或其他合适连接的化学方法影响。例如，可使用在WO 01/02600中公开的偶联反应的试剂和方法。
在一些实施例中，偶联物是融合蛋白。该偶联物能够通过从融合蛋白的蛋白或多肽片段与亲和吸附成分之间的亲和吸附予以分离或纯化。任何一种亲和作用可用于分离或纯化融合蛋白。亲和作用，包括但不限于，蛋白/蛋白、蛋白/核苷酸、蛋白/脂类、蛋白/多糖或者蛋白/金属间的相互作用。
在其它实施例中，偶联物能够吸附到表面上。更优选地，偶联物能够通过偶联物上的促进剂和吸附表面的亲和吸附成分之间的亲和吸附到表面上。任何一种亲和作用能够用于吸附偶联物，包括蛋白/蛋白、蛋白/核苷酸、蛋白/脂类、蛋白/多糖或者蛋白/金属间的相互作用。
本发明涉及一种药物组合物，该药物组合物包括分离的核酸片段和药学上可以接受的载体或赋形剂。该分离的核酸片段在低、中和高严格条件下与编码ErbB-3胞外结构域的蛋白或功能片段的核苷酸序列或其互补链杂交，该ErbB-3胞外结构域的蛋白或功能片段包括SEQ ID NO2或SEQ ID NO3或SEQ ID NO14中至少24-81的氨基酸序列或SEQ ID NO16中至少2-139的氨基酸序列。优选地，该分离的核酸包括编码ErbB-3胞外结构域的蛋白或功能片段，包括编码SEQ ID NO2或SEQ ID NO3或SEQ ID NO14中至少24-81的氨基酸序列或SEQ ID NO16中至少2-139氨基酸序列的核苷酸序列或其互补链。药物组合物可以进一步包括免疫反应增强剂和(或)抗肿瘤药剂。也包括上述分离的核酸片段或与免疫反应增强剂混合疫苗。
本发明涉及药物组合物，该药物组合物包括高度纯化的蛋白质或肽和药学上可接受的载体或赋形剂，该蛋白质或肽包括ErbB-3胞外结构域的蛋白或功能片段，ErbB-3胞外结构域的蛋白或功能片段包括SEQ ID NO2或SEQ IDNO3或SEQ ID NO14中至少24-81的氨基酸序列或SEQ ID NO16中至少2-139的氨基酸序列。药物组合物可以是免疫反应增强剂和(或)抗肿瘤药剂。也包括由上述高度纯化的蛋白质或肽单独或高度纯化的蛋白质与免疫反应增强剂组成的疫苗。
本发明涉及一种抗体，该抗体与ErbB-3胞外结构域的蛋白或功能片段，包括SEQ ID NO2或SEQ ID NO3或SEQ ID NO14中至少24-81的氨基酸序列或SEQ ID NO16中至少2-139的氨基酸序列的抗原决定部位结合。优选方式，该抗体专一与ErbB-3胞外结构域的蛋白或功能片段，包括SEQ ID NO2或SEQ ID NO3或SEQ ID NO14中至少24-81的氨基酸序列或SEQ IDNO16中至少2-139的氨基酸序列抗原决定部位结合。
抗体可以任何适合形式存在。例如，抗体可以是单克隆、多克隆、嵌合、单链、人或人源化的抗体(参见，美国专利No.5,968,511)。不同形式的抗体可根据本领域技术人员所知的任何方法制备(参见，Coligan等，免疫学流行方法(Current Protocols in Immunology)，John Wiley & Sons公司(2000)。同时，包括上述抗体或上述抗体与抗肿瘤药剂和药学上可接受的载体或赋形剂组成的药物组合物。
实施例以下为进一步说明发明的实施例。
本发明人提供了ErbB3、DE3-1、rhErbB3-f12、rhErbB3-f78在治疗人类乳腺癌等癌症的方法。
本发明人发现ErbB3、DE3-1、rhErbB3-f12、rhErbB3-f78可显著降低人类乳腺癌等肿瘤的发生率。
本发明人提供了用ErbB3、DE3-1、rhErbB3-f12、rhErbB3-f78预防人类乳腺癌等高危人群的显著降低肿瘤发生率的方法。
本发明人发现ErbB3、DE3-1、rhErbB3-f12、rhErbB3-f78对人类乳腺癌等有显著延迟肿瘤发生的作用。
