专利名称：丁香苦苷制药新用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种化合物的新制药用途，特别涉及丁香苦苷的新制药用途。
背景技术：
丁香叶(Folium syringae)来源于木犀科丁香属植物的干燥叶，是一种具有广谱抗菌、抗病毒、免疫增强、抗耐药性作用的中药，以其为原料生产的胶囊、片剂治疗急性黄疸性肝炎、痢疾，均收到较好疗效。丁香苦苷(图1)为环烯醚萜苷类化合物，为从丁香叶中分离出的单体化合物，是丁香叶发挥抗菌作用的主要有效成分之一。因此进一步研究丁香苦苷单体的活性具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于公开一种化合物的新制药用途，特别涉及丁香苦苷的新制药用途。丁香苦苷是一种具有药物活性的物质，因此，可以按照常规的制剂方法，将其制备成临床上可适用的任何一种药剂，例如，片剂、胶囊剂、注射剂、口服液体制剂、颗粒剂等。在制备上述制剂的过程当中，可以将丁香苦苷与任何一种适用于制备成临床药剂的赋形剂混合使用，制备成药物制剂。对本发明药物丁香苦苷抗乙肝病毒的实验研究，结果表明丁香苦苷在体内具有抗乙肝病毒的作用和对于DHBV引起的肝损伤具有保护作用。本发明药物丁香苦苷对CCL4致小鼠急性肝损伤、CCL4致大鼠慢性肝损伤的实验研究，结果表明丁香苦苷具有保肝、降酶、 降低肝纤维化程度等抗肝损伤的综合作用。
图1是丁香苦苷结构图
图2是荧光定量PCR的标准曲线3是治疗前鸭肝脏病理切片4是治疗后拉米夫定组鸭肝脏病理切片5是治疗后丁香苦苷高剂量组鸭肝脏病理切片图下述实验例用于进一步说明本发明实验例1 丁香苦苷抗鸭乙肝病毒的实验研究1材料与方法1. 1实验动物同日孵化2日龄浙江麻鸭120只，购自浙江缙云县孵化场，雌雄不分，体重00-50)
g°1.2主要试剂与主要仪器PCR RealSYBR Misture试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)。根据Genbank中DHBV-DNA序列，用ft~imer5软件设计引物，由宝生物工程(大连)有限公司合成，上游引物5，-GCA ATC ACT AGA CCA ATCCA-3，；下游引物5，-GAG ATC TAT GGT GGC TGC TC-3，； 目的产物211bp。多功能DNA纯化回收试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)；ALT和 AST试剂盒(南京建成生物研究所)；荧光定量PCR仪(美国伯乐公司)；TGL-16C型离心机 (上海安亭科学仪器厂)；微量移液器(大龙合资)；MP2000电子天平(上海第二天平仪器厂)。1.3主要药物丁香苦苷(自制，经面积归一化法计算含量> 95% )；拉米夫定，由苏州葛兰素史克生产，含量一片0. lg。1.4动物模型的建立采用荧光定量PCR筛选先天感染DHBV雏鸭，120只2日龄鸭雏适应性饲养4天后， 分别在腿胫静脉抽血0. 1-0. 2mL静脉血，对应编号后用lOOOOr/min离心5min，取上游血清。 取40 μ L血清，加入20 μ L辛酸钠，在99°C加热lOmin，然后10000r/min离心5min，取上清液进行荧光定量PCR检测，筛选出D-HBV阳性鸭子。1.5荧光定量PCR反应体系PCR反应体系为25 μ L.按下列组成配制PCR反应液Misture 12. 5 μ L，上游引物1. 25 μ L，下游引物1. 25 μ L，血清提取物2. 5 μ L，灭菌双蒸水7. 5 μ L，总反应体系 25 μ L0 PCR反应条件采用两步PCR法95°C起始模板预变性30s、95°C PCR循环中模板变性10S、60°C退火/延伸30s ；共40个循环；每个待测样本同时检测3管，取平均值作代表值。实验条件设置、荧光信号检查、数据读取和分析均由Bio-RadIQ5软件完成。以阳性标准品的对数值通过标准曲线的绝对定量读取样品初始拷贝数。1. 6阳性标准品的制备及标准曲线的建立从阳性血清中提取DHBV DNA，进行PCR扩增。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳证实为片段长度211bp的扩增目标产物，凝胶切割、回收并纯化(多功能DNA纯化回收试剂盒)， 纯化的DHBV DNA片段再次扩增、回收、纯化，紫外分光光度计定量。取回收产物进行10倍梯度稀释，以稀释样品作为标准样本模板进行FQ-PCR检测，每个样品3个重复，建立标准曲线。1. 