专利名称：异黄芩素苷在制药中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及异黄芩素苷(ISOSCUTELLARIN 5，7，4’-三羟基黄酮-6-O-葡萄糖醛酸苷)的用途，尤其涉及在制药领域中的用途。
背景技术：
黄芩素苷(SCUTELLARIN 5，6，4’-三羟基黄酮-7--O-葡萄糖醛酸苷)又称灯盏乙素。具有扩张血管、增加脑血流量和心脏冠脉流量、降低血液粘度、改善微循环等作用[1]。临床上主要用于治疗脑血栓、脑梗塞、中风后瘫痪、冠心病、心绞痛等疾病。其现有制剂为普通片剂、注射剂和注射用粉针。但普通片剂口服生物利用度极低，只有0.4±0.19％[2]。普通注射液和粉针剂注射给药半衰期短，体内消除迅速[2-6]。目前国内外研究均以提高含有化合物5，6，4’-三羟基黄酮-7-O-葡萄糖醛苷酸的制剂生物利用度及长效制剂为主。未见有关异黄芩素苷制备防治心脑血管、血栓性疾病的药物的应用和两种异构体在生物体内的药物动力学研究。其异黄芩素苷结构为 5，7，4’-三羟基黄酮-异黄芩素苷(异黄芩素苷ISOSCUTELLARIN)该化合物其分子式为C21H20O12，黄色粉末状，分子量为464。易溶于低浓度的乙醇。根据文献[7]可由梧桐科植物掌叶苹婆Sterculia foetida或苹婆Sterculia colorata的叶中提取制得。
发明内容
1、本发明目的在于提供异黄芩素苷的新用途，即在制药中的新应用。
2、本发明涉及异黄芩素苷作为制备治疗和防治脑血栓形成、脑栓塞等脑血管意外疾病的药物中的应用。
3、本发明涉及异黄芩素苷作为制备治疗和防治脑血管疾病的药物中的应用。
4、本发明建立了测定该化合物在人体内血浆中的血药浓度测定方法(LC/MS/MS)；并对异黄芩素苷进行了药代动力学研究，本发明通过对异黄芩素苷和黄芩素苷的人体动力学研究发现，口服黄芩素苷后血浆浓度＜5ng/ml，且消除快不规则。而异黄芩素苷在人体的血浆维持较高的血药浓度，疗效优于黄芩素苷；同时，在临床试验中，未观察到临床不良反应现象。
为了更好的理解本发明的实质，下面将用异黄芩素苷的药理试验及结果来说明其在制药领域中的新应用。
采用梧桐科植物掌叶苹婆Sterculia foetida或苹婆Sterculia colorata的叶100kg，用相当于叶重量的15倍的60％乙醇，回流提取40分钟，回流提取2次。合并提取液，减压浓缩乙醇后，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取。正丁醇部分用大孔吸附树脂层析，依次用水、20％、60％、80％乙醇洗脱得到5个部位，其20％乙醇层用硅胶柱层析，用氯仿∶甲醇∶水(1∶2∶2)洗脱，再用Sephadex LH220层析，甲醇∶水(1∶2)洗脱，得化合物异黄芩素苷(300mg)。
将以上提取分离得到的异黄芩素苷，以聚乙二醇6000∶聚乙二醇4000(1∶2-6)混合液作为基质，冷却剂选择二甲基硅油∶液体石蜡(3∶2)，原料异黄芩酸苷100g与基质500g配比，药液温度为60-90℃的试验方案为最佳试验方案；以冷却温度为0～5℃，滴口内外径为4.5/7.0mm的滴头，滴口距冷却液面为2-6cm，滴速20-45滴/min的滴制条件，制成每丸含异黄芩素苷10mg的滴丸。
取提取分离得到的200mg，加注射用水至1000ml，混合均匀后，分装成1mg/5ml/支浓度的注射液装入药瓶中密封，消毒制成产品备用。
1、小鼠急性毒性试验A、静脉给药小鼠LD50的测定取健康小鼠50只，体重18g～22g，按体重随机分为5组。每组10只，♀♂各半，试验前12小时禁食。按低比稀释法，配制受试药物，经预试验确定，最高剂量为2000mg/kg，最低剂量1000mg/kg，组间公比r＝0.84，剂量分别为2000、1680、1411.2、1185.4、995.7mg/kg；i.v给药容积为0.2ml/10g体重。