本发明人发现ErbB3、DE3-1、rhErbB3-f12、rhErbB3-f78对人类乳腺癌等肿瘤具有显著抑制生长的作用。
本发明人提供了通过机体免疫应答反应抑制乳腺癌等癌细胞生长的方法。
上述细胞可以是肿瘤细胞、人乳腺癌细胞及其它ErbB-2/ErbB-3高表达的癌细胞。
DE3-1、rhErbB3-f12、rhErbB3-f78为大肠杆菌表达蛋白；ErbB3为真核细胞表达或以其他方法产生，ErbB-3可以是ErbB-3蛋白或其功能片段。
不同方式产生、一定剂量ErbB-3疫苗抑制肿瘤生长，可用于乳腺癌等癌症的治疗。
上述癌症包括乳腺癌、卵巢癌、胃癌、前列腺癌、直肠癌和肺癌等。
为更清楚理解本发明，详细说明如下。
一.方法(一)ErbB3、DE3-1、rhErbB3-f12、rhErbB3-f78的制备本研究所涉及的疫苗包括以ErbB-2细胞膜外蛋白及膜外蛋白片段，在这里分别称为B2、SD32。ErbB-3细胞膜外区蛋白及蛋白片段，在这里分别称为B3、DE3-1、rhErbB3-f12、rhErbB3-f78；上述蛋白及蛋白片段由上海泽生科技开发有限公司制备。B3、DE3-1、rhErbB3-f12及rhErbB3-f78的制备方法如下1.B3制备B3为编码ErbB-3细胞膜外区蛋白的cDNA序列，见图1。PCR方法扩增，引物序列为引物1，5’TCTGCGGAGTCATGAGGGC(SEQ ID NO6)引物2，3’TCACTTGTCGTCATCGTCCTTGTAGTCTTTGCCGATCAGCACCAGTGT(SEQ IDNO7)其中斜体部分为flag序列。
经PCR扩增后，目的基因克隆至pMD-18T载体中，转化子经酶切及测序鉴定正确(图2)，用BamHI/SalI切出，连接至pCDNA3BamHI/xhoI中。
高效表达工程菌建立和筛选取经PCR和酶切鉴定的工程菌克隆，进行15％SDS-PAGE电泳、薄层扫描分析、Western-blotting鉴定，经反复筛选获得一株稳定高表达工程菌。ErbB3蛋白纯化，亲和层析纯化，见图4。经氨基酸序列测定纯化的目的蛋白，ErbB3蛋白氨基酸序列见图5。
2.DE3-1制备PCR扩增目的基因为编码ErbB-3膜外蛋白片段的cDNA序列(cDNA序列白Genebank)，序列见图6；表达质粒的构建将目的基因片段从pGEX4T-1载体(Phamacia公司)中用BamHI/XhoI切出，连接入pET32a载体(Novagen公司)BamHI/XhoI中，此蛋白以T7启动子驱动表达，N端与Trx.Tag，HisTag及S-Tag融合，图谱见图7。质粒构建酶切验证见图8。
DE3-1蛋白表达将质粒转入BL21菌株，接种菌株到5ml LB+AP中，过夜；1∶100接种到温热的LB+AP中，37℃，2.5-3hrs(OD＝0.6)；经IPTG诱导37℃，3hrs或30℃、8hrs；4℃离心，6K、10min；去上清，将沉淀置冰上；用冷的1/20菌液体积的PBS悬浮，后用超声破碎；4℃离心，12K，10min可得大量34KD的目的蛋白(见图9)。DE3-1蛋白纯化DE3-1蛋白出现在包涵体中，经6M盐酸胍溶解后，透析到NTA-O缓冲液(Histag纯化溶液)，复性情况良好。用Histag亲和层析柱纯化(购自博彩公司)见图10，纯化DE3-1蛋白经氨基酸序列测定，与目的蛋白序列一致。氨基酸序列见图11。
