专利名称：一种叶酸受体靶向型纳米金颗粒及其制备方法
技术领域：
本发明涉及纳米金颗粒，特别涉及一种叶酸受体靶向型纳米金颗粒及其制备方法。
背景技术：
纳米金颗粒(GNPs)越来越广泛地应用于生物医学研究中。纳米金颗粒作为 成像试剂具备很多优点，相对于其他物质，纳米金颗粒自身具有很强的表面等离子共振 (Surface PlasmonResonance, SPR)吸收和散射特性，使其更加有利于用作造影剂应用于 医学检测。纳米金颗粒对光漂作用不敏感，且表现出良好的生物相容性和无细胞毒性。纳 米金颗粒广泛应用的另一个重要原因是其易于进行生物修饰，纳米金颗粒的表面容易与巯 基、氨基以及二硫化物等进行结合，尤其是通过形成金硫(Au-S)键，可以将多肽、核酸以及 蛋白质等生物分子结合到纳米金颗粒表面，对纳米金颗粒的表面进行修饰之后，可使纳米 金颗粒具有分子靶向功能，将其应用于肿瘤的早期诊断。谷胱甘肽(GSH)作为一种天然的小分子三肽，有其特殊的化学结构，并且具有良 好的水溶性和化学稳定性，可稳定地结合在纳米金颗粒的表面，使纳米金颗粒可进行进一 步的修饰(Chen W. ,Tu X. , Guo X, Fluorescent gold nanoparticles-based fluorescence sensor for Cu2+ions. Chem. Commun. 2009 :1736-1738.)。叶酸分子可与谷胱甘肽修饰后的 纳米金颗粒通过形成共价键而连接到纳米金颗粒的表面，叶酸受体(folate receptors, FR)是细胞膜中锚在甘油磷酸脂酞肌醇上的单链糖蛋白。叶酸受体对叶酸及其类似物有 高度的亲和力，且具有饱和性、可逆性和竞争性等基本特点。在肿瘤研究中发现，大部分肿 瘤细胞中的叶酸代谢旺盛，肿瘤细胞表面的叶酸受体明显高于正常组织细胞表面的叶酸受 体，基于这一特点，叶酸受体作为肿瘤细胞的分子靶点受到了广泛的关注。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种叶酸受体靶向型纳米金颗粒。本发明的第二目的在于提供一种叶酸受体靶向型纳米金颗粒的制备方法。所述一种叶酸受体靶向型纳米金颗粒的由纳米金颗粒、叶酸和谷胱甘肽组成，所 述谷胱甘肽的巯基和纳米金颗粒的表面形成金硫(Au-S)键，所述谷胱甘肽中的羧基与所 述叶酸的氨基形成酰胺键。所述纳米金颗粒、叶酸和谷胱甘肽的摩尔比可为1 (1 2) (1 3)。所述一种叶酸受体靶向型纳米金颗粒的制备方法包括以下步骤1)将氯金酸溶液和柠檬酸三钠溶液加入水中得混合溶液，将混合溶液加热后冷却 即得溶液A ；2)将谷胱甘肽溶液加入溶液A中，搅拌，透析后得溶液B ；3)往溶液B中加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和二环己基碳二亚胺(DCC)，搅拌混 勻后加入叶酸，再搅拌，透析，即得产物叶酸受体靶向型纳米金颗粒。
在步骤1)中，所述氯金酸溶液、柠檬酸三钠溶液与水的体积比可为1 5 94; 所述氯金酸溶液的质量浓度可为1%，所述柠檬酸三钠溶液的质量浓度可为1%，所述加热 可采用微波加热，加热的温度可为100 120°C，加热的时间可为1 lOmin。在步骤2)中，所述谷胱甘肽的浓度可为0. lmol/L，所述谷胱甘肽溶液与溶液A的 体积比可为1 200，搅拌的时间可为8 16h，透析的时间可为6 12h。在步骤3)中，所述N-羟基琥珀酰亚胺的浓度可为0. 