静脉给药后，动物出现剂量依赖性中毒症状，可见小鼠出现自发活动量减少、腹卧、抽搐、挣扎等症状。1185.4mg/kg以上剂量组出现死亡动物，Bliss法计算LD50值为1509.9±142.7mg/kg，95％的可信限为1399.9～1685.3mg/kg。死亡动物及观察结束时动物剖检，未见明显异常变化。给药前、后体重变化。
静脉注射小鼠LD50
给药前、后体重变化表
B、经口给药小鼠LD50的测定预试结果显示，试验药物2500和5000mg/kg给药后连续观察3天未见死亡动物。表明本品毒性较低，其LD50难以测出，故进行最大耐受量试验。
给药后，试验组小鼠除自发活动量有所减少、腹卧外，未见明显中毒症状，持续观察7天亦未见动物死亡。给药前、后体重变化。
C、最大耐受量试验取健康小鼠20只，体重18∽22g，♀♂各半，试验前12小时禁食，自由饮水。试验设5000mg/kg试验组，给药浓度12.5％，给药容积0.4ml/10g体重。
结果显示，一次静脉给予小鼠实验药物后可见小鼠出现自发活动量减少、腹卧、抽搐、挣扎等中毒症状，动物死亡呈剂量依赖性，经Bliss法计算，LD50值为1509.9±142.7mg/kg，95％的可信限为1399.9～1685.3mg/kg。经口给予实验药物后当剂量达到5000mg/kg时，动物除腹卧、自发活动有所减少外，一般状况良好，未见死亡动物。表明本品小鼠口服LD50＞5000mg/kg。
2、对大鼠局灶性脑缺血再灌注的治疗作用大鼠在麻醉的情况下，分离暴露两侧颈总动脉，用动脉夹加闭双侧颈总动脉，产生双侧脑缺血。缺血一定时间后可按试验要求重新开启动脉夹进行脑再灌流。取健康SD大鼠，雌雄各半，体重260-290克。随机分为3组，每组15只，分别灌胃给予5％羧甲基纤维素钠(溶媒组)、黄芩素苷20mg/kg(对照组)和异黄芩苷20mg/kg(试验组)，每天1次，连续10天，10天后用2％的戊巴比妥钠(40mg/kg)ip.麻醉，作颈部正中切口，用动脉夹夹闭双侧颈总动脉20min，松夹后直视血管再通，缝合皮肤切口，放回原条件进行饲养，统计各组动物脑缺血后24h死亡率。结果溶媒组死亡8只，死亡率53.3％；黄芩素苷组死亡3只，死亡率20％；异黄芩苷组死亡1只，死亡率6.6％。因此黄芩苷、异黄芩素苷对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤有较强的保护作用，但异黄芩苷与黄芩苷相比有更好的保护作用。
其目的是阻断支配脑组织的血管，可模拟与人脑卒中相近似的病理模型，以评价药物的有效性。
3、对凝血系统的影响(1)对小鼠凝血时间的影响取昆明种小鼠105只，雌雄各半，20±2g，随机均分为4组，分别给予生理盐水和黄芩素苷(对照组)、异黄芩素苷(试验组)分别以20mg/kg、40mg/kg、60mg/kg的剂量进行灌胃，连续灌胃一周，于末次给药后1h，以毛细玻管自小鼠眼内眦球后静脉从内取血。自血液流入管内开始计时，血液注满后取出毛细管平放于桌上，每隔10s折断毛细管约0.5cm，至凝血丝出现为止，所历时间即为血凝时间，毛细管两端数据的平均值为该鼠的血凝时间。
对小鼠凝血时间的影响(毛细管法)(X-±SD)
注与空白组相比，**P＜0.01
对小鼠凝血试验表明黄芩素苷组和异黄芩素苷组都有抗凝血作用，而且尤以异黄芩素苷组作用明显。
(2)对兔凝血酶原时间的影响取健康家兔静脉血，与(38mg/ml)枸椽酸钠溶液1∶9混合抗凝，3000r/min离心10min，取上清待测。测定时采用空白与不同浓度的黄芩素苷、异黄芩素苷药液分别加入兔脑粉浸出液，生理盐水各0.1ml，再加入兔血浆0.1ml，混匀后放人37℃水浴中温育30s，加入0.025mol/LCaCl2溶液0.1ml并开始计时，每隔5s倾斜试管1次，记录纤维蛋白凝固(液面不动)所需时间。
