光热和光动联合抗肿瘤的以叶酸介导的金纳米星为载体的药物传递系统的制备方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及医药，特别是一种光热和光动联合抗肿瘤的以叶酸介导的金纳米星为载体的药物传递系统的制备方法及应用。
【背景技术】
[0002]光热治疗(Photo-thermal Therapy，PTT)是通过加热的方法，改变肿瘤细胞所处环境，使肿瘤细胞变性、坏死，达到治疗目的，例如，各种各样的金纳米结构，包括金纳米棒、纳米壳、纳米笼、空心的纳米球，尤其是分支状的金纳米星，已被证明在近红外区具有表面等离子共振特性，因而通过近红外激光照射产生过高热，从而杀死肿瘤细胞。
[0003]光动力学治疗(Photodynamic Therapy, I3DT)是利用肿瘤细胞选择性吸收光敏剂，然后利用特定波长的非热激光照射病变部位，使肿瘤组织中的光敏剂发生剧烈的光化学反应，从而选择性消灭肿瘤细胞。它是一种无创或微创性、非产热性的、利用光化学反应引起靶组织和靶细胞破坏的治疗方法。金纳米星作为一种优良的光敏剂可在近红外光照射的情况下产生活性氧，包含过氧化物，如H2O2、单线态氧(Singlet Oxygen)、环氧化物(epoxide)等，且其在光照下产生活性氧为高度反应性的，能够表现出明显的细胞毒性，比如使细胞中的DNA断裂，抑制细胞有丝分裂以及生长，还可以抑制细胞蛋白水解酶的活性。由此推断，金纳米星可以用于深部肿瘤组织的光热和光动联合治疗。
[0004]金纳米星因其易大量合成且比表面积大的优势，能够提高包载药物含量，同时，由于生物系统对700-1100nm范围的近红外光具有高度透过性，而金纳米星在此范围内具有高吸收的特性，因此可以利用其在此范围内的光热转换特性对肿瘤进行近红外激光热疗。通过化学修饰金纳米星载抗肿瘤药形成多功能集一体即化学治疗、近红外热疗和光动力学联合治疗的药物传递系统是可能的。
[0005]由于金纳米星在高盐和某些生物分子(核酸、蛋白质等)存在情况下易发生聚集和团聚，稳定性差。为提高金纳米星的稳定性和生物相容性，将巯基化的聚乙二醇和聚醚酰亚胺通过巯基和金形成的硫金键连接于金纳米星表面。将水溶性的具有长循环特性的聚乙二醇连接于金纳米星表面，不但能够利用空间位阻效果，改善金纳米星稳定性，延长体内循环时间，降低毒性，而且聚乙二醇携带的不同侧链结构为金纳米星表面的靶向修饰提供了有效的修饰位点。另外，巯基化聚醚酰亚胺含有较多质子化的多级氨的氮原子，能够在酸性的溶酶体中大量捕获质子，导致溶酶体渗透性肿胀、破裂，进而将内吞的药物迅速释放到细胞质，实现溶酶体逃逸。
[0006]分子靶向治疗是一种新的肿瘤治疗手段，能够特异性地作用于肿瘤发生发展中起关键作用的靶分子，或者利用肿瘤高表达的受体，通过配体将偶联的药物靶向输送到肿瘤细胞，从而达到治疗肿瘤、减少全身毒副作用的目的。叶酸受体是可以介导细胞内吞，将叶酸摄入真核细胞胞浆的一种高亲和力受体，已经作为肿瘤治疗的一个分子靶点进入临床应用研宄，其配体叶酸作为靶向配体，对恶性肿瘤细胞表面过度表达的叶酸受体有高度亲合性，而在绝大多数正常组织中几乎不表达，同时经过修饰的药物载体，是一种特殊的靶向给药系统，可以主动的将药物输送至特异性位点。
[0007]在肿瘤药物研宄中，利用荧光探针标记药物，可以直接在活体水平观察到药物对肿瘤是否靶向、最佳靶向时间以及药物在动物其他器官组织的积累，有利于研宄人员在最佳的时间，进行组织分析。吲哚-5.5-菁-N-羟基琥珀酰亚胺、吲哚菁绿、酞菁等荧光探针不但能够用于活体成像而且能够吸收近红外光，分子中的电子从基态跃迀至激态，随后激发态的分子释放出热，具有热疗效果。常用于活体成像的荧光探针，大多数为传统的有机染料分子，例如吲哚菁绿、酞菁、亚甲蓝、罗丹明、异硫氰酸荧光素，而这些有机染料分子有着其本身的一些缺点，如光稳定性差，灵敏度低和靶向性差等缺陷，因而限制了其进一步的应用。借助靶向纳米粒载体可以克服上述缺陷，对肿瘤的诊断和靶向治疗具有明显优势。
[0008]阿霉素是一种广谱的化疗药物，在临床上常用于治疗乳腺癌，儿童实体瘤，软组织瘤，恶心淋巴癌等恶性肿瘤。近年来的临床研宄发现，阿霉素在临床应用中已出现针对肿瘤细胞的耐药性，同时对于正常组织的细胞毒性限制了其进一步的应用。若长期使用这类药物最常见的毒性为损伤心肌，可诱发充血性心力衰竭。为克服以上不足，直接通过静电吸附作用(Au-N)载阿霉素于金纳米星表面可构建以金纳米星为载体靶向抗肿瘤的药物传递系统。