05mol/L,所述N-羟基琥珀 酰亚胺与溶液B的体积比可为1 400;所述二环己基碳二亚胺的浓度可为0.05mol/L， 所述二环己基碳二亚胺与溶液B的体积比可为1 400;所述叶酸与溶液B的体积比可为 1 200 ；再搅拌的时间可为8 16h，透析的时间可为12 24h。本发明所述一种叶酸受体靶向型纳米金颗粒能够特异性识别表面有高水平叶酸 受体表达的细胞，可作为检测肿瘤细胞的分子探针，在肿瘤细胞检测中具有广泛的应用。本发明中的叶酸受体靶向型纳米金颗粒经透射电镜检测，粒径在13 15nm之间， 为均一的球形结构。经过红外光谱表征，叶酸分子通过自身的氨基与谷胱甘肽中的羧基形 成酰胺键，结合在纳米金颗粒的表面。经过X射线衍射表征，表明纳米金颗粒的表面存在谷 胱甘肽和叶酸。拉曼光谱表明纳米金颗粒与谷胱甘肽通过金硫(Au-S)键结合。MTT实验表 明叶酸受体靶向型纳米金颗粒具有良好的细胞活性和生物相容性。激光共聚焦扫描得出金 纳米颗粒表面的叶酸与HeLa细胞表面的叶酸受体发生特异性结合，并定位于细胞质中，可 以用于肿瘤细胞的诊断。本发明中的叶酸受体靶向型纳米金颗粒与现有纳米金颗粒相比具有许多优点1)稳定性好，在低于0. 5mol/L的盐浓度条件下和pH值为3 11之间均能保持着 良好的稳定性。2)没有明显的细胞毒性，所用的谷胱甘肽分子更小，更有利于细胞对纳米金颗粒 的摄取，具有良好的生物相容性。3)具有良好的叶酸受体靶向性，可作为检测肿瘤细胞的分子探针，在肿瘤检测中 具有广泛的应用。
图1为叶酸受体靶向型纳米金颗粒的透射电镜图。在图1中，标尺为lOOnm。图2为叶酸受体靶向型纳米金颗粒的紫外可见吸收光谱图。在图2中，横坐标为 波长(nm)，纵坐标为吸光度，曲线1为纳米金颗粒，曲线2为叶酸受体靶向型纳米金颗粒。图3为叶酸受体靶向型纳米金颗粒的X射线光电子图谱。横坐标为结合能(eV)， 纵坐标为脉冲计数。在图3中，光电子能谱峰从左到右分别为々114€，52 ，(18，附8以及01s。图4为金元素的窄谱图。在图4中，横坐标为结合能(eV)，纵坐标为脉冲计数； Au4f分为Au 4f5/2和Au 4f7/2,结合能在87. 5eV和84. OeV,分别是由于AuC14_和Au所 决定的。图5硫元素的窄谱图。在图5中，横坐标为结合能(eV)，纵坐标为脉冲计数；S2p 谱分为162. IeV和163. 6eV，分别为S-H键，Au-S键中的结合能。图6氮元素的窄谱图。在图5中，横坐标为结合能(eV)，纵坐标为脉冲计数；Nls 谱能够被分为2个峰，分别在398. 85eV和400. 6eV,该结合能的位置分别代表-NH2和-NHCO中的N。图7为拉曼光谱。在图7中，横坐标为拉曼位移(cnT1)，纵坐标为强度；曲线a是未经修饰的纳米金颗粒，曲线b是经过谷胱甘肽修饰的纳米金颗粒，曲线c是经过谷胱 甘肽和叶酸受体修饰的纳米金颗粒。图8为不同浓度的叶酸受体靶向型纳米金颗粒与HeLa细胞和正常的成纤维细胞 共培养24h后的细胞存活情况统计图。在图8中，横坐标为叶酸受体靶向型纳米金颗粒的浓 度(μ g/ml)，纵坐标为细胞存活率(％ ) ;A为HeLa细胞，B为正常的成纤维细胞，Control 为未加叶酸受体靶向型纳米金颗粒的空白对照。图9为相同剂量的经过FITC修饰过的叶酸受体靶向型纳米金颗粒与Hela细胞和 A549细胞共培养2h后的激光共聚焦扫描图。在图9中，A为Hela细胞，B为A549细胞。图10为叶酸受体靶向型纳米金颗粒与HeLa细胞和A549细胞共培养2h后在细胞 内的定位分布图。在图10中，A为Hela细胞，其标尺为0. 5 μ m，其中C为细胞核，D为A的 局部放大图，其标尺为100nm，B为A549细胞，其标尺为1 μ m。图11为叶酸受体靶向型纳米金颗粒与叶酸受体高表达的HeLa细胞相结合的检测 结果图。在图11中，横坐标为细胞浓度(个/ml)，纵坐标为吸光度变化值ΔΑ;·为HeLa 细胞， 为成纤维细胞，▲为不含细胞的细胞培养液。
