专利名称：力生长因子及其e肽在制备治疗骨质疏松或骨缺损的药物及材料中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医药领域，涉及一种生长因子在制备药物及医用材料方面的应 用，特别涉及力生长因子及其E肽在制备治疗骨质疏松或骨缺损的药物及材料中的应用。
背景技术：
目前，因自然灾害、交通事故、工伤、运动创伤、骨肿瘤切除等引起的先天性骨疾 病、代谢性骨质疏松以及骨缺损等成为威胁人们健康的常见疾病，受到世界范围的广泛关 注。据美国统计，全球每年对此的医疗花费约170亿美元，构成强大的全球性经济社会需 求。我国正进入老龄化社会，骨质疏松问题日趋严重。据第5次人口普查的结果预测，我国 现有原发性骨质疏松症患者约8800万人；21世纪中叶我国将进入老龄化高峰期，届时老 年人口将超过4亿，约占总人口的1/4，预期骨质疏松症患者将近2亿。因此，骨质疏松及骨 缺损的治疗和修复是21世纪国际社会也是我国的医学重大问题。骨骼是主要的结构支撑和运动组织。力学刺激在骨骼的生长发育过程中起着重要 的调节作用，并且在成年后的骨结构重建、损害后的修复等方面具有至关重要的作用。力学 因素对骨修复愈合过程中细胞增殖、迁移、分化、血管生成和骨痂改建等生理过程具有调节 作用。细胞在应力作用下可表达特异性生长因子，刺激和维持骨的生成。力学加载研究骨 生物学过程的一个较为理想的模型是肢体延长过程(即牵拉骨生成技术)，此时生成的骨痂 被力学拉伸，产生的应变会增加骨细胞的增殖活性，从而促进大量胞外基质蛋白质的生成。 体内血清水平测试表明在拉伸刺激下，成骨细胞中碱性磷酸酶(ALP)、转化生长因子β (TGF-βΙ)和成纤维细胞生长因子(bFGF)的表达有明显增加，而且它们之间存在着相关性， 这说明在骨痂牵拉过程中应变激活成骨细胞是系统性增加骨生长因子的一个主要来源。此 外，研究发现，骨生成蛋白(BMPs)的表达也会受到力学因素的影响，一般在张应力作用下， 类胰岛素成长因子1 (IGF-l)、BMP-2和BMP-4的表达上调。除了上述已知的生长因子和细 胞因子受到力学刺激的调节对骨生长产生影响外，还可能存在新的力学敏感因子在骨生长 发育中发挥重要作用。最近发明人通过拉伸刺激成骨细胞发现，拉伸刺激能够促进成骨细胞表达一种 新的生长因子——力生长因子(mechno-growth factor，MGF)。MGF是一种IGF-1变体，由 igf-Ι基因剪接变异产生。Igf-I基因的启动子1在应力刺激(如过载拉伸刺激)下会启动 表达并发生选择性剪接，从而产生应力敏感型变体MGF。与IGF-I相比，人MGF多出长40个 氨基酸的羧基端短肽序列(啮齿类动物为41个氨基酸)，该短肽作用于独立的受体；并由于 来自外显子5的49bp (啮齿类动物为52bp)的插入序列，导致外显子6的翻译发生移码突 变，而产生特异的长M个氨基酸的羧基端E肽序列(MGF-Ct24E)。既往研究发现，MGF具有 应力敏感性，并且具有促进肌肉肥大、再生以及神经损伤修复的功能。发明人在前期研究工 作中通过基因重组技术在大肠杆菌中表达制备了 MGF和MGF-CU4E，并发现所得MGF具有促 进成骨细胞前体MC3T3-E1增殖和迁移的作用；进一步研究发现，MGF-Ct24E对成骨细胞的分化具有抑制作用，而MGF对成骨细胞的分化表现出双重效应，在分化早期具有一定的延 迟效应，在分化晚期则表现为促进作用。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供MGF及其E肽在制备药物及医用材料方面的应 用，从而为临床疾病的治疗提供更多高效、安全的备选药物及材料，以满足临床治疗的多方 面需求。