对兔凝血酶原时间的影响 注与空白组相比，*P＜0.05，**P＜0.01黄异素苷、异黄芩素苷能明显延长凝血时间和凝血酶原时间，有利于防治血栓形成。
4、对异丙肾上腺素(ISO)诱导沙鼠急性心肌缺血的作用取健康沙鼠48只，体重(54±14)g，雌雄兼用，随机分为六组，每组8只，分别为(1)生理盐水对照组(NS)；(2)异黄芩素苷组(50mg/kg)，以上各组动物分别腹腔静脉注射给药，连续2d，第3d显麻醉沙土鼠，建立静脉给药通道，在按上述各组的药物及量分别静脉缓推给药，于末次给药后5min给予ISO2.5ug/kg，于5min内恒速静脉注射，观察并纪录15min内不同时间点的II导联心电图ST段变化；(3)异黄芩素苷静脉给药组(50mg/kg)；于筛选合格30min后，给药后5min再静脉恒速注射ISO2.5ug，观察并记录15min内不同时间点的II导联心电图ST段变化；其结果见表1。
试验结果表明，先腹腔注射异黄芩素苷预防性给药2天，末次静脉给药，与静脉注射一次，异黄芩素苷均有较短暂、轻度的减轻ISO诱导的急性心肌缺血的作用。其抗心肌缺血的机理可能与其迅速而持久地降压，减轻了心脏负担，从而降低了心肌耗氧量有关。异黄芩素苷能提高心肌SOD活性，降低MDA，减少自由基在心肌的集聚，减轻了ISO对心肌的损伤作用，提示其抗心肌缺血作用可能与其抗脂质过氧化作用有关。
5、异黄芩素苷的临床研究黄芩素苷具有扩张血管、增强动脉流量、降低血液粘度、降低外周阻力、减少血小板凝集等作用[]。临床主要用于治疗冠心病、心绞痛、心肌缺血损伤及脑血栓等。其现有制剂有普通片剂、注射剂和注射用粉针。普通片剂口服生物利用度极低，只有0.4±0.19％[1]。普通注射液和粉针剂注射给药半衰期短，体内消除迅速[2-5]。而人体药代动力学研究尚未见报道。
根据中华人民共和国药典二部(2000年版)规定，分别测定20名健康受试者口服受试制剂血浆中黄芩素苷、异黄芩素苷的浓度，绘制血药浓度-时间曲线，求算药物动力学参数；并分别根据制剂中异黄芩素苷的量，为异黄芩素苷滴丸人体生物利用度研究提供必要的试验数据(见表2)结果分析20名受试者口服含异黄芩素苷80mg的滴丸，获得如下结果血浆中异黄芩素苷的Tmax分别为7.7±1.7h；Cmax分别为178±142ng/ml，t1/2为3.26±1.78h；用梯形法计算，AUC0-t分别为1195±1136ngh/ml，AUC0-∞分别为1263±1271ng·h/ml。
而在对黄芩素苷的人体药动学研究时发现，受试者口服黄芩素苷后主要成分黄芩素苷的血浆浓度＜5ng/ml，且消除快、不规则。很难进行药代动力学评价。与文献[2]报道beagle犬口服大剂量黄芩素苷后，在1-3h之间达血药浓度峰值，绝对生物利用度在0.2％-0.75％之间，提示黄芩素苷口服几乎不吸收；静注消除半衰期均短的试验结果相一致。
根据一般药动学规律，异黄芩素苷相对黄芩素苷来讲，有更好的药效；同时，在临床试验中，未观察到临床不良反应现象。
基于以上结果可以得出本发明的优点在于(1)本发明对已知化合物异黄芩素苷发掘了新的医药用途，开拓了一个新的应用领域。
(2)本发明的异黄芩素苷安全无毒，药理作用强，药效好，预示着有很好的药用前景。
(3)本发明的产品原料来源丰富、价廉、以叶作为提取部位能充分资源、制备工艺简单，未见毒副作用。既可做成口服制剂如片剂、滴丸、胶囊剂等制剂；也可做成静脉注射制剂如粉针剂、静脉注射液等。