具体实施例方式实施例1叶酸受体靶向型纳米金颗粒的制备1)将94ml超纯水、Iml 氯金酸溶液和5ml 1 %的柠檬酸三钠溶液于室温下混 勻，放入微波炉中加热1 lOmin，自然冷却至室温，得溶液A，放入4°C冰箱保存。2)取溶液A 10ml，加入100 μ 1 0. lmol/L谷胱甘肽溶液，勻速搅拌过夜，将混合液 透析6h得溶液B。3)向溶液B中加入50 μ 1 0. 05mol/L的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和50 μ 1 0. 05mol/L的二环己基碳二亚胺(DCC)，室温搅拌lh，然后加入50 μ 1叶酸，搅拌12h，将混 合液透析12h即得产物叶酸受体靶向型纳米金颗粒，其中纳米金颗粒、叶酸和谷胱甘肽的 摩尔比为1:1:2。实施例2Hela细胞和成纤维细胞的培养按照细胞培养的常规方法培养Hela细胞和成纤维细胞的培养，分别取对数生长 期的Hela细胞和成纤维细胞，用0. 25%胰蛋白酶0. 02% EDTA消化液消化5min，添加PBS 调整细胞密度为1. 5X IO6个/ml，然后分别用PBS进行稀释调整细胞量，待检测。实施例3叶酸受体靶向型纳米金颗粒的鉴定使用透射电镜和紫外分外光度计观察叶酸受体靶向型纳米金颗粒(参见图1和 2)，可见叶酸受体靶向型纳米金颗粒其呈酒红色，透射电镜下颗粒呈很规则的球型结构，粒 径比较均一，粒径为20nm左右，分散性良好。叶酸受体靶向型纳米金颗粒的X射线光电子图谱表明(参见图3 6)纳米金颗 粒的表面是有叶酸以及谷胱甘肽存在的。在图3中，光电子能谱峰从左到右分别为Au 4f， S2p，Cls，Nls以及01s。图4为金元素的窄谱，Au 4f 5/2和Au 4f 7/2的结合能在87. 5eV 和84. OeV,分别是由于AuC14_和Au所决定的。图5为硫元素的窄谱，可分为162. IeV和163. 6eV,分别为S-H键，Au-S键中的结合能；图6为氮元素的窄谱，Nls谱能够被分为2个 峰，分别在398. 85eV和400. 6eV,该结合能的位置分别代表-NH2和-NHCO中的N。拉曼光谱实验表明，曲线a中纳米金颗粒由于没有进行修饰，其在低频率区域表 现出很弱的拉曼吸收情况，几乎没有特征峰，而在249. 9cm-1处有1个吸收峰，即为Au-Cl键 典型的拉曼吸收峰，纳米金颗粒为了保持稳定性，其表面有1个静电双电子层结构，其中主 要是AuC14_。经过谷胱甘肽修饰的纳米金颗粒中在291. 317cm-1处有1个很强的拉曼吸收 峰，证实了谷胱甘肽与纳米金颗粒通过Au-S相连接(参见图7)。将不同浓度的叶酸受体靶向型纳米金颗粒与HeLa细胞和正常的成纤维细胞共培 养24h，再检测细胞的存活情况(参见图8)。加入不同浓度的叶酸受体靶向型纳米金颗粒 的细胞存活情况与没有加入叶酸受体靶向型纳米金颗粒的细胞存活情况没有明显差别，且 在增大叶酸受体靶向型纳米金颗粒浓度后，一定范围内细胞依然表现出良好的存活率，表 明叶酸受体靶向型纳米金颗粒具有良好的细胞相容性。