用于检测叶酸受体1的诊断测定和试剂盒的制作方法
【专利说明】用于检测叶酸受体1的诊断测定和试剂盒 发明领域
[0001] 本发明的领域总体上涉及结合至人叶酸受体1 (F0LR1)的抗体、检测F0LR1的方 法、诊断及治疗癌症的方法以及用于基于F0LR1的疗法的诊断测定和试剂盒。
[0002] 发明背景
[0003] 癌症是发达国家中死亡的首要原因之一，仅美国每年就有超过一百万人被诊断出 癌症并且有500, 000人死亡。据估计总体上3人中有超过1人将在其寿命期间发展某种形 式的癌症。存在超过200种不同类型的癌症，其中四种是乳腺癌、肺癌、结肠直肠癌以及前 列腺癌，它们占所有新发病例的超过一半（Jemal等人，2003, Cancer J. Clin. 53:5-26)。
[0004] 叶酸受体1(F0LR1)又名叶酸受体a或叶酸结合蛋白，它是在细胞质膜上表达的 N-糖基化蛋白。F0LR1对叶酸以及若干还原的叶酸衍生物具有高亲和力。F0LR1介导生理 叶酸，即5-甲基四氢叶酸，向细胞内部的递送。
[0005] F0LR1在大多数卵巢癌以及许多子宫癌、子宫内膜癌、胰腺癌、肾癌、肺癌及乳 腺癌中过度表达，而F0LR1在正常组织上的表达只限于肾近端小管中的上皮细胞的顶 膜、肺的肺泡性肺细胞、膀胱、睾丸、脉络丛以及甲状腺（Weitman SD,等人，Cancer Res 52:3396-3401(1992) ;Antony AC, Annu Rev Nutr 16:501-521(1996) ;Kalli KR,等人 Gynecol Oncol 108:619-626(2008))。F0LR1的这种表达模式使其成为用于F0LR1定向癌 症疗法的合乎需要的靶标。
[0006] 因为卵巢癌通常是无症状的直到晚期，所以它经常在晚期被诊断出并且当用当 前可得的程序（通常是在外科去除组织之后施用化疗药物）治疗时具有不良预后（von Gruenigen V等人，Cancer 112:2221-2227(2008) ;Ayhan A等人，AmJ Obstet Gynecol 196:81e81-86 (2007) ;HarryVN 等人，Obstet Gynecol Surv 64:548-560(2009))。因此， 存在对于用于卵巢癌的更有效治疗剂的明确未满足的医学需要。
[0007] 用于检测脱落（shed)FOLRl的一些先前测定对F0LR1不具有足够的特异性。举例 来说，一些测定不能区分F0LR1与其它叶酸受体家族成员（F0LR2、3及4)或报道总FBP值 (叶酸结合蛋白）。另外，一些测定需要人样本（例如，血浆）用光酸洗涤步骤预处理以将 叶酸从受体中分离。一些测定结果还可能由于抗体疗法与诊断抗体之间的竞争效应而具有 不准确性。另外，许多可商购获得的试剂盒传统上在其试剂以及在其批次与批次稳定性方 面是不可靠的。这些试剂盒的评估给出了各种各样的结果，并且意图仅供研宄使用。许多 需要人样本在分析之前被预稀释以降低由于"基质效应（matrix effect)"所引起的假阳性 几率。因此，存在对于高灵敏性和精确性诊断测定作为用于基于F0LR1疗法的搭配的明确 需要。
[0008] 发明概述
[0009] 本发明提供用于检测样本中的F0LR1的方法并且可用于例如对患者进行分级。因 此，在一个实施方案中，本发明提供一种治疗患有叶酸受体1介导的疾病的患者的方法， 所述方法包括：（a)使用不竞争性地抑制抗体huMovl9与F0LR1结合的抗体或其抗原结 合片段相对于参照样本中的脱落或CTC F0LR1水平测量取自患者的样本中的脱落叶酸受 体l(FOLRl)表达水平或循环肿瘤细胞（CTC)上的F0LR1 ;以及（b)如果患者的脱落或CTC F0LR1水平升高，那么向患者施用固定剂量的调节F0LR1活性的抗体或其抗原结合片段；其 中所述固定剂量的抗体或其片段有效地治疗疾病或病症。