为达到上述目的，本发明考察了 MGF (氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示)及E肽 (MGF-CU4E，氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示)对骨质疏松和骨缺损的治疗效果。结果发 现，MGF及MGF-Ct24E可以有效作用于骨细胞或骨组织，能够使大鼠股骨骨密度明显增加， 股骨的屈服点载荷、最大桡度、最大应力、弹性模量等参数显著改善，还能够明显促进兔桡 骨的缺损修复。因此，MGF及其E肽可以单独作为活性成分或与其它具有生理活性的化合 物或提取物组成复方，再结合药学上可接受的制剂成分(例如无机盐，甘油或蔗糖等蛋白保 护剂等)，按照药学领域的常规方法制成适合临床应用于治疗骨质疏松或骨缺损的各种剂 型的药物，例如可制成注射剂(包括冻干粉针剂)以进行注射给药；也可以将MGF及其E肽结 合医药学上可接受的植骨材料(例如高分子材料如聚乳酸，无机材料如羟基磷灰石，以及异 种骨基质等)，按照药学领域的常规方法(例如将MGF或E肽作为骨生长因子以混合、吸附或 共价结合等方式与植骨材料复合)，制成适合临床应用的骨缺损修复材料以进行植入给药。本发明的有益效果在于本发明提供了 MGF及其E肽在制备治疗骨质疏松或骨缺 损的药物以及骨缺损修复材料中的应用，可以为临床骨质疏松症的治疗或骨缺损修复提供 更多高效、安全的备选药物及材料，满足临床治疗的多方面需求，具有潜在、良好的应用前景。
图1为MGF注射给药促进骨修复的X光片结果A、B、C分别代表空白对照组、给药 低剂量组和给药高剂量组，1、2、3分别代表术后第4周、第6周和第8周。图2为MGF注射给药促进骨修复的组织切片结果术后第8周各组愈合部位组织 切片HE染色后普通光镜下视图，A、B、C分别代表空白对照组、给药低剂量组和给药高剂量 组(放大倍数为40倍)，a、b、c分别为局部放大图(放大倍数为200倍)。图3为MGF-Ct24E注射给药促进骨修复的X光片结果A、D、E分别代表空白对照 组、给药低剂量组和给药高剂量组，1、2、3分别代表术后第4周、第6周和第8周。图4为MGF_Ct24E注射给药促进骨修复的组织切片结果术后第8周各组愈合部 位组织切片HE染色后普通光镜下视图，A、D、E分别代表空白对照组、给药低剂量组和给药 高剂量组(放大倍数为40倍)。图5为MGF和MGF-Ct24E修饰DPLA植骨材料促进骨缺损修复的X光片结果A、B、 C分别代表不含蛋白/多肽的DPLA材料、MGF修饰DPLA植骨材料和MGF_Ct24E修饰DPLA 植骨材料，1、2、3分别代表术后第4周、第8周和第12周。图6为MGF和MGF-Ct24E修饰DPLA植骨材料促进骨缺损修复的组织切片结果术 后第12周各组愈合部位组织切片HE染色后普通光镜下视图，放大倍数为40倍。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的优 选实施例进行详细的描述。在优选实施例中使用的MGF和MGF_Ct24E系参照文献方法(张兵兵等.力生长因 子在大肠杆菌中的表达及活性分析.生物工程学报，2008，24(7): 1180-1185)制备得 到。植骨材料马来酸酐和二胺改性的高分子量聚乳酸(DPLA)详见专利ZL01129048. X， ZL03159055. 1 和 ZL 02133814.0。一、以MGF或MGF_Ct24E为活性成分的药物或材料的制备 1、MGF注射液的制备
按照药学领域的常规方法，将MGF用浓度为0. lmol/L的PBS溶解制成浓度为1. Omg/mL 的注射液，PH为6. 5、. 5，即得。2、MGF_Ct24E注射液的制备
