一种苦杏仁苷的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种苦杏仁苷的制备方法，尤其涉及一种D-苦杏仁苷或L-苦杏仁苷的 制备方法。
【背景技术】
[0002] 苦杏仁苷是苦杏仁的一种主要成分，具有镇咳平喘，抗肿瘤降血压以及抗凝血等 作用，已经作为祛痰止咳，辅助性抗癌药物广泛用于医药领域;此外它还对气滞，肠燥便秘， 水肿胀满等病症具有良好的临床治疗效果。
[0003]目前用来制备苦杏仁苷的方法主要是采用水提取法，乙醇回流法，超声波提取法， 以及树脂分离纯化等工艺。尽管已有报道对上述工艺进行了改进并研究了其最佳条件，以 制得纯度或收率较高的苦杏仁苷，例如，对苦杏仁苷的分离提取采用"灭酶保苷"的工艺以 防止苦杏仁中的苦杏仁苷酶将苦杏仁苷水解;采用不同的溶剂以及不同浓度和用量以提高 苦杏仁苷的纯度和收率。
[0004]但是，根据以上方法制备的苦杏仁苷中均存在不同程度的D-苦杏仁苷 (Amygdalin)和L-苦杏仁苷(Neoamygdalin)差向异构体(见图13A和图13B)(吴军等从补阳 还五汤水煎液的正丁醇萃取部分分离得到苦杏仁苷，发现其为一对D、L差向异构体KD-苦 杏仁苷是一种重要的氰苷类化合物，具有前述苦杏仁苷的祛痰镇咳等功效，主要存在于中 药桃仁和杏仁中。L-苦杏仁苷可能具有与D-苦杏仁苷完全不同的药理活性，已有研究报道 L-苦杏仁苷对癌症治疗无效，说明该差向异构体的存在影响了苦杏仁苷药物的疗效;并且 苦杏仁药对配伍配比时，两个异构体，随配伍的不同而发生变化，说明该差向异构体在中药 配伍规律和作用机制的方面具有研究意义。
[0005]目前尚没有单独制备D-苦杏仁苷或L-苦杏仁苷差向异构体的方法，从而大大限制 了苦杏仁药物后期的深入研究。因此，如何分别制备药物级高纯度高收率的D-苦杏仁苷和 L-苦杏仁苷，实现易操作低成本的大规模制备，已成为本领域面临的问题。
【发明内容】
[0006]为解决现有存在的以上技术问题，本发明目的在于提供一种苦杏仁苷的制备方 法。
[0007] 本发明提供的一种制备D-苦杏仁苷和/或L-苦杏仁苷的方法，包括如下步骤：
[0008]1，提取:在桃仁或苦杏仁中加水，煮沸进行提取，并浓缩，得到粗提物；
[0009]2，萃取:对粗提物用有机溶剂进行萃取，并浓缩得到萃取物；
[0010] 3，对于萃取物，利用反向色谱分离L-苦杏仁苷和/或D-苦杏仁苷并检测纯度;色谱 观察到峰值时进行洗脱，接收，浓缩，结晶，过滤。
[0011]其中，步骤1所述桃仁或苦杏仁的量为20克~2千克，所述水的量为桃仁或苦杏仁 的5~8倍量(w/w);所述煮沸进行提取的时间为1~2小时，并重复提取2~3次合并提取液， 优选的，所述煮沸进行提取的时间为2小时，重复提取3次;所述浓缩为减压浓缩。通过步骤1 从而能够简单快速地获得苦杏仁苷的粗提物。
[0012]其中，步骤2所述萃取为用乙酸乙酯萃取2~3次，优选的，为萃取3次;再用正丁醇 萃取3次;所述乙酸乙酯萃取的体积比为1:1，所述正丁醇萃取的体积比为1:1，所述浓缩为 减压浓缩。通过步骤2从而能够获得苦杏仁苷的萃取物进而用于异构体分离步骤。
[0013]其中，步骤3所述反向色谱分离的条件为:Ci8色谱柱:50mm*250mm，ΙΟμL?，检测波长： 210nm，流动相：（质量百分比）11%~15%乙腈-(质量百分比）0.2~0.5%甲酸水，流速： 30ml/min~100ml/min，柱温:室温，pH值:2.0-5.0，进样量：2000-5000yL;所述色谱分离包 括观察色谱图中L-苦杏仁苷与D-苦杏仁苷的峰时进行洗脱，共运行40~60分钟，并接收L-苦杏仁苷和/或D-苦杏仁苷洗脱液;其中，优选的，所述流动相为15 %乙腈-0.5 %甲酸水，所 述流速 30ml/min，pH值:2.0，进样量:2000yL。
[0014]其中，步骤3所述的浓缩为减压浓缩，所述结晶为二氯甲烷甲醇重结晶，所述过滤 为抽滤。步骤3在特定的色谱条件下从而高效稳定并且直观地对异构体L-苦杏仁苷和/或D-苦杏仁苷进行分离，进而提纯获得高纯度的单一异构体。
[0015]进一步地，可以采用核磁共振的方式检测L-苦杏仁苷和/或D-苦杏仁苷的结构。其 中，所述的核磁共振为氢谱(h-NMR)和碳谱（13C-NMR)，通过NMR对L-苦杏仁苷和/或D-苦杏 仁苷异构体的结构进行检测并确认。
