，HT291(T6mol/L MTX，HT291(T5mol/L MTX，HT291(T4mol/L MTX。HT29MTX 敏感细胞则命名为 HT29MTX S。待 每个浓度梯度细胞对相应药物浓度耐受后，继续培养5个月直至其稳定耐药后，继续后续 实验。
[0064] 用含15%胎牛血清的DMEM高糖培养基培养HT29MTX S，用加入相应浓度MTX的培 养基培养耐药细胞系。所有细胞均培养在5% C02、37°C细胞培养箱中。
[0065] 2. HT29MTX敏感及耐药细胞中DHFR基因扩增程度及扩增形式的变化
[0066] (1)细胞基因组DNA提取
[0067] 应用QIAmp DNA mini kit试剂盒并按照说明书提供的实验步骤进行所需细胞系 基因组DNA的提取。将处于对数期生长期的细胞，用胰酶消化收集细胞（细胞数量不超过 5X IO6个），600转/分钟离心5分钟收集细胞沉淀。PBS冲洗，1000转/分钟离心5分 钟。弃上清，然后将细胞沉淀弹开，加入200 μ L PBS混匀，再加入20 μ L蛋白酶K及200 μ L Buffer AL，涡旋15秒混匀。56°C水浴10分钟后瞬时离心，然后加入200 μ L无水乙醇，涡 旋15秒，8000转/分钟离心1分钟。转移混合物至QIAmpmini离心柱中，8000转/分钟离 心1分钟。将离心柱放在新的2mL收集管上，加500 μ L Buffer AWl，8000转/分钟离心1 分钟。将离心柱放在新的2mL收集管上，加500 μ L Buffer AW2,14000转/分钟离心3分 钟。将离心柱放在新的2mL收集管上，14000转/分钟离心1分钟。将离心柱置于I. 5mL Eppendorf管上，加200 μ L Buffer AE，室温孵育1分钟，8000转/分钟离心1分钟，其中 1.5mL Eppendorf管中收集到的液体即为基因组DNA。应用Nature Gene紫外光分光光度 计测定所提取DNA的浓度，放入-20 °C冰箱储存备用。
[0068] (2)应用Real-time PCR技术检测HT29MTX敏感及耐药细胞中DHFR基因的扩增程 度。
[0069] 20 μ L PCR反应体系：2xLightCycler? 480SYBR Green Master 10 μ L，上下游引 物各为1 μ L (即终浓度为50 μ mol/L)，cDNA模板为2 μ L (即终浓度为IOOng/ μ L)，CldH2O 7 μ L0
[0070] PCR的反应条件为：95°C 6分钟；95°C 20s，Tm 20秒，72°C 20秒，进行45个循环的 反应；融解曲线95°C 5秒，65°C，97°C。
[0071] 每个样本中目的基因的结果均利用内参对照基因 β-ACTIN进行归一化处理，然 后应用配对t检验统计学方法，将目的基因在HT29MTX敏感及耐药细胞中的结果进行比较， 得到的差异结果用倍数表示。确定P值，当P < 〇. 05时，差异具有显著的统计学意义，用* 表示；当P < 0. 01时，差异具有极显著的统计学意义，用**表示。
[0072] (3)细胞中期核型标本制备
[0073] 挑选处于有丝分裂旺盛期的HT29各浓度梯度MTX耐药细胞制备染色体标本。向 培养于50mL培养瓶中处于生长旺盛期的细胞加入10 μ L秋水仙胺（10 μ g/ μ L)，作用1小 时后收获细胞。PBS冲洗，胰酶消化收集细胞，1000转/分钟离心6分钟使细胞沉淀。弃上 清，将细胞沉淀弹开成为细胞悬液，加入9mL37°C预热的KCl低渗液（0. 075mol/L)，37°C低 渗12分钟后，加入ImL新配制的固定液（甲醇：冰醋酸=3:1)预固定1分钟，1620转/分 钟离心7分钟。弃上清，弹开细胞沉淀，IOmL固定液，固定1小时后1620转/分钟离心7分 钟，弃上清，弹匀，加 IOmL固定液固定40分钟后1620转/分钟离心7分钟。弃上清，加入 2mL新配制的固定液（甲醇：冰醋酸=2:1)，吹匀细胞。
[0074] 取预冷的载玻片，将吹匀的细胞悬液滴片。空气中干燥后，镜检，检测是否可做 FISHo
[0075] (4) FISH检测DHFR扩增程度及形式的改变
[0076] a. FISH探针制备及探针沉淀
[0077] 应用Genopure Plasmid Midi Kit试剂盒，按说明书提供方法提取BAC克隆 (RP11-90A9 :DHFR;RP11-91I22 :5号染色体着丝粒）DNA，以所提取的DNA为模板，应用 BioPrime DNA Labeling System试剂盒通过随机引物法标记FISH探针。反应体系：先配 制总体系5 μ L的反应液，其中Random Primer占80%，BAC DNA模板浓度为8 μ g/mL，其 余以H2O补齐。反应液95°C反应10分钟后，立刻置于冰上静置2分钟，之后加入终浓度为 0· 25mmol/L 缺 T 的 dNTP，2% 的 Klenow 和终浓度为 125 μ mol/L 的 dNTP，37°C水浴 3 小时， 加入10%的终止Buffer。用1%琼脂糖凝胶电泳检测产物。