[0010] 在另一实施方案中，本发明提供一种治疗患有F0LR1介导的疾病或病症的患者 的方法，所述方法包括：（a)向患有F0LR1介导的疾病或病症的患者施用固定剂量的调节 F0LR1活性的抗体或其抗原结合片段；(b)使用不竞争性地抑制抗体huMovl9与F0LR1结合 的抗体或其抗原结合片段相对于参照样本中的F0LR1水平测量患者的脱落或CTC F0LR1表 达水平；以及（c)如果患者的脱落或CTC F0LR1水平升高，那么增加后续固定剂量的量或频 率；其中患者的F0LR1水平的提高（例如，因为增加的细胞死亡导致增加的脱落F0LR1的释 放）或降低指示治疗功效。在另一实施方案中，如果患者的脱落或CTC F0LR1水平降低，那 么增加后续固定剂量的量或频率；
[0011] 在另一实施方案中，本发明提供一种减少患者中的F0LR1表达的方法，所述方法 包括：（a)使用不竞争性地抑制抗体huMovl9与F0LR1结合的抗体或其抗原结合片段相比 于参照样本中的F0LR1水平测量取自患有F0LR1介导的疾病或病症的患者的样本中的脱落 或CTC F0LR1水平；以及（b)如果患者的脱落或CTC F0LR1水平升高，那么向患者施用固定 剂量的调节F0LR1活性的抗体或其抗原结合片段；其中施用所述抗体或其抗原结合片段增 加（例如，因为增加的细胞死亡导致增加的脱落F0LR1的释放）或减少患者的F0LR1。
[0012] 在另一实施方案中，本发明提供一种减少患者中的F0LR1表达的方法，所述方法 包括：（a)向患有F0LR1介导的疾病或病症的患者施用固定剂量的调节F0LR1活性的抗体 或其抗原结合片段；(b)相对于参照样本中的F0LR1水平测量患者的脱落或CTC F0LR1水 平；以及（c)如果患者的脱落或CTC F0LR1水平升高，那么增加后续固定剂量的量或频率； 其中施用所述抗体或其抗原结合片段提高（例如，因为增加的细胞死亡导致增加的脱落 F0LR1的释放）或降低患者的F0LR1水平。
[0013] 在一个实施方案中，所述疾病是癌症。在另一实施方案中，所述癌症是选自由以下 组成的组的F0LR1升高的癌症：卵巢癌、非小细胞肺癌、子宫癌、子宫内膜癌、胰腺癌、肾癌、 肺癌以及乳腺癌。在另一实施方案中，所述癌症是铂抗性的或铂难治性的卵巢癌。
[0014] 本发明还提供一种监测固定剂量的调节F0LR1活性的抗体或其抗原结合片段在 患者中的治疗功效的方法，所述方法包括：(a)使用不竞争性地抑制抗体huMovl9与F0LR1 结合的抗体或其抗原结合片段测量取自患有F0LR1介导的疾病或病症的患者的样本中的 第一脱落或CTC F0LR1水平；(b)向患者施用固定剂量的调节F0LR1活性的抗体或其抗原 结合片段；（c)使用不竞争性地抑制抗体huMovl9与F0LR1结合的抗体或其抗原结合片段 在抗体施用之后测量取自患者的样本中的第二脱落或CTC F0LR1水平；以及（d)比较第二 F0LR1水平与第一 F0LR1水平；其中第一与第二F0LR1评分之间的增加（例如，因为增加的 细胞死亡导致增加的脱落F0LR1的释放）或减少指示治疗功效。
[0015] 在一个实施方案中，F0LR1表达水平是在体液中测量。在另一实施方案中，所述体 液是腹水。在另一实施方案中，所述体液是血清、血液或血浆。在另一实施方案中，F0LR1表 达水平是在外周血液样本中测量。
[0016] 在一个实施方案中，所述患者患有癌症。在另一实施方案中，所述癌症是选自由以 下组成的组的F0LR1升高的癌症：卵巢癌、非小细胞肺癌、子宫癌、子宫内膜癌、胰腺癌、肾 癌、肺癌以及乳腺癌。在另一实施方案中，所述癌症是铂抗性的或铂难治性的卵巢癌。
[0017] 在一个实施方案中，F0LR1表达是使用至少一种另外的抗F0LR1抗体或其抗原结 合片段来测量。在另一实施方案中，F0LR1表达是使用两种抗F0LR1抗体或其抗原结合片 段来测量。在另一实施方案中，抗体是鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。在另一实 施方案中，抗体或其抗原结合片段以约1. 〇至约10nM的Kd结合至人叶酸受体1。在另一实 施方案中，抗体或其抗原结合片段以约〇. 5nM至约5nM的Kd结合至人叶酸受体1。在另一 实施方案中，结合亲和力是通过细胞计量术、Biac〇re、ELISA或放射免疫测定来测量。在另 一实施方案中，细胞计量术是流式细胞术。