3.制备rhErbB3-f12、rhErbB3-f78(SEQ ID NO16)rhErbB3-f12基因(SEQ ID NO14)是编码的ErbB-3细胞膜外区蛋白片段的cDNA序列，以PCR方法扩增。引物序列为P15’-TGGCCA TGGACATCAAGC ATAATCGGCC-3’(SEOIDNO12)(1645-1664)Nco1P23’GTGCTC GAGAGGCTCCCCATTCAGAAAG-5’(SEQIDNO13)(1800-1818)Xho1(二)B3及DE3-1抗瘤效应研究1.B3及DE3-1预防肿瘤发生的作用选用8-10周龄的FVB/N转neu基因小鼠(购自Jackson Lab.USA)，分为5组，每组40只，分为对照组、B2、SD32、B3及DE3-1组。分别用BSA、B2、SD32、B3及DE3-1与完全弗氏佐剂(CFA，complete Freud’s adjuvant，购自Sigma公司)混合后，每20天腹腔注射1次，共7次。BSA、B2、SD32、B3及DE3-1剂量每次分别为10、5、10、5、10μg/只。每周1次检查发病情况，确定肿瘤发生情况并统计分析。
2.B3、DE3-1对肿瘤治疗作用移植肿瘤模型，选用经免疫组化检测neu蛋白高表达的FVB/N转基因小鼠自发性肿瘤，取1000mm3左右肿瘤块，用尼龙网将肿瘤块磨成单个细胞，每只FVB/N转基因小鼠注射细胞量为5×106个，乳腺下注射接种。接种后10-14天左右，对照组可触及(＞5mm)肿瘤出现，造模即成功。
实验分为对照组，不作任何处理；SD32实验组、B3实验组在接种24小时后，开始用SD32和B3疫苗进行治疗，分别将上述疫苗吸附在0.1mg/ml的Al(OH)3上，小鼠皮下多点注射；每两周1次，共3次；第3次用药14天后结束实验。每周1次检查发病情况，用游标卡尺测量每周测量肿瘤大小，以肿瘤体积(长径×短径2/2)代表其大小，并绘肿瘤生长曲线。
实验结束后取出肿瘤称重并计算抑制率，抑制率＝[(对照组肿瘤重量-实验组肿瘤重量)/对照组肿瘤重量]×1003.不同剂量DE3-1、rhErbB3-f12、rhErbB3-f78对肿瘤治疗作用移植肿瘤模型制作方法同上(B3及DE3-1疫苗对肿瘤免疫治疗作用研究)。动物分组分别为空白对照组为移植性肿瘤模型未加任何处理、阴性对照组注射histag蛋白；阳性对照组以阿霉素(汕头明治医药有限公司)治疗，DE3-1实验组分为5μg、20μg、80μg剂量处理。
接种1天后，阳性对照组，腹腔注射阿霉素，2.2mg/Kg，连续用药7天；阴性对照组腹腔注射histag蛋白+Al(OH)3；DE3-1实验组，DE3-1疫苗吸附在0.1mg/ml的Al(OH)3上，小鼠皮下多点注射免疫进行免疫治疗，每两周用药1次，共3次。第3次用药14天后结束实验。每周检查1次发病情况，用游标卡尺测量测量肿瘤大小，以肿瘤体积(长径×短径2/2)代表其大小，并绘肿瘤生长曲线，进行统计分析。
实验结束后取出肿瘤称重并计算抑制率，抑制率＝[(对照组肿瘤重量-实验组肿瘤重量)/对照组肿瘤重量]×100，进行统计分析。
4.B2和B3交叉免疫原性实验用B2蛋白和B3蛋白分别免疫FVB转基因小鼠，免疫10天后，取血，用ELISA方法测其抗体滴度。用0.3μg/孔的B2和B3分别包被，在每个板上分别测定1∶1000稀释的B2和B3以及B2和B3标准血清，在37℃孵育30分钟，后用1％BSA封闭，加用二抗，用DAD显色15分钟，Bio-Rad酶标仪，450m，检测。
二.结果1.B3及DE3-1抑瘤效应研究实验结果见表1、图12
表1.B3及DE3-1抑瘤效应分组数量(只)处理剂量(μg/只/次)肿瘤发生时间(周) 肿瘤发生率(％)阴性对照组40 BSA+CFA101937.5B2实验组40 B2+CFA 5 2112.5SD32实验组40 SD32+CFA 102210B3实验组40 B3+CFA 5 2012.5DE3-1实验组 40 DE3-1+CFA102335本实验目的是了解B3及DE3-1疫苗是否对肿瘤的发生具有预防作用。选用FVB/N转基因小鼠是该转基因小鼠在小鼠乳腺病毒启动子控制的大鼠野生型neu cDNA转入小鼠体内，使neu蛋白高表达，约在5-8个月内自发生成乳腺癌，发生率约为50％。该转基因小鼠发病过程及病理类型与人类乳腺癌发病过程相似。样本为每组40只，目的是确保每组肿瘤发生个数＞10只，使其具有统计学意义。剂量选择是根据预实验结果而定的。
