Brca1蛋白在制备逆转肿瘤细胞对mtx耐药性的药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及BRCAl蛋白在制备逆转肿瘤细胞对MTX耐药性的药物中的应用，具体 涉及BRCAl蛋白在制备通过下调DHFR基因扩增进而逆转肿瘤细胞对MTX耐药性的药物中 的应用，属于肿瘤生物治疗技术领域。
【背景技术】
[0002] 氨甲蝶呤（Methotrexate, MTX)是恶性肿瘤治疗中的一个有效的抗代谢 药，是目前肿瘤治疗中应用最广泛的叶酸拮抗剂，能竞争性地结合二氢叶酸还原酶 (Dihydrofolatereductase, DHFR)，抑制核苷酸代谢，从而阻断DNA的合成、特异性地杀伤 增殖期细胞。虽然MTX已成为肿瘤治疗的常用药物，但是，由于长时间的用药会导致耐药性 的产生，从而严重影响药物的疗效，所以克服MTX耐药是提高其肿瘤治疗疗效的关键。
[0003] MTX耐药分为先天耐药和获得性耐药。其中MTX获得性耐药的机制可以概 括为以下三类：第一、还原性叶酸载体（Reduced folate carrier, RFC)的缺失或功 能缺陷致使MTX的摄入量减少；第二、胞内多聚谷氨酸合成酶（Folylpolyglutamate synthetase，FPGS)活性下降或表达降低导致氨甲蝶呤多聚谷氨酸化水平下降，产生耐药； 第三、MTX的靶酶DHFR水平升高导致的耐药，DHFR表达增强通常是由DHFR基因扩增引起 的。
[0004] 基因扩增是指细胞内部某些基因的拷贝数专一性大量增加的现象，是基因组不稳 定性的一种主要形式。基因扩增会形成两种主要的细胞遗传学结构，即染色体外元件双 微体（Double minutes, DMs)及染色体上的异常结构均质染色区（Homogeneous staining regions, HSRs)。1962年，人们首次在结肠癌细胞中发现DMs。DMs是染色体外成对环状，能 自主复制的染色小体。DMs没有着丝粒，在细胞分裂中随机分配，正因为如此，DMs随时面临 着丢失的风险。但是，DMs本身带有的扩增基因或者与耐药相关的基因能为细胞本身提供 生长优势，因此在群体中会出现DMs逐渐增多的现象。人们最早在人神经母细胞瘤细胞系 及耐MTX的中国仓鼠细胞系中发现了均质染色区。应用G显带技术发现一段缺乏典型带纹 的染色体片段，并称其为均质染色区或异常显带区域。
[0005] 研宄发现，包含DHFR耐药基因的DMs数量减少会逆转细胞对MTX的耐药情况。而 目前DMs减少的机制还不十分明确。根据实验室前期结果及相关文献报道，我们推测使DMs 数量减少的原因主要有以下两种：第一，DMs转化为HSRs ;第二，DMs以微核形式外排。目前 研宄表明，微核外排具有典型的细胞周期依赖性，主要发生在Gtl期和M期。因此，细胞周期 进程加快可能导致微核外排量增加，进而促进细胞内DMs数量的减少。
[0006] 基因扩增产生的前提条件是DNA双链断裂（double strands break，DSB)的发生。 在此基础上，细胞对于DSB的修复能力异常增加。DSB修复主要存在两种机制，同源重组修 复（homologous recombination repair，HR)是其中较为精确的修复机制。因此，HR的异 常表达可能会影响肿瘤细胞中基因扩增的程度。
[0007] HR的主要参与蛋白包括：PI3K家族成员ATM、剪切酶复合体MRN(MRE11/RAD50/ NBSl)、BRCA1、BRCA2、RAD51 及其类似物家族、RAD52、RAD54、RecQ 解旋酶等。其中，BRCAl 是重要的核心分子之一。研宄发现，BRCAl不仅可竞争性抑制53BP1，启动HR ;它还能与MRN 复合体相结合完成DNA末端的剪切；促进RAD51的募集以保证链入侵的顺利进行；此外，它 还能够影响细胞周期检查点，是细胞周期的重要调控因子。本研宄针对BRCAl进行干扰后 发现，细胞内DSB累积急剧增加；研宄还发现，干扰BRCAl能够加快细胞周期进程，使含有 DHFR扩增基因的微核外排增多，导致细胞内DHFR基因剂量减少，细胞对MTX的耐药能力降 低，进而逆转肿瘤细胞的耐药情况，为肿瘤治疗提供新的靶点，为有效地对抗MTX耐药提供 科学依据。
【发明内容】
[0008] 针对肿瘤治疗药物MTX在治疗过程中常常产生耐药而导致化疗失败甚至疾病复 发的现象，本发明提供了 BRCAl蛋白在制备逆转肿瘤细胞对MTX耐药性的药物中的应用，具 体涉及BRCAl蛋白在制备通过下调DHFR基因扩增进而逆转肿瘤细胞对MTX耐药性的药物 中的应用。
[0009] 本发明中，优选的，所述肿瘤细胞为对MTX的耐受程度为l(T4mol/LMTX的人结肠癌 细胞。