按照药学领域的常规方法，将MGF-Ct24E用浓度为0. lmol/L的PBS溶解制成浓度为 1. Omg/mL的注射液，pH为6. 5^8. 5，即得。3、MGF修饰DPLA植骨材料的制备
分别将30mg DPLA溶于ImL四氢呋喃中，200ng MGF溶于200 μ L水中，再将MGF溶液滴 加至DPLA溶液中，超声10分钟，静置过夜，12000r/min离心10分钟，弃去上清液，将剩余物 滴加至水溶液中，自然成膜，固液分离，真空干燥，即得MGF修饰DPLA植骨材料。4、MGF-Ct24E修饰DPLA植骨材料的制备
分别将Ig DPLA溶于IOmL四氢呋喃中，0. 5mg MGF_Ct24E溶于200 μ L水中，再在冰 浴、搅拌条件下将MGF-Ct24E溶液滴加至DPLA溶液中，用N-甲基吗菲林调节pH至8 9，再 将50mg DCC溶于ImL四氢呋喃后滴加至上述混合液中，冰浴条件下反应M小时，过滤除去 杂质，滤液用四氢呋喃体系提纯后，滴加至水溶液中，自然成膜，固液分离，真空干燥，即得 MGF-CtME修饰DPLA植骨材料。二、MGF和MGF_Ct24E对骨质疏松的治疗作用
方法将8月龄雌性SD大鼠40只随机分为假手术组(A组)、去势组(B组)、去势+MGF 组(C组)、去势+MGF-Ct24E组(D组)，每组10只；将B、C、D组大鼠摘除双侧卵巢，A组大鼠 行假手术处理；术后第2天，C组大鼠按剂量为0. lmg/kg/d肌肉注射前述MGF注射液，D组 大鼠按剂量为0. 2mg/kg/d肌肉注射前述MGF-Ct24E注射液，A组和B组给予等量PBS液； 术后第20周测定各组大鼠骨密度(BMD)和股骨生物力学性能。结果(1)骨密度四组大鼠股骨近端、股骨干、第3飞腰椎(L3、L4、L5)BMD值见 表1。由表1可知，与A组比较，B组的皮质骨及松质骨BMD值均明显降低，股骨近端、股骨 干、第;Γ5腰椎BMD值均明显下降(P<0. 01)；与B组比较，C组和D组的股骨近端、股骨干、 第3飞腰椎BMD值均明显升高(P<0. 01)；而C组的股骨近端、股骨干BMD值与A组接近，D 组的L3、L5 BMD值与A组接近(P>0. 05)。该结果说明MGF和MGF_Ct24E均能有效防止去势 大鼠的骨质丢失，表现出防治骨质疏松的潜在应用价值。表1四组大鼠股骨近端、股骨干、第；Γ5腰椎BMD值(χ士s，g/cm2)
权利要求
1.力生长因子及其E肽在制备治疗骨质疏松或骨缺损的药物中的应用，所述力生长因 子的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示，所述E肽的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。
2.力生长因子及其E肽在制备骨缺损修复材料中的应用，所述力生长因子的氨基酸序 列如SEQ ID No. 1所示，所述E肽的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。
全文摘要
本发明属于生物医药领域，涉及力生长因子(氨基酸序列如SEQ ID No.1所示)及其E肽(氨基酸序列如SEQ ID No.2所示)在制备治疗骨质疏松或骨缺损的药物以及骨缺损修复材料中的应用，可以为临床骨质疏松症的治疗或骨缺损修复提供更多高效、安全的备选药物及材料，满足临床治疗的多方面需求，具有潜在、良好的应用前景。
文档编号A61L27/54GK102068688SQ20101056668
公开日2011年5月25日 申请日期2010年12月1日 优先权日2010年12月1日
发明者张兵兵, 彭琴, 李玉筱, 王远亮, 邓墨渊, 魏小娅 申请人:重庆大学