用BSA、B2、B3、SD32、DE3-1分别免疫转基因小鼠，从19周开始阴性对照组有肿瘤发生，肿瘤发生率为37.5％。而SD32、B3、B2组肿瘤发生开始发生的时间分别为第21、22及20周，肿瘤的发生率分别为10％、12.5％、12.5％，SD32、B3、B2疫苗对肿瘤的发生具有显著的抑制作用(P＜0.025；x2检验)。同时，肿瘤的发生时间也显著延迟。DE3-1组比对照组肿瘤发生时间晚，但肿瘤发生率和对照组相比没有显著差异(P＞0.05；x2检验)。
2.抗肿瘤效应研究B3疫苗抗肿瘤效应研究实验结果见表2及图13-14表2.B3及DE3-1抗肿瘤效应分组处理肿瘤体积(mm3) 肿瘤重量(g)抑制率(％)阴性对照组 histag蛋白+Al(OH)37849.8±849.85.76±0.55SD32实验组 SD32+Al(OH)34246.5±540.63.28±0.3646B3实验组 B3+Al(OH)35271.8±658.93.13±0.3333为确定B3疫苗在肿瘤治疗的作用，用B3疫苗用于移植性肿瘤模型进行免疫治疗研究。
表2及图13-14为不同疫苗对小鼠肿瘤生长的影响，显示SD32、B3对肿瘤生长的抑制率分别为46％、33％，显示它们均对肿瘤的生长有显著抑制作用(P＜0.01；t检验)。
3.抗肿瘤效应研究为确定不同剂量的DE3-1对肿瘤的免疫治疗作用，并为临床应用寻找合适治疗剂量，每次5μg、20μg、80μg/只免疫小鼠，实验结果见表3及图15-16。
表3.DE3-1抗肿瘤效应分组数量 处理肿瘤体积(mm3) 肿瘤重量(g)抑制率％空白对照组 8 6742.9±657.84.769±0.56阴性对照组 8 histag蛋白+Al(OH)36476.9±567.94.461±0.52阳性对照组 8 ADR 2.2mg/kg4603.1±478.33.564±0.42 25.3DE3-1实验组8 80μgDE3-1+A1(OH)34810.8±460.53.658±0.37 26.3DE3-1实验组8 20μgDE3-1+Al(OH)34715.0±434,83.455±0.41 28.9DE3-1实验组8 5μgDE3-1+A1(OH)35563.7±600.63.687±0.45 22.4不同剂量DE3-1对肿瘤的生长抑制率与所测体积结果一致，20μg剂量组效果最好，抑制率达28.9％左右。实验结束处死小鼠，取出肿瘤，称重量。统计分析阳性对照组、各剂量组与阴性对照和空白对照有显著差别(P＜0.001，t test)。它们在第6周实验结束时5μg、20μg、80μg剂量组对肿瘤的抑制率分别为26.3％、22.4％和28.9％。
表4.rhErbB3-f12对FVB/N转neu基因小鼠移植瘤的抑制作用分组 动物数剂量mg/kg给药方案肿瘤重量(g)抑瘤率(％)阴性对照14sc×3q14d5.55±1.25阳性对照(Taxol) 710 ip×7qd3.09±1.08*44.32rhErbB3-f12 71sc×3q14d2.40±0.49*56.76rhErbB3-f12 70.5sc×3q14d2.62±0.67*52.61rhErbB3-f12 70.25 sc×3q14d2.31±0.40*58.39*试验组与阴性对照组相比，P＜0.01表5.rhErbB3-f78对FVB/N转neu基因小鼠移植瘤的抑制作用分组动物数剂量mg/kg给药方案肿瘤重量(g)抑瘤率(％)阴性对照14 2.5 sc×3q14d1.098±0.17阳性对照(ADM) 72 ip×7qd0.648±0.27*40.98rhErbB3-f78 72.5 sc×3q14d0.435±0.12*60.384.B2和B3交叉免疫原性实验该实验是为了解属于同一家族的ErbB-2和ErbB-3蛋白两者之间是否具有交叉免疫原性。结果见图17-18，可知ErbB-2和ErbB-3二者之间没有交叉免疫原性。