7动物分组与给药筛选出的DHBV阳性麻鸭30只(雌雄不分)，体重40_50g，按随机数字表法随机分成5组，分别为空白对照组、拉米夫定组、丁香苦苷高、中、低剂量组，每组6只。空白对照组给予常规普通饲料，自由饮水；拉米夫定组将拉米夫定研碎溶解于生理盐水，按20mg/kg进行腹腔注射给药，每天1次；丁香苦苷低、中、高组分别为10mg/kg，20mg/kg, 40mg/kg进行腹腔注射给药，每天1次；每周复测体重一次，调整给药量。连续给药15天后停药观察5天。 在用药前、用药第5天、第10天、第15天及停药后第5天从腿胫静脉抽取0. 3 0. 5mL静脉血，10,000r/min离心5min，取上游血清，_20°C保存待检，用荧光定量PCR检测各个血清的DHBV DNA的含量。1. 8病理学观察用药前剖杀D-HBV阳性雏鸭2只，停药第5天剖杀丁香苦苷高剂量组和拉米夫定组鸭子各2只，对肝脏组织进行常规HE染色。
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1. 9肝功能检查各组于用药第15天、停药后5天分别检测血清中天冬氨酸转氨酶(AST)水平及丙氨酸转氨酶(ALT)。取实验血清样本，参照AST、ALT试剂盒说明书操作，用紫外分光光度计检测。1. 10数据处理所有数据用平均数士标准差表示；各治疗组的疗效比较用重复测量数据的方差分析；各时间点组间比较用单因素方差分析；所有数据用SPSS10. 0软件处理。2 结果2. IPCR筛选出DHBV阳性鸭子120只鸭子筛选出32只DHBV阳性鸭子，阳性率为26. 7%。2. 2阳性标准品的标准曲线对阳性标准品进行10倍梯度稀释后，用FQ-PCR对系列稀释样品进行检测，出现典型的扩增曲线，5个点具有极好的线性关系，斜率为-3. 321，相关系数为0. 988，表明基本上无抑制PCR反应的因素存在，所以在此范围内所测定的Ct值能准确地反映DHBV DNA的数量。以系列稀释样品的临界循环次数(Ct值)为纵坐标，以各管拷贝数的对数为横坐标，以获得标准曲线(见图2)。2. 3各组药物对血清DHBV DNA水平的影响治疗过程中各组DHBV DNA水平变化情况各组治疗前病毒载量差别无显著性意义，具有可比性。拉米夫定组用药后血清DHBV DNA含量在用药第5天就开始明显下降，第10天时就可以下降到较低水平，与用药前比较有显著性差异(P <0.05)，停药后5天DHBV DNA含量回升至用药前水平，与同时间点空白对照组比较无显著性差异。空白对照组血清DHBV DNA含量一直维持在一个较高水平。丁香苦苷组与空白对照组相比，丁香苦苷高、中剂量组服药后第10天起效，在第 15天DHBV DNA含量明显下降(P < 0. 05)，停药后5天DHBV DNA含量维持在相对较低水平， 有持续抑制病毒复制的趋势。而丁香苦苷低剂量组在用药期间对病毒的抑制作用不明显。 (如表1-1)表1-1各组用药前后血清DHBV DNA含量(文土s )
权利要求
1.丁香苦苷在治疗急慢性肝炎、重型肝炎、淤胆型肝炎、肝炎肝硬化、甲、乙、丙型肝炎及各种肝损伤等制剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所说的治疗急慢性肝炎、重型肝炎、淤胆型肝炎、肝炎肝硬化、甲、乙、丙型肝炎及各种肝损伤等中是对肝炎病毒复制具有抑制作用。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所说的治疗急慢性肝炎、重型肝炎、淤胆型肝炎、肝炎肝硬化、甲、乙、丙型肝炎及各种肝损伤等中是对肝功能具有改善作用。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所说的治疗急慢性肝炎、重型肝炎、淤胆型肝炎、肝炎肝硬化、甲、乙、丙型肝炎及各种肝损伤等中是对肝脏病理改变具有恢复作用。
5.根据权利要求1所述的丁香苦苷其特征在于该成分是从木犀科丁香属植物中分离出的环烯醚萜类单体成分。
全文摘要
本发明的目的在于公开一种化合物的新制药用途，即丁香苦苷在制备治疗急慢性肝炎、重型肝炎、淤胆型肝炎、肝炎肝硬化、甲、乙、丙型肝炎及各种肝损伤等治疗乙型肝炎药物、肝损伤药物中的新制药用途。本发明公开了丁香苦苷对乙型肝炎病毒复制的抑制作用、对肝功能的改善作用、对肝脏病理改变的恢复作用以及抗肝损伤等作用。
文档编号A61P31/12GK102475711SQ20101056659
公开日2012年5月30日 申请日期2010年11月30日 优先权日2010年11月30日
发明者吕邵娃, 李永吉 申请人:吕邵娃, 李永吉