(4)本发明的产品制成的药物具有能不同程度地降低脑含水量和MDA含量，提高SOD、CAT和GSH-Px活性、保护Na+，K+-ATP酶活性。提示异黄芩素苷可通过保护脑组织抗氧化酶的活性，抑制脂质过氧化反应，减轻自由基对脑组织的损害；能降低脑组织的含水量，抑制脑组织Na+，K+-ATPase和Ca2+-ATPase活性的降低。提示该药可通过保护ATPase活性对缺血再灌注脑组织产生保护作用。其作用优于黄芩素苷。
(5)本发明的产品制成的药物能明显改善尿激溶栓后血小板聚集的TXB2的变化，并升高血中组织型纤溶酶原激活物、抗凝血因子的浓度，降低纤溶酶原激活物的抑制物(PAI)浓度，提高急性冠状动脉血栓形成时应用尿激素酶栓治疗的再通率。可减少血小板数，降低血小板聚集，促进纤溶活性，抑制凝血酶活性等，具有抗凝及纤溶效应。其抗凝血作用优于黄芩素苷。
(6)本发明的产品所制成的药物具有抗心肌缺血的作用。能提高心肌SOD活性，降低MDA，减少自由基在心肌的集聚，减轻了ISO对心肌的损伤作用，提示其抗心肌缺血作用可能与其抗脂质过氧化作用有关。
(7)本发明的产品进行了临床试验，采用液相色谱-质谱-质谱联用法测定了20名受试者口服异黄芩素苷后不同时刻血浆中的血药浓度，绘制了血药浓度-时间曲线。根据血药浓度-时间数据，采用梯形法计算AUC值以半对数作图法，由消除相末端的浓度点计算t1/2，并求出主要药物动力学参数。与其黄芩素苷比较，具有更好的药物动力学参数。为药物的临床疗效奠定了理论基础。同时，在临床试验中，未观察到临床不良反应现象。
具体实施例方式
以下将描述本发明的几个实施例，但本发明的内容完全不局限于此。
实施例1采用梧桐科植物掌叶苹婆Sterculia foetida或苹婆Sterculia colorata的叶100kg，用相当于叶重量的15倍的60％乙醇，回流提取40分钟，回流提取2次。合并提取液，减压浓缩乙醇后，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取。正丁醇部分用大孔吸附树脂层析，依次用水、20％、60％、80％乙醇洗脱得到5个部位，其20％乙醇层用硅胶柱层析，用氯仿∶甲醇∶水(1∶2∶2)洗脱，再用Sephadex LH220层析，甲醇∶水(1∶2)洗脱，得化合物异黄芩素苷。以聚乙二醇6000∶聚乙二醇4000(1∶2-4)混合液作为基质，冷却剂选择二甲基硅油∶液体石蜡(3∶2)，原料异黄芩酸酐与基质以1∶4配比，药液温度为60-80℃，以冷却温度为0～5℃，滴口内外径为4.5/7.0mm的滴头，滴口距冷却液面为3-6cm，滴速25-35滴/min的滴制条件，制成每丸含异黄芩素苷10mg的滴丸。
实施例2取按实施例1的方法制备的异黄芩素苷1000g，加适量的注射用水，用碳酸钠调PH值至7，搅拌溶解，再加相当于异黄芩素苷10-15％量注射用的甘露醇，除菌滤过，测定含量，分装至10mg/支，封口，即得。
实施例3取实施例1的方法制备的异黄芩素苷，采取本技术领域公知的输液剂制备方法，制备成异黄芩素苷氯化钠注射液，其规格为250ml异黄芩素苷20mg与氯化钠2.25g制备成异黄芩素苷葡萄糖注射液，其规格为250ml异黄芩素苷20mg与葡萄糖12.5g。
实施例4取实施例1方法制备的异黄芩素苷260g、乳糖460g、淀粉420g、滑石粉148g。采取本技术领域公知的片剂制备方法，在适宜容器中混合所有组分，制成颗粒，再加入硬脂酸镁2g，混匀，用9/32时标准凹冲压片，10片重量为1.3g，其规格为20mg/片。
实施例5取实施例1方法制备的异黄芩素苷l00g、10％羟丙甲基纤维素32ml。采取本技术领域公知的胶囊制备方法，制成1000粒胶囊，其规格为20mg/粒。
实施例6查阅国内外相关文献，未发现有异黄芩素苷临床试验的报道。本发明进行了人体药代动力学研究，并用液相色谱-串联质谱(LC/MS/MS)分析方法测定了人体中异黄芩素苷血浆浓度，并用异黄芩素苷的药动学行为对其制剂进行疗效评价。
