结合HER3 β-发夹的HER3抗原结合蛋白的制作方法
【专利说明】结合HER3 发夹的HER3抗原结合蛋白
[0001] 本发明涉及结合HER3 e -发夹的抗HER3抗原结合蛋白（例如抗HER3抗体），用 于选择这些抗原结合蛋白的方法，它们的制备及作为药物的用途。
[0002] 发明背景
[0003] HER蛋白质家族由4个成员组成：HER1，也称作表皮生长因子受体（EGFR)或 ErbB-1 ;HER2,也称作 ErbB-2 ;ErbB-3,也称作 HER3 ;和 ErbB-4,也称作 HER4。ErbB 家族蛋 白质是受体酪氨酸激酶且代表细胞生长、分化和存活的重要介导物。ffiR家族蛋白质代表不 同配体（像神经调蛋白（NRG)家族、双调蛋白、EGF和TGF-a)的受体。调蛋白（也称作HRG 或神经调蛋白NRG-1)是例如HER3和HER4的配体。
[0004] 人 HER3 (ErbB-3, ERBB3, c-erbB-3, c-erbB3,受体酪氨酸蛋白质激酶 erbB-3, SEQ ID NO:3)编码受体酪氨酸激酶的表皮生长因子受体（EGFR)家族的一个成员，该家族还 包括 HER1(也称作 EGFR)、HER2、和 HER4 (Kraus, M.H.et al.，PNAS 86:9193-9197(1989); Plowman, G. D. et al. , PNAS 87:4905-4909 (1990) ；Kraus, M. H. et al. , PNAS 90:2900-2904(1993))。就像原型表皮生长因子受体，跨膜受体HER3由胞外配体结合域 (ECD)、ECD内的二聚化域、跨膜域、胞内蛋白质酪氨酸激酶域（TKD)和C端磷酸化域组成。 这种膜结合蛋白质具有在胞内域内的调蛋白（HRG)结合域，但是没有活性激酶域。因此，它 能结合这种配体但没有经由蛋白质磷酸化将信号传递入细胞。然而，它确实与确实具有激 酶活性的其它ffiR家族成员形成异二聚体。异二聚化导致受体介导的信号传导途径激活及 其胞内域转磷酸化。ffiR家族成员之间的二聚体形成扩充J1ER3的信号传导潜力，而且不仅 是信号多样化的手段而且是信号放大的手段。例如，J1ER2/HER3异二聚体经PI3K和AKT途 径诱导HER家族成员中最重要的促有丝分裂信号之一（51丨》1?)￥81^，]\0.6丨31.，]\13;[01. Chem. 269:14661-14665(1994) ；Alimandi, M. et al.,Oncogene. 10:1813-1821 (1995)； Hel Iyer, N. J. , J. Biol. Chem. 276: 42153-4261 (2001) ； Singer, E. , J. Biol. Chem. 276:44266-44274 (2001) ;Schaefer，K.L.，Neoplasia 8:613-622(2006))。关于 HER3 及其在HER受体家族和NGR配体家族内的各种相互作用的概述参见例如Sithanandam, G. et al.，Cancer Gene Therapy 15:413-448(2008)。
[0005] 已经在众多癌症中报告了这种基因的扩增和/或其蛋白质的过表达，包括前列 腺、膀胱、和乳腺肿瘤。已经表征了编码不同同等型的可变转录剪接变体。一种同等型缺乏 膜间区且分泌到细胞外。这种形式起调控膜结合形式的活性的作用。另外的剪接变体也已 有报告，但是它们尚未彻底表征。
[0006] 有趣的是，在其平衡状态，HER3受体以其"闭合构象"存在，这确实意味着HER3 发夹基序的异二聚化经非共价相互作用系留至ffiR3 E⑶域IV(见图lc和Id)。假 定"闭合"HER3构象能经配体调蛋白在特定HER3调蛋白结合位点处的结合而开放。这 发生于由HER3 E⑶域I和域III形成的HER3界面。通过这种相互作用，认为HER3受 体活化并转变成它的"开放构象"（见图le和lb和例如Baselga, J. et al.，Nat. Rev. Cancer 9:463-475(2009)和 Desbois_Mouthon，C.et al.，Gastroenterol Clin Biol 34:255-259(2010))。在这种开放构象中，与HER2的异二聚化和转信号诱导是可能的（见 图 lb)。
[0007] WO 2003/013602 涉及 HER 活性的抑制剂，包括 HER 抗体。WO 2007/077028 和 TO 2008/100624 也涉及 HER3 抗体。WO 97/35885 和 WO 2010/127181 涉及 HER3 抗体。