相同剂量的经过FITC修饰过的叶酸受体靶向型纳米金颗粒与Hela细胞和A549 细胞共培养2h，激光共聚焦显微镜观察细胞的变化(参见图9)。从图9A中可见Hela细 胞膜表面具有许多绿色荧光物(即为叶酸受体靶向型纳米金颗粒)吸附，部分Hela细胞内 也可见绿色荧光物，而作为对照的图9B中的A549细胞膜表面及细胞内基本没有出现绿色 荧光物。之所以出现此种现象，是因为Hela细胞中的叶酸受体高表达，而A549细胞中的叶 酸受体低表达。叶酸受体靶向型纳米金颗粒能够与Hela细胞高表达的叶酸受体特异性结 合，并且Hela细胞表面几乎完全被荧光物覆盖，表明了叶酸受体靶向型纳米金颗粒与叶酸 受体高表达的癌细胞有较高的结合效率，可以作为该类癌细胞早期诊断的工具。上述结果 还表明，被修饰在金纳米颗粒表面的叶酸的活性并没有受到影响，在与HeLa细胞孵育时， 可以特异性地和叶酸受体相结合，使靶细胞被金纳米颗粒所识别。证明所制备的叶酸受体 靶向型纳米金颗粒对叶酸受体高表达的细胞具有良好的靶向性。将叶酸受体靶向型纳米金颗粒与HeLa细胞和A549细胞共培养2h后，再在透射电 镜观测叶酸受体靶向型纳米金颗粒在细胞内的定位分布情况(参见图10)。从图中可以看 出，叶酸受体靶向型纳米金颗粒在HeLa细胞内有分布，而在A549细胞内则未能发现有叶酸 受体靶向型纳米金颗粒的分布。同时还发现叶酸受体靶向型纳米金颗粒未进入细胞核内， 因为叶酸受体靶向型纳米金颗粒进入细胞内是通过细胞表面高表达的叶酸受体的介导的 吞噬作用进入细胞内的内涵体中，这些内涵体在溶酶体的作用下释放出叶酸受体靶向型纳 米金颗粒，因此透射电镜下观察到的金纳米颗粒都处于细胞质中，这从另一角度说明叶酸 受体靶向型纳米金颗粒对叶酸受体高表达的细胞具有靶向性。叶酸受体靶向型纳米金颗粒与叶酸受体高表达的HeLa细胞的结合情况可通过如 下方法检测1)取300 μ 1 10nmol/L的叶酸受体靶向型纳米金颗粒溶液置于500 μ 1的离心 管中，向其加入100 μ 1不同浓度的Hela细胞悬液，轻微震荡混勻后，在4°C的条件下孵育 30mino2)将这些孵育完成的离心管收集，以转速为IOOOrpm离心5min，收集上清液，用紫 外可见分光光谱来进行表征，记录不同浓度条件下528nm处的吸光值。对照组为相同浓度 梯度的成纤维细胞，空白组为含有叶酸受体靶向型纳米金颗粒的无酚红DMEM培养基，未加细胞，每组实验重复5次。计算叶酸受体靶向型纳米金颗粒溶液离心后与离心前在528nm 处的吸光度变化值，即ΔΑ = AO-Al (AO =空白组吸光度，Al =离心后上清液的吸光度)。
随着HeLa细胞浓度的增加，ΔΑ的值也随之变大(参见图11)，表明结合在细胞 表面的叶酸受体靶向型纳米金颗粒就越多，因此离心后，上清液中的叶酸受体靶向型纳米 金颗粒就越少。而叶酸受体低表达的成纤维细胞中，随着浓度的增加，ΔΑ的值并没有发 生太大的变化，这是因为叶酸受体靶向型纳米金颗粒并不能有效地、稳定地吸附在细胞表 面，不能随着细胞的沉降而减少上清液中叶酸受体靶向型纳米金颗粒的量，这一结果跟空 白对照组相类似，再次说明了叶酸受体靶向型纳米金颗粒具有特异性识别叶酸受体高表达 的癌细胞的功能。随着HeLa细胞检测浓度的降低，在细胞浓度为10 100个/ml时，叶 酸受体靶向型纳米金颗粒与HeLa细胞的结合呈现出良好的线性关系。其线性方程为A = 1. 0465+0. 0857C, R = O. 9984，其中A为吸光度，C为细胞浓度，R为相关系数。当细胞浓度 为10个/ml时，Hela细胞与成纤维细胞的变化值经统计学分析并没有明显差异，因此，基 于叶酸受体靶向型纳米金颗粒系统检测癌细胞的最低限度为100个/ml，这种较为简便的 检测方法的检测最低限度已经接近于文献所报道的90个细胞。