三.小结本发明中，发明人发现具有广泛应用前景的新型肿瘤疫苗B3、DE3-1、rhErbB3-f12及rhErbB3-f78，这些肿瘤疫苗均基于ErbB-3设计、具有预防肿瘤发生及对肿瘤免疫治疗作用。
在部分腺癌中，ErbB-2受体高表达。因而认为ErbB-2高表达是部分腺癌发生的主要原因，其证据包括1)乳腺癌、卵巢癌等肿瘤细胞中存在ErbB-2基因的扩增而导致ErbB-2的高表达2)ErbB-2高表达导致细胞内功能区的磷酸化影响细胞内信号分子Shc与ErbB-2的相互作用3)用野生型ErbB-2转染成纤维细胞，导致细胞转化4)能增强ErbB-2同源二聚体形成的ErbB-2变异体增强细胞转化活力。
本发明人此前的专利阐明ErbB-3为抗癌靶标，ErbB-2受体和ErbB-3受体形成异源二聚体是癌症发生的原因。使我们有了新的抗癌方法，以ErbB-3细胞膜外区蛋白或功能片段为肿瘤疫苗用于癌症的预防及治疗，可降低肿瘤发生率并抑制肿瘤生长。
多种肿瘤的发生与ErbB-2高表达有关，针对ErbB-2为靶标的人源化单克隆抗体-herceptin已获成功。ErbB-2和ErbB-4受体在心肌细胞共表达，导致ErbB-2/ErbB-4异源二聚体的形成，该异源二聚体对维持心肌细胞的正常结构及功能非常重要，针对ErbB-2受体的herceptin会破坏心肌细胞而致病人心力衰竭。而针对ErbB-3受体的治疗手段则无此副作用。因此，针对ErbB-3受体的治疗在乳腺癌、卵巢癌、胃癌、前列腺癌、直肠癌和肺癌等预防及治疗具重要的价值。
上述实施例是说明本发明而不是限定发明的范围，因而各种变化是可能的。而改变和变化实施例对本领域技术人员是显而易见的，所以本发明仅受权利要求书的限制。
序列表<110>上海泽生科技开发有限公司<120>ERBB3用于肿瘤治疗的方法和组合物<130>CPCNZ42209<160>16<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>1342<212>PRT<213>人类(Homo sapiens)<400>1Met Arg Ala Asn Asp Ala Leu Gln Val Leu Gly Leu Leu phe Ser Leu1 51015Ala Arg Gly Ser Glu Val Gly Asn Ser Gln Ala Val Cys Pro Gly Thr202530Leu Asn Gly Leu Ser Val Thr Gly Asp Ala Glu Asn Gln Tyr Gln Thr354045Leu Tyr Lys Leu Tyr Glu Arg Cys Glu Val Val Met Gly Asn Leu Glu505560Ile Val Leu Thr Gly His Asn Ala Asp Leu Ser Phe Leu Gln Trp Ile65 707580Arg Glu Val Thr Gly Tyr Val Leu Val Ala Met Asn Glu Phe Ser Thr859095Leu Pro Leu Pro Asn Leu Arg Val Val Arg Gly Thr Gln Val Tyr Asp100 105 110Gly Lys Phe Ala Ile Phe Val Met Leu Asn Tyr Asn Thr Asn Ser Ser115 120 125His Ala Leu Arg Gln Leu Arg Leu Thr Gln Leu Thr Glu Ile Leu Ser130 135 140