[0010] 本发明的技术方案是构建人结肠癌细胞系HT29MTX耐药的进化模型，检测BRCAl 在肿瘤细胞耐药过程中是否发挥作用，然后，将BRCAlshRNA和Control shRNA分别转入含 DMs的耐药细胞中，获得稳定克隆，应用MTT，IC5tl分析，流式细胞术，Real-time PCR，FISH， Western Blot等技术方法，检测细胞转染前后的生长、耐药、周期、DSB、DSB修复通路功能和 扩增基因外排等情况，明确BRCAl是否通过参与同源重组修复及细胞周期调控维持基因扩 增，参与细胞耐药。抑制BRCAl后可否外排细胞中的耐药扩增基因，进而逆转肿瘤耐药。
[0011] 我们通过稳定干扰BRCAl，阻断HR修复途径也同时影响了细胞周期，以探宄BRCAl 与基因扩增之间的关系。从而为揭示新的治疗靶点、更加有效对抗MTX耐药提供科学的依 据。
[0012] 1.细胞培养构建进化模型
[0013] 人结肠癌细胞系HT29在含有15%胎牛血清的DMEM高糖培养基中，于5% C02、 37°C条件下，用浓度梯度递增的MTX连续培养，筛选出一系列HT29MTX耐药细胞，并根据 其对 MTX 的耐受程度命名为 HT291(T7mol/L MTX，HT291(T6mol/L MTX，HT291(T5mol/L MTX， HT291(T4mol/L MTX。将HT29MTX敏感细胞命名为HT29MTX S。待每个浓度梯度细胞对相应 药物浓度耐受后，继续培养5个月直至其稳定耐药，然后再用其做后续实验。
[0014] 2. HT29MTX敏感及耐药细胞中DHFR基因扩增程度及扩增形式的变化
[0015] (1)应用QIAmp DNA mini kit试剂盒并按照说明书提供的实验步骤进行所需细胞 系基因组DNA的提取，应用Real-time PCR技术检测HT29MTX敏感及耐药细胞中DHFR基因 的扩增程度。与HT29MTX敏感细胞相比，HT29MTX耐药细胞中DHFR基因扩增程度随着MTX 耐药浓度升高而增加。
[0016] (2)细胞中期核型标本制备，FISH检测DHFR基因扩增形式的变化
[0017] 与HT29MTX敏感细胞相比，基因扩增的形式由HSRs逐步转变为以DMs为主的方 式，尤其当耐药浓度达到l〇_4mol/L时，细胞系中出现以DMs为主的基因扩增形式。因此， 我们选取HT2910_4mol/L MTX耐药细胞作为含DMs的耐药细胞进行后续研宄，并命名为 HT29MTX DMs0
[0018] 3. HT29MTX敏感及耐药细胞中DHFR蛋白表达水平的变化
[0019] 提取细胞总蛋白，应用Western Blotting方法检测HT29MTX敏感及耐药细胞中 DHFR蛋白表达水平。与HT29MTX敏感细胞相比，HT29MTX耐药细胞中DHFR蛋白表达水平随 着MTX耐药浓度升高而增加。
[0020] 4. BRCAl 表达分析
[0021] 提取细胞总蛋白，应用Western Blotting方法检测BRCAl在HT29MTX敏感及含 DMs的耐药细胞中的表达变化。与HT29MTX敏感细胞相比，含DMs的耐药细胞中BRCAl过表 达。
[0022] 5. HT29含DMs的MTX耐药细胞稳定干扰BRCAl克隆的建立
[0023] 确定HT29含DMs的MTX耐药细胞对嘌呤霉素的敏感性，选择适当的嘌呤霉素浓度 作为稳定转染时的药物筛选浓度。将处于对数生长期的HT29含DMs的MTX耐药细胞接种 于6孔板中，每孔细胞3X IO5个。待细胞长至80%时，进行稳定转染。细胞转染分两组进 行：第一组转染质粒BRCAlshRNA ;第二组转染质粒Control shRNA。培养24小时后，加入适 当浓度的嘌呤霉素。在培养过程中，大部分细胞皱缩死亡，只有少数细胞存活，换液，继续培 养。最后，存活细胞开始增殖并逐渐形成单克隆。当形成的克隆达到肉眼可见大小的时候， 进行克隆挑取。HT29含DMs的耐药细胞对照组克隆命名为sh-control，干扰组克隆命名为 sh-BRCAlo
[0024] 6.检测BRCAl蛋白质表达情况鉴定稳定干扰克隆的干扰效果
[0025] 对细胞进行饥饿同步化处理后提取细胞总蛋白，应用Western Blotting方法检测 BRCAl在HT29含DMs的MTX耐药细胞的对照克隆及干扰BRCAl的克隆中的表达情况。经检 测，干扰克隆中BRCAl的表达量明显低于对照克隆中的表达量，证明所挑选的克隆为有效 克隆。
[0026] 7.稳定干扰BRCAl对DSB的产生及细胞功能的影响
[0027] (1)应用Western Blot检测稳定干扰BRCAl前后细胞中γΗ2ΑΧ的表达量，以确定 干扰BRCAl对DSB产生的影响。在ΗΤ29含DMs的耐药细胞中，稳定干扰BRCAl后，细胞内 γΗ2ΑΧ的表达量明显增加。即干扰BRCAl后细胞内的DSB大量累