[0018] 在一个实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段不结合叶酸受体2或叶酸受体3。
[0019] 在一个实施方案中，所述至少一种抗体或其抗原结合片段被结合至固体支持物。 在另一实施方案中，所述至少一种抗体或其抗原结合片段被结合至微量滴定板。在另一实 施方案中，所述至少一种抗体或其抗原结合片段包括检测剂。在另一实施方案中，所述检测 剂是生色检测剂、荧光检测剂、酶检测剂或电化学发光检测剂。在另一实施方案中，所述检 测剂是辣根过氧化物酶（HRP)。
[0020] 在一个实施方案中，F0LR1水平是使用酶联免疫吸附测定（ELISA)或细胞计量术 (例如，流式细胞术）来测定。在另一实施方案中，ELISA是夹心ELISA。
[0021] 在一个实施方案中，所述至少一种抗体或其抗原结合片段特异性地结合至与选自 由以下组成的组的抗体相同的F0LR1表位：（a)包含SEQ ID N0:25的多肽和SEQ ID N0:29 的多肽的抗体；（b)包含SEQ ID NO: 26的多肽和SEQ ID NO: 30的多肽的抗体；（c)包含SEQ ID NO: 27的多肽和SEQ ID NO: 31的多肽的抗体；以及（d)包含SEQ ID NO: 28的多肽和SEQ ID NO:32的多肽的抗体。
[0022] 在一个实施方案中，所述至少一种抗体或其抗原结合片段特异性地结合至F0LR1， 其中所述抗体或其片段竞争性地抑制F0LR1结合选自由以下组成的组的抗体：（a)包含SEQ ID NO:25的多肽和SEQ ID NO:29的多肽的抗体；（b)包含SEQ ID NO:26的多肽和SEQ ID NO: 30的多肽的抗体；（c)包含SEQ ID NO: 27的多肽和SEQ ID NO: 31的多肽的抗体；以及 (d) 包含SEQ ID NO:28的多肽和SEQ ID NO:32的多肽的抗体。
[0023] 在一个实施方案中，所述至少一种抗体或其抗原结合片段特异性地结合至F0LR1， 其中所述抗体包含选自由以下组成的组的多肽序列：（a)SEQ ID N0:l、2和3及SEQ ID NO: 13、14 和 15; (b) SEQ ID NO: 4、5 和 6 及 SEQ ID NO: 16、17 和 18; (c) SEQ ID NO: 7、8 和 9 及 SEQ ID NO: 19、20 和 21; (d) SEQ ID NO: 10、11 和 12 及 SEQ ID NO: 22、23 和 24;以及 (e) 包含1、2、3或4个保守氨基酸取代的（a)至（d)的变体。
[0024] 在一个实施方案中，所述至少一种抗体或其抗原结合片段被可检测地标记。
[0025] 在一个实施方案中，所施用的抗体包括F0LR1抗体huMovl9。
[0026] 在一个实施方案中，huMovl9作为抗体美登木素生物碱缀合物来施用。在一个实施 方案中，抗体美登木素生物碱缀合物包含美登木素生物碱DM4以及可裂解的磺基-SPDB连 接子（頂GN853)。
[0027] 本发明还提供一种治疗患有F0LR1介导的疾病或病症的患者的方法，所述方法包 括：（a)向患有F0LR1介导的疾病或病症的患者施用固定剂量的调节F0LR1活性的抗体或 其抗原结合片段；(b)提交取自患者的样本用于测量F0LR1表达水平；（c)从所述测量的结 果确定患者的脱落或CTC F0LR1水平相对于参照样本中的F0LR1水平是否升高；以及（d) 如果患者的脱落或CTC F0LR1水平升高，那么增加后续固定剂量的量或频率。
[0028] 本发明还提供一种治疗患有F0LR1介导的疾病或病症的患者的方法，所述方法包 括：（a)向患有F0LR1介导的疾病或病症的患者施用固定剂量的调节F0LR1活性的抗体或 其抗原结合片段；(b)提交取自患者的样本用于测量脱落或CTC F0LR1水平和与参照样本 中的F0LR1水平相比较；以及（c)如果患者的脱落或CTC F0LR1水平升高，那么增加后续固 定剂量的量或频率；其中患者的F0LR1水平的提高（例如，因为增加的细胞死亡导致增加的 脱落F0LR1的释放）或降低指示治疗功效。