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1.一种预防、治疗或延缓哺乳动物肿瘤的方法，该方法包括用有效量的ErbB-3蛋白、功能片段，或编码ErbB-3蛋白及其功能片段的核酸，给需要或希望使用的哺乳动物施用，使其产生免疫应答反应，以预防、治疗或延缓所述肿瘤。
2.权利要求1所述的方法，其中所述哺乳动物是人类。
3.权利要求1所述的方法，其中施用有效量的ErbB-3胞外结构域的蛋白、功能片段，或编码ErbB-3胞外结构域的蛋白、功能片段的核酸。
4.权利要求1所述的方法，其中所述ErbB-3蛋白包括SEQ ID NO1中或SEQID NO14中至少24-81或SEQ ID NO16中至少2-139的氨基酸序列。
5.权利要求1所述的方法，其中所述ErbB-3胞外结构域的蛋白或其功能片段包括SEQ ID NO2或SEQ ID NO3中所述的氨基酸序列。
6.权利要求1所述的方法，还包括给哺乳动物施用免疫反应增强剂。
7.权利要求1所述的方法，其中所述ErbB-3蛋白或其功能片段，或者编码ErbB-3蛋白或其功能片段的核酸，是原位用于肿瘤。
8.权利要求7所述的方法，还包括对肿瘤原位使用免疫反应增强剂。
9.权利要求1所述的方法，其中所述ErbB-3蛋白或其功能片段，或者编码ErbB-3蛋白或其功能片段的核酸，是与药学上可接受的载体和赋形剂共同使用。
10.权利要求1所述的方法，其中所述ErbB-3蛋白或其功能片段，或者编码ErbB-3蛋白或其功能片段的核酸，是与抗肿瘤药剂共同使用。
11.权利要求10所述的方法，其中所述抗肿瘤药剂选自抗血管生成剂、烷化剂、抗代谢剂、一种自然产品、铂配位络合物、蒽二酮、取代尿素、甲肼衍生物、肾上腺皮质抑制剂、激素、拮抗剂、癌基因抑制剂、肿瘤抑制基因或蛋白、抗肿瘤基因抗体、抗肿瘤基因反义寡聚核苷酸、抗癌细胞表面抗原抗体和其它抗肿瘤疫苗。
12.权利要求1所述的方法，其中被预防、治疗或延缓的肿瘤选自肾上腺、肛门、听觉神经、胆小管、膀胱、骨、脑、乳房、脸颊、中枢神经系统、宫颈、结肠、耳、子宫内膜、食管、眼睛、眼睑、输卵管、胃肠道、头颈部、心脏、肾、喉、肝、肺、下颚、下颚外侧髁、上颌骨、嘴、鼻咽、鼻子、口腔、卵巢、胰腺、腮腺、阴茎、耳廓、垂体、前列腺、直肠、视网膜、唾液腺、皮肤、小肠、脊髓、胃、睾丸、甲状腺、扁桃腺、尿道、阴道、耳蜗前庭神经和阴户肿瘤。
13.权利要求1所述的方法，其中预防、治疗或延缓的肿瘤选自乳房、卵巢、胃、前列腺、结肠和肺部癌症。
14.权利要求1所述的方法，其中预防、治疗或延缓的肿瘤是乳腺癌。
15.一种分离的核酸片段，该核酸片段包括编码a)ErbB-3胞外结构域的蛋白或其功能片段，包括SEQ ID NO2或SEQ IDNO3中所述的氨基酸序列；或b)SEQ ID NO14中至少24-81氨基酸序列；或c)SEQ ID NO16中至少2-139氨基酸序列。
16.权利要求15所述的分离的核酸片段，其中所述核酸是DNA。
17.权利要求15所述的分离的核酸片段，其中所述核酸是RNA。
18.一种质粒，该质粒包括权利要求16所述的核酸片段。
19.一种细胞，该细胞包括权利要求18所述的质粒。
20.权利要求19所述的细胞，选自细菌细胞、酵母细胞、真菌细胞、植物细胞、昆虫细胞、动物细胞和人细胞。
21.一种产生ErbB-3胞外结构域的蛋白或功能片段的方法，该方法包括培养权利要求19所述的细胞，该细胞表达ErbB-3胞外结构域的蛋白或功能片段的条件下以回收表达的ErbB-3胞外结构域的蛋白或功能片段。