[0008] W0 2012/22814涉及冻结"闭合或无活性构象"的HER3抗体，这意味着它们冻 结HER3的平衡状态（见图1)，使得HER3 0-发夹在处于这种平衡状态时不可及。TO 2012/22814中的HER3抗体不结合以活性三维取向例如在SlyD支架内呈递的HER3 0 -发 夹（见例如图17和2,和例如SEQ ID N0:18的多肽）。
[0009] 人HER4(也称作ErbB-4、ERBB4、v-erb-a、成红细胞白血病病毒癌基因同系物 4、pl80erbB4、鸟类成红细胞白血病病毒（v-erb-b2)癌基因同系物4;SEQ ID N0:5)是 I型单次跨膜蛋白质，具有多个弗林蛋白酶样富含半胱氨酸域、酪氨酸激酶域、磷脂酰肌 醇-3 激酶结合位点和 PDZ 域结合基序（Plowman, G.D.et al.，PNAS 90:1746-50(1993); Zimon j ic, D. B. et al. , Oncogene 10:1235-7 (1995) ；Culouscou, J. M. et al. , J. Biol. Chem. 268:18407-10 (1993))。该蛋白质结合神经调蛋白-2和-3、肝素结合性EGF样生长因 子和0细胞素并被它们活化。配体结合诱导多种细胞应答，包括有丝分裂和分化。多种蛋 白水解事件容许胞质片段和胞外片段释放。已经将这种基因中的突变与癌症关联起来。编 码不同蛋白质同等型的可变剪接变体已有记载；然而，并非所有变体均已完全表征。
[0010] 用于抗癌疗法的抗册1?4抗体是已知的，例如来自旧5,811，098，旧7,332,579或 Hoilm6n, M. et al.，Oncogene. 28:1309-19 (2009)(抗 ErbB-4 抗体 mAb 1479)〇
[0011] 至今不可能选择特异性结合ffiR3 发夹的抗原结合蛋白（特别是抗体），因为 这种HER3 0 -发夹呈递隐藏的表位，在HER3处于平衡状态时不可及（见图1)。
[0012] 发明概述
[0013] 我们现在已经找到了一种使用在SlyD支架（见例如图2,和SEQ ID N0:13和17 至24的多肽）内以三维取向功能性呈递的HER3 (和用于逆筛选的HER4) 0 -发夹来获得此 类抗体的方法。
[0014] 本发明提供一种用于选择结合人HER3 (且不与人HER4交叉反应）的抗原结合蛋 白（特别是抗体）的方法，其中该抗原结合蛋白（特别是抗体）在人ffiR3的氨基酸序列 PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(SEQ ID N0:1)内结合，其中使用
[0015] a)至少一种选自下组的包含氨基酸序列SEQ ID NO: 1的多肽：
【主权项】
1. 一种用于选择结合人HER3的抗原结合蛋白的方法，其中该抗原结合蛋白在人HER3 的氨基酸序列 PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(SEQ ID N0:1)内结合， 其中使用 a) 至少一种选自下组的包含氨基酸序列SEQ ID NO: 1的多肽：
和 b) 至少一种选自下组的包含氨基酸序列SEQ ID NO:2的多肽：
来选择显示结合a)下的至少一种多肽且显示不结合b)下的至少一种多肽的抗原结合 蛋白， 并由此选择在人HER3的氨基酸序列PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(SEQ ID N0:1)内结合且不 与人HER4交叉反应的抗原结合蛋白。
2. 通过权利要求1的选择方法获得的抗原结合蛋白。
3. 权利要求1的方法或权利要求2的抗原结合蛋白，其中该抗原结合蛋白为抗体。
4. 一种分离的结合人HER3的抗原结合蛋白， a) 其中该抗原结合蛋白结合多肽SEQ ID N0:18 TtSlyDcys-Her3,且 b) 其中该抗原结合蛋白不与多肽SEQ ID N0:22 TtSlyDcys-Her4交叉反应。
5. -种分离的结合人HER3的抗原结合蛋白， a) 其中该抗原结合蛋白在多肽SEQ ID NO: 18 (TtSlyDcas-Herf)中包含的氨基酸序列 PQPLVYNKLTFQLEPNPHT(SEQ ID N0:1)内结合，且 b) 其中该抗原结合蛋白不与多肽SEQ ID N0:22(TtSlyDCaS-Her4)中包含的氨基酸序 列 PQTFVYNPTTFQLEHNFNA(SEQ ID N0:2)交叉反应。
6. 权利要求4或5的抗原结合蛋白，其中该抗原结合蛋白为抗体。
7. -种分离的结合人HER3的抗体，其中该抗体结合活化的HER3中的氨基酸序列SEQ ID NO:1〇
8. 权利要求6至7中任一项的抗体，其中该抗体显示与在调蛋