[0078] 反应结束后，进行探针沉淀。反应体系为！Labeled BAC DNA 3 μ L，ssDNA 6 μ L， Human CotI 6 μ L，H2O补齐至50 μ L，醋酸钠（3mol/L) 5 μ L，冷的无水乙醇（-20°C冰箱冷 藏）110 μ L。然后将探针放置-80°C冰箱沉淀20分钟后12000rpm离心10分钟，吸去上清 (200 μ L枪头，勿碰到探针沉淀），110 μ L75%冷乙醇洗涤沉淀。12000rpm离心10分钟，吸 去上清，避光干燥5分钟~10分钟。加9 μ L杂交液，37°C水浴1~2小时，使探针溶解。随 后75°C水浴8分钟进行探针变性，立即置冰上2分钟。最后，37°C水浴30分钟进行探针预 复性。
[0079] b. FISH玻片处理流程
[0080] 用钻石笔将之前滴好的片子标出目标区域（约一个20X20盖玻片大小），随后加 100 μ L RNase工作液于目标区域，盖上PE手套（剪成小块），放在湿盒里，37°C孵育40分 钟。孵育结束后，在室温条件下，用2 X SSC洗3分钟，75 %、85 %、100 %梯度乙醇脱水各3分 钟并用吹风机吹干。每个目标区域加100 μ L胃蛋白酶工作液，盖上手套，放在湿盒里，37°C 孵育15分钟。孵育结束，IXPBS洗5分钟后用1 %多聚甲醛处理10分钟，IXPBS洗5分 钟，75 %、85 %、100 %梯度乙醇脱水各3分钟，吹风机吹干。将玻片放入预热的70 %甲酰胺， 75°C水浴3分钟。最后将玻片放入4°C预冷的2XSSC I、2XSSC II中各洗3分钟，75%、 85 %、100 %梯度乙醇脱水各3分钟。
[0081] c. FISH杂交流程
[0082] 每个目标区域加9 μ L探针，盖上盖玻片（20X 20) ,rubber cement封片；放入湿盒 37°C孵育，隔天收。
[0083] 隔天，揭去Rubber Cement封片剂，将玻片放入44°C水浴预热的50%甲酰胺中，夹 住玻片晃动，使盖玻片脱落，计时15分钟。2XSSC I、2XSSC II各3分钟，75%、85%、100% 乙醇脱水各3分钟，吹干。5yL DAPI复染，24X32盖玻片封片。荧光显微镜下观察。
[0084] 在应用Real-time PCR及FISH技术对HT29MTX敏感及耐药细胞中DHFR基因扩增 程度及扩增形式检测时，发现与HT29MTX敏感细胞相比，HT29MTX耐药细胞中DHFR基因扩 增程度随着MTX耐药浓度升高而增加（图1)、基因扩增的形式由HSRs逐步转变为以DMs为 主的方式。其中，当MTX耐药浓度达到10_ 4mol/L时，细胞内开始出现以DMs为主的扩增形 式（图2)。
[0085] 3. HT29MTX敏感及耐药细胞中DHFR蛋白表达水平的变化
[0086] 提取细胞总蛋白，应用Western Blotting方法检测HT29MTX敏感及各浓度梯度 MTX耐药细胞中DHFR蛋白表达水平的变化。
[0087] a.细胞总蛋白的提取
[0088] 将细胞用预冷的PBS冲洗3次，以去除细胞表面附着的蛋白成份。将细胞培养瓶 放在冰上，吸净残余的PBS。加入适量的细胞裂解液（蛋白酶抑制剂：磷酸酶抑制剂：RIPA buffer的体积比为1:1:10)，用细胞刮刮下细胞并收集于I. 5mL Eppendorf管中，冰上静 置，每10分钟涡旋1次，涡旋3次后，4°C、12000转/分钟离心40分钟，取上清，应用Nature Gene紫外分光光度计测定所提取细胞总蛋白浓度并分装，-80°C保存备用。
[0089] b. SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白质
[0090] 应用30%的凝胶储备液（甲叉双丙烯酰胺：丙烯酰胺=1 :29)制备浓度分别为 10%和5%的SDS-聚丙烯酰胺分离胶及积层胶（表1)。
[0091] 表1聚丙烯酰胺凝胶成分
[0092]
[0093] 取等量蛋白样品，加入5X loading buffer、RIPA buffer将体系调平、混勾，加热 煮沸5~10分钟进行变性后，立即放在冰上，待完全冷却后，瞬时离心后上样。
[0094] 先以80伏特电压电泳至分离胶中出现蛋白质marker的第一条带后，再以110伏 特电压电泳至与待测蛋白分子量相近的蛋白质marker条带达到分离胶中1/3处。
[0095] c.转膜
[0096] 剪取1