[0009]目前构建的以金纳米星为载体靶向抗肿瘤的药物传递系统，其作为热敏剂和光敏剂在肿瘤联合治疗中的应用尚未见报道，具有疗效快、副作用小、方法简便等优点。同时，以金纳米星为载体装载近红外荧光染料可以提高荧光染料的稳定性，延长体内成像时间，并通过载体系统赋予其靶向。与染料直接成像方法相比应用范围更广，目前应用主要集中在实验室的动物活体实验阶段。因此，研制具有统计学意义和实际的临床意义上的光热和光动联合抗肿瘤的以叶酸介导的金纳米星为载体的药物传递系统是业内所希望解决的技术冋题。
【发明内容】
[0010]针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种光热和光动联合抗肿瘤的以叶酸介导的金纳米星为载体的药物传递系统的制备方法及应用，可有效解决现有抗肿瘤药物毒副作用大，生物相容性差，靶向性差的问题。
[0011]本发明解决的技术方案是，将金纳米星表面通过共价键连接上具有反应活性的氨基和羧基后，再通过酰胺反应连接靶向分子，得到主动靶向的金纳米星溶液；再通过靶向化合物末端的氨基和近红外荧光探针进行化学反应，得到具有叶酸靶向和近红外荧光成像的金纳米星溶液；然后再直接通过静电吸附作用负载抗肿瘤药物阿霉素于金纳米星表面，即得到叶酸介导的多功能金纳米星用于光热和光动联合抗肿瘤的药物传递系统，阿霉素和金纳米星的质量比为1.5?3:1，具体制备方法如下:
(I)制备氨基化的金纳米星:在18?25°C，300?720r/min的磁力搅拌条件下，加入浓度为50 μ g/mL的金纳米星溶液10?20 mL，然后加入浓度为0.1?10.0 mg/mL的氨基化合物I?5mL，进行避光搅拌反应6?12 h，再10000 rpm高速离心30min，然后用超纯水复溶得到氨基化金纳米星溶液；
所述的氨基化合物为NH2-PEG2000-SH和PE1-SH中的一种或者两种混合物； (2)制备具有靶向性的金纳米星:分别称取叶酸15?20mg、N，N’- 二环己基碳酰亚胺10?15mg、N_轻基琥泊酰亚胺7.5?10.5mg，然后依次加入2.5?5.0 mL反应溶液中，混勾溶解，再进行活化羧基，即在40?50°C、300?720r/min下避光磁力搅拌反应8?24h，然后将所得溶液10000 rpm高速离心30min得沉淀，沉淀用超纯水复溶，加入步骤(I)制备的氨基化金纳米星溶液中进行酰化反应，室温避光搅拌反应12?24h，再10000 rpm高速离心30min，去除游离的小分子，得到末端含有氨基的叶酸靶向金纳米星溶液；
所述的反应溶液是二甲基亚砜、磷酸盐缓冲液(中性)和丙酮中的一种；
(3)制备具有近红外荧光成像和靶向性的金纳米星溶液:取0.01?2 mg荧光探针溶解于0.01?I mL的反应溶剂中，加入步骤(2)制备的叶酸靶向金纳米星溶液中进行酰胺反应，室温避光搅拌反应12?24h，再1000rpm超速离心30min得沉淀，沉淀用超纯水0.01?ImL复溶，得到以金纳米星为载体具有靶向性和近红外荧光成像的抗肿瘤药物传递系统；
所述的荧光探针是吲哚-5-菁(简写为cy5 )、吲哚-5.5-菁(简写为cy5.5 )和吲哚-5.5-菁-N-羟基琥珀酰亚胺(简写为cy5.5-NHS)中的一种；
所述的反应溶剂是二甲基亚砜、磷酸盐缓冲液和丙酮中的一种；
(4)制备负载阿霉素的金纳米星溶液:将步骤(3)制备的具有近红外荧光成像的靶向金纳米星溶液经干燥得粉末，将粉末和阿霉素以质量比1: 1.5?3.0依次加到10?40 mL的反应溶剂中，在氮气保护下，超声溶解，在18?25°C下300-720r/min避光搅拌反应24?48h，得混合溶液，再将得到的混合溶液以1000rpm超速离心30min (去掉未反应的阿霉素和二甲基亚砜)，得沉淀，沉淀用超纯水复溶，干燥即得光热和光动联合抗肿瘤的以叶酸介导的金纳米星为载体的药物传递系统；
所述的干燥为冷冻干燥、真空干燥和烘干中的一种。
[0012]上述制备的光热和光动联合抗肿瘤的以叶酸介导的金纳米星为载体的药物传递系统在制备主动靶向抗肿瘤药物转运载体中的应用，或在制备抗肿瘤光动力或光热治疗的热敏剂中的应用，或在制备近红外激光照射下，触发化学药物靶向快速释放于肿瘤组织药物中的应用，或制备用于光热和光动联合抗肿瘤的药物传递系统在制备生物体