[0029] 在一个实施方案中，所施用的抗体包括F0LR1抗体huMovl9。在另一实施方案中， huMovl9作为抗体美登木素生物碱缀合物来施用。在一个实施方案中，抗体美登木素生物碱 缀合物包含美登木素生物碱DM4以及可裂解的磺基-SPDB连接子（MGN853)。
[0030] 本发明还提供一种治疗患有F0LR1介导的疾病或病症的患者的方法，所述方法包 括：（a)从患有F0LR1介导的疾病或病症的患者获得样本，其中所述患者已接收固定剂量的 调节F0LR1活性的抗体或其抗原结合片段；(b)使用不竞争性地抑制抗体huMovl9与F0LR1 结合的抗体或其抗原结合片段测量来自样本中的脱落或CTC F0LR1水平；（c)确定患者的 脱落或CTC F0LR1水平相对于参照样本中的F0LR1水平是否升高；以及（d)如果患者的脱 落或CTC F0LR1水平升高，那么指示健康护理提供者增加后续固定剂量的量或频率；其中 患者的F0LR1的增加（例如，因为增加的细胞死亡导致增加的脱落F0LR1的释放）或减少 指示治疗功效。
[0031] 本发明还提供一种用于检测样本中的脱落或CTC F0LR1的免疫测定试剂盒，所述 试剂盒包含：(a)针对人F0LR1的捕获抗体，其中所述捕获抗体或其抗原结合片段不竞争性 地抑制huMovl9与F0LR1的结合，以及（b)检测试剂。在另一实施方案中，所述试剂盒进一 步包含所述捕获试剂的固体支持物。在另一实施方案中，所述捕获试剂被固定在固体支持 物上。在另一实施方案中，所述捕获试剂被涂覆在微量滴定板上。在另一实施方案中，所述 检测试剂是第二F0LR1抗体。在另一实施方案中，第一和/或第二F0LR1抗体包含选自由 以下组成的组的多肽序列 ：（3)5￡〇10勵：1、2和3及5￡〇10勵：13、14和15;〇3)5￡〇10 N0:4、5*6&SEQIDN0:16、17*18 ;(c)SEQIDN0:7、8*9&SEQIDN0:19、2(^P21; ((1)5￡〇10勵：10、11和12及5￡〇10勵:22、23和24;以及（6)包含1、2、3或4个保守氨 基酸取代的（a)至（d)的变体。
[0032] 在一个实施方案中，检测试剂使用物种特异性抗体来检测。在另一实施方案中，所 述试剂盒进一步包含用于可检测的抗体的检测手段。在另一实施方案中，所述检测手段是 比色的。在另一实施方案中，所述试剂盒进一步包含F0LR1多肽作为抗原标准。在另一实 施方案中，F0LR1多肽是FOLRl-Fco
[0033] 本发明还提供一种特异性地结合至与选自由以下组成的组的抗体相同的F0LR1 表位的抗体或其抗原结合片段：（a)包含SEQ ID N0:25的多肽和SEQ ID N0:29的多肽的抗 体；（b)包含SEQ ID N0:26的多肽和SEQ ID N0:30的多肽的抗体；（c)包含SEQ ID N0:27 的多肽和SEQ ID NO: 31的多肽的抗体；以及（d)包含SEQ ID NO: 28的多肽和SEQ ID NO:32 的多肽的抗体。
[0034] 本发明还提供一种特异性地结合至F0LR1的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗 体或其片段竞争性地抑制选自由以下组成的组的抗体与F0LR1的结合：（a)包含SEQ ID NO:25的多肽和SEQ ID NO:29的多肽的抗体；（b)包含SEQ ID NO:26的多肽和SEQ ID NO: 30的多肽的抗体；（c)包含SEQ ID NO: 27的多肽和SEQ ID NO: 31的多肽的抗体；以及 (d)包含SEQ ID NO:28的多肽和SEQ ID NO:32的多肽的抗体。
[0035] 本发明还提供一种特异性地结合至F0LR1的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗 体包含选自由以下组成的组的多肽序列：（a)SEQ ID N0:l、2和3及SEQ ID N0:13、14和 15 ;(b) SEQ ID NO: 4、5和6及SEQ ID NO: 16、17和 18 ;(c) SEQ ID NO: 7、8和 9及 SEQ ID 勵：19、20和21;((1)5￡〇10勵：10、11和