血浆样品的分析方法血浆样品处理向500μl血浆中分别加入100μl甲醇，100μl内标溶液(黄芩苷400ng/ml)和200μl水，混匀；加3ml提取溶剂乙酸乙酯，涡流混合1min，往复振荡10min(240次/分)，离心5min(3500rpm)，分取上层有机相于另一试管中，于40℃氮气流下吹干，残留物加入150μl流动相溶解，涡流混合，取20μl进行LC/MS/MS分析。
色谱条件流动相为甲醇∶水∶甲酸(70∶30∶0.5，v/v/v)，流速为0.50ml/min，柱温25℃。
质谱条件离子源为ESI源；源喷雾电压为4kV；加热毛细管温度为320℃；鞘气(N2)压力25Arb；辅助气(N2)流量3Arb；碰撞气(Ar)压力1.0mTorr；碰撞诱导解离(CID)电压均为25eV；正离子方式检测；扫描方式为选择反应监测(SRM)，用于定量分析的离子反应分别为m/z463→m/z287(SCUTELLARIN和ISOSCUTELLARIN)和m/z447→m/z271(黄芩苷)；扫描时间为0.3s。相应的二级全扫描质谱图见
图1。
结果分析20名受试者口服含异黄芩素苷80mg的受试制剂和参比制剂(黄芩素苷)后，获得如下结果血浆中异黄芩素苷的Tmax分别为7.7±1.7h；Cmax分别为178±142ng/ml，t1/2为3.26±1.78h；用梯形法计算，AUC0-t分别为1195±1136ng.h/ml，AUC0-∞分别为1263±1271ng.h/ml。而黄芩素苷的血浆浓度＜5ng/ml，且消除快、不规则。
参考文献[1]丁国华，灯盏花药理研究和临床应用进展，时珍国医国药，1999，10(4)，303-306[2]葛庆华，周臻，支晓瑾，等.灯盏花素在犬体内的药动学和绝对生物利用度研究[J].中国医药工业杂志，2003，34(12)618-620[3]蒋学华，李素华，兰轲，等.灯盏花素在家犬体内的药代动力学[J].药学学报[J]，2003，38(5)371-373. 刘奕明，林爱华，陈汇，等.SCUTELLARIN在兔体内药代动力学[J].药学学报，2003，38(10)775-778. 李素华，蒋学华，杨强，等.灯盏花素在家兔体内的药动学研究[J].生物医学工程学杂志，2003，20(4)692～694. Zhong DF，Yang BH，Chen XY，et al.Determination of scutellarin in rat plasmaby high-performance liquid chromatography with ultraviolet detection[J].Journal of Chromatography B，2003，796(2)439-444[7]Current science.[periodical]46(1)14-15(English)197权利要求
1.异黄芩素苷在制备治疗或预防脑血栓、脑梗塞、脑溢血等所致的后遗症药物中的应用；
2.异黄芩素苷在制备治疗或预防冠心病、心绞痛药物中的应用；
3.异黄芩素苷在制备治疗或防治心血管疾病的药物中的应用。
4.为含异黄芩素苷或黄芩素苷药品在人或动物体内药物动力学研究提供了可行的研究方法。
全文摘要
本发明涉及异黄芩素苷(ISOSCUTELLARIN 5，7，4’－三羟基黄酮－6－O－葡萄糖醛酸苷)在制药领域中的新用途。该产品具有扩张血管、增加动脉流量、降低血液粘度、降低外周阻力、减少血小板计数和抑制血小板凝集等作用。用于治疗或预防冠心病、心绞痛、心肌缺血损伤及脑血栓形成、脑栓塞、脑溢血等所致后遗症瘫痪病人等。
文档编号A61P9/00GK1823798SQ20051000746
公开日2006年8月30日 申请日期2005年2月22日 优先权日2005年2月22日
发明者史关正 申请人:史关正