权利要求
1.一种叶酸受体靶向型纳米金颗粒，其特征在于所述一种叶酸受体靶向型纳米金颗粒 的由纳米金颗粒、叶酸和谷胱甘肽组成，所述谷胱甘肽的巯基和纳米金颗粒的表面形成金 硫键，所述谷胱甘肽中的羧基与所述叶酸的氨基形成酰胺键。
2.如权利要求1所述的一种叶酸受体靶向型纳米金颗粒，其特征在于所述纳米金颗 粒、叶酸和谷胱甘肽的摩尔比为1 (1 2) (1 3)。
3.一种叶酸受体靶向型纳米金颗粒的制备方法，其特征在于包括以下步骤1)将氯金酸溶液和柠檬酸三钠溶液加入水中得混合溶液，将混合溶液加热后冷却即得 溶液A ；2)将谷胱甘肽溶液加入溶液A中，搅拌，透析后得溶液B；3)往溶液B中加入N-羟基琥珀酰亚胺和二环己基碳二亚胺，搅拌混勻，加入叶酸，再搅 拌，透析，即得产物叶酸受体靶向型纳米金颗粒。
4.如权利要求3所述一种叶酸受体靶向型纳米金颗粒的制备方法，其特征在于在步骤 1)中，所述氯金酸溶液、柠檬酸三钠溶液与水的体积比为1 5 94。
5.如权利要求3所述一种叶酸受体靶向型纳米金颗粒的制备方法，其特征在于在步骤 1)中所述氯金酸溶液的质量浓度为1%，所述柠檬酸三钠溶液的质量浓度为1%。
6.如权利要求3所述一种叶酸受体靶向型纳米金颗粒的制备方法，其特征在于在步骤1)中所述加热采用微波加热，加热的温度可100 120°C，加热的时间为1 lOmin。
7.如权利要求3所述一种叶酸受体靶向型纳米金颗粒的制备方法，其特征在于在步骤2)中所述谷胱甘肽的浓度可为O.lmol/L，所述谷胱甘肽溶液与溶液A的体积比为1 200。
8.如权利要求3所述一种叶酸受体靶向型纳米金颗粒的制备方法，其特征在于在步骤 2)中搅拌的时间为8 16h，透析的时间为6 12h。
9.如权利要求3所述一种叶酸受体靶向型纳米金颗粒的制备方法，其特征在于在在步 骤3)中所述N-羟基琥珀酰亚胺的浓度为0. 05mol/L,所述N-羟基琥珀酰亚胺与溶液B的 体积比为1 400 ；所述二环己基碳二亚胺的浓度为0.05mol/L，所述二环己基碳二亚胺与 溶液B的体积比为1 400;所述叶酸与溶液B的体积比为1 200。
10.如权利要求3所述一种叶酸受体靶向型纳米金颗粒的制备方法，其特征在于在在 步骤3)中再搅拌的时间为8 16h，透析的时间为12 24h。
全文摘要
一种叶酸受体靶向型纳米金颗粒及其制备方法，涉及纳米金颗粒，提供一种叶酸受体靶向型纳米金颗粒及其制备方法与应用。所述一种叶酸受体靶向型纳米金颗粒由谷胱甘肽、纳米金颗粒和叶酸组成。制备方法包括将氯金酸溶液和柠檬酸三钠溶液加入水中混匀，微波炉加热后冷却至得溶液A；将谷胱甘肽溶液加入溶液A中，搅拌，透析后得溶液B；往溶液B中加入NHS和DCC，搅拌混匀，加入叶酸，再搅拌，透析，即得产物叶酸受体靶向型纳米金颗粒。所述一种叶酸受体靶向型纳米金颗粒能够特异性识别表面有高水平叶酸受体表达的细胞，可作为检测肿瘤细胞的分子探针，在肿瘤细胞检测中具有广泛的应用。
文档编号A61K49/18GK102000350SQ201010566939
公开日2011年4月6日 申请日期2010年11月30日 优先权日2010年11月30日
发明者孙莉萍, 张召武, 贾静, 赖友群, 马燕燕 申请人:厦门大学