[0016]本发明所述方法通过使用动态轴向压缩色谱制备技术，并结合NMR技术，真正实现 了高精度地分离制备苦杏仁苷的D-苦杏仁苷或L-苦杏仁苷任意一种差向异构体。不仅分离 操作工艺简单易操作易重复，分离周期短，效率高;而且成本低，环境友好，适合大规模工业 化生产；并且制备的D-苦杏仁苷和L-型苦杏仁苷均比较稳定，并且纯度较高（纯度可高达 98%以上），这将为后期苦杏仁苷的深入研究提供有效的技术支持。
【附图说明】
[0017]图1为本发明实施例1之L-苦杏仁苷HPLC图谱；
[0018]图2为本发明实施例1之D-苦杏仁苷HPLC图谱；
[0019] 图3为本发明实施例1之D-苦杏仁苷核磁共振碳谱；
[0020] 图4为本发明实施例1之D-苦杏仁苷核磁共振氢谱；
[0021 ]图5为本发明实施例1之L-苦杏仁苷核磁共振碳谱；
[0022]图6为本发明实施例1之L-苦杏仁苷核磁共振氢谱；
[0023]图7为本发明实施例2之L-苦杏仁苷HPLC图谱；
[0024]图8为本发明实施例2之D-苦杏仁苷HPLC图谱；
[0025]图9为本发明实施例2之D-苦杏仁苷核磁共振碳谱；
[0026]图10为本发明实施例2之D-苦杏仁苷核磁共振氢谱；
[0027]图11为本发明实施例2之L-苦杏仁苷核磁共振碳谱；
[0028]图12为本发明实施例2之L-苦杏仁苷核磁共振氢谱；
[0029]图13A为本发明之D-苦杏仁苷结构式；
[0030]图13B为本发明之L-苦杏仁苷结构式。
【具体实施方式】
[0031] 以下结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。下 述实施例涉及的方法如无特别说明，均为常规方法。
[0032]本发明所述方法先采取水煮提取获得粗提物、再醇提获得萃取物，然后再通过利 用反向色谱技术(HPLC)分离出L-苦杏仁苷和/或D-苦杏仁苷，并利用核磁共振技术(NMR)进 行结构确认。以下的实施例，给出了具体的做法。
[0033] 实施例1
[0034] 1，提取，将20克苦杏仁(市售品）加入5倍量的水，煮沸进行提取1小时，重复2次，合 并提取液，并进行减压浓缩，得到苦杏仁苷粗提物。
[0035] 2,萃取，用乙酸乙酯以体积比为1:1的比例萃取步骤1所得粗提物，重复2次，然后 用正丁醇以体积比1:1的比例萃取3次。收集正丁醇萃取液，减压浓缩得到苦杏仁苷萃取物。 [0036] 3，动态轴向压缩反向色谱分离(DAC-HB80江苏汉邦科技有限公司）。取上述萃取物 用压缩色谱进行分离，使用Ci8色谱柱(250mmX50mm，10ym)，以质量百分比15%乙腈-0.5% 甲酸水为流动相进行洗脱，流速:30ml/min，柱温：室温，pH值：2.0，检测波长:210nm，进样 量：2000yL。观察色谱图中出现L-苦杏仁苷峰和D-苦杏仁苷峰时进行洗脱(共运行约50分 钟，在约42.5~43.8分钟为L-苦杏仁苷的色谱峰，44.0~46.5分钟为D-苦杏仁苷色谱峰）， 并接收L-苦杏仁苷和/或D-苦杏仁苷洗脱液(见图1和2)。图1为L-苦杏仁苷的HPLC图谱；图2 为D-苦杏仁苷的HPLC图谱。
[0037]纯度检测。将洗脱组分进行减压浓缩，二氯甲烷甲醇重结晶，抽滤，分别得D-苦杏 仁苷粉末500mg(纯度98.5 % )和L-苦杏仁苷粉末1OOmg(纯度98.2 % )。
[0038] 4,核磁共振氢谱（4-匪R)和核磁共振碳谱（13C_匪R)检测。将收集的洗脱液进行 NMR检测结构，结果见图3，4，5，6。其中图3和图4分别是D-苦杏仁苷的C谱和Η谱，图5和图6分 别是L-苦杏仁苷的C谱和Η谱。该D-苦杏仁苷（Amygdalin)粉末和L-苦杏仁苷 (Neoamygda1in)粉末的核磁共振谱图数据见表1。
[0039]L-苦杏仁苷
[0040] 4Mffi(400MHz，CD30D)S7.59(2H，dd，J= 6.9，1.8Hz，H-4,8)，7.44(3H，m，H-5,6， 7)，6.06(lH，s，H-2) ,4.66(lH，d，J= 7.8Hz,Η-V),4.39(lH，d，J= 7.6Hz，H-1〃），4.22( 1H，brd,J=ll,δΗζ,Η-θ^) ,3.86(lH,dd,J=ll.8,1,9Ηζ,Η-6^) ,3.77(lH,dd,J=ll.8, 6.9Hz，H-6〃a)，3.66(lH，dd，J= 11.9,6.9Hz，H-6〃b).
[0041 ] 13CNMR(100MHz，CD30D)S135.3(C-3)，130.8(C-6)，130.0(C-4,8)，128.8(C-5,7)， 118.8(0-1),105.3(0-17), 102.3(0-177),78.KC-37), 78.0(〇-3/7),