22.一种高度纯化的蛋白或多肽，该蛋白或多肽包括a)ErbB-3胞外结构域的蛋白或其功能片段，包括SEQ ID NO2或SEQ IDNO3中所述的氨基酸序列；或b)SEQ ID NO14中至少24-81所述的氨基酸序列；或c)SEQ ID NO16中至少2-139所述的氨基酸序列。
23.一种偶联物，该偶联物包括a)一种蛋白或多肽，包括i.ErbB-3胞外结构域的蛋白或功能片段，包括SEQ ID NO2或SEQ IDNO3中所述的氨基酸序列；ii.SEQ ID NO14中至少24-81所述的氨基酸序列；或iii.SEQ ID NO16中至少2-139所述的氨基酸序列；和b)一种与ErbB-3胞外结构域的蛋白或其功能片段直接或通过接头连接的促进剂，其中所述促进剂有助于i)亲和分离或纯化偶联物；ii)将偶联物吸附到表面上；或iii)检测偶联物。
24.权利要求23所述的偶联物，该偶联物是一种融合蛋白。
25.一种药物组合物，该组合物包括权利要求15所述的分离的核酸片段和药学上可接受的载体和赋形剂。
26.权利要求25所述的药物组合物，还包括免疫反应增强剂和(或)抗肿瘤药剂。
27.一种药物组合物，该组合物包括权利要求22所述纯化的蛋白或肽和药学上可接受的载体和赋形剂。
28.权利要求27所述的药物组合物，还包括免疫反应增强剂和(或)抗肿瘤药剂。
29.一种抗体，该抗体可结合a)ErbB-3胞外结构域的蛋白、功能片段的抗原决定部位，包括SEQ IDNO2或SEQ ID NO3的氨基酸序列；b)SEQ ID NO14中至少24-81的氨基酸序列的抗原决定部位；c)SEQ ID NO16中至少2-139的氨基酸序列的抗原决定部位。
30.权利要求29所述的抗体，是多克隆抗体或单克隆抗体。
31.权利要求29所述的抗体，是人抗体或人源化抗体。
32.一种药物组合物，该组合物包括权利要求29所述抗体和药学上可接受的载体和赋形剂。
33.权利要求32所述的药物组合物，还包括抗肿瘤药剂。
34.一种疫苗，该疫苗包括权利要求15所述的分离核酸片段。
35.权利要求34所述的疫苗，还包括免疫反应增强剂。
36.一种疫苗，该疫苗包括权利要求22中所述的基本上纯化的蛋白或多肽。
37.权利要求37所述的疫苗，还包括免疫反应增强剂。
38.一种试剂盒，该试剂盒包括置于容器中的权利要求15所述的分离的核酸片段和该分离的核酸片段用于肿瘤预防、治疗和延缓的使用说明。
39.一种试剂盒，该试剂盒包括置于容器中的权利要求22中所述的基本上纯化的蛋白或肽和该基本上纯化的蛋白或多肽用于预防、治疗和延缓肿瘤的使用说明。
40.一种组合物，该组合物包括权利要求15所述分离的核酸片段和抗肿瘤药剂。
41.权利要求40所述的组合物，还包括药学上可接受的载体和赋形剂。
42.一种组合物，该组合物包括权利要求22所述的基本上纯化的蛋白或肽和抗肿瘤药剂。
43.权利要求42所述的组合物，还包括药学上可接受的载体和赋形剂。
全文摘要
本发明涉及治疗哺乳动物肿瘤尤其是人类肿瘤的组合物和方法。更具体说，本发明涉及ErbB－3蛋白或其功能片段、编码ErbB－3蛋白或其功能片段的核酸，用于预防、治疗或延缓哺乳动物肿瘤的方法。同时，本发明提供了分离的编码ErbB－3胞外结构域的蛋白、功能片段的核酸，高度纯化的ErbB－3胞外结构域的蛋白、功能片段，以及与ErbB－3胞外结构域的蛋白或功能片段的抗原决定部位结合的抗体。本发明还提供包括ErbB－3胞外结构域的蛋白或功能片段、编码ErbB－3胞外结构域的蛋白、功能片段的核酸、与ErbB－3胞外结构域的蛋白或功能片段结合抗体组成的药物组合物和(或)疫苗。
文档编号C12P21/08GK1650011SQ03806762
公开日2005年8月3日 申请日期2003年3月26日 优先权日2002年3月26日
发明者周明东 申请人:上海泽生科技开发有限公司