一种用于现场快速检测布鲁氏菌的通用型引物与探针以及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及应用重组酶聚合酶扩增-侧流层析试纸条检 测技术（Recombinase Polymerase Amplification and Lateral Flow Dipstick，RPA_LFD) 鉴定布鲁氏菌的通用型引物与探针以及检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 布鲁氏菌病（Brucellosis)是由布鲁氏菌属细菌（牛种、羊种、猪种和犬种布 鲁氏菌等）引起的人畜共患传染病，也是我国法定检疫和净化的重要病原。近年来发病 率呈现逐年上升趋势，尤其是对奶畜危害极大，流产率高达50% -80%，乳、肉产量减少 10% -20%。人感染布病主要是通过接触污染的环境、患病动物的分泌物、体液、尸体或食 入污染动物的产品引起，人感染布病后完全丧失劳动能力，治疗极其困难。根据中国CDC的 布病疫情公布，2012年布病发病人数为39515人，比2011年增长3. 08%，为历年新高。因 此，布鲁氏菌病给社会经济发展与稳定、国家公共卫生安全等构成严重威胁，进行布病的防 控与净化是国家和人类共同的目标。
[0003] 要进行动物布病防控与净化，必须检疫和淘汰阳性感染动物，所以布鲁氏菌病原 学诊断就显得非常重要。目前，对布鲁氏菌病原学的诊断方法主要有细菌分离培养、布鲁氏 菌核酸的分子生物学检测技术等。由于细菌的分离培养要求在P3实验室进行，并且耗时费 力，成功率低。以常规PCR、荧光定量PCR等的分子生物学方法近年来受到人们的青睐，但是 其对仪器设备和条件要求较高，并且易造成气溶胶交叉污染，产生假阳性。虽然恒等温扩增 技术（LAMP)可用于现场检测，但是其反应时间一般在Ih左右，对结果的判定仍然存在人肉 眼的判定误差等问题。因此，亟需建立一种可应用于现场、简易、快速的布鲁氏菌检测技术。
[0004] RPA技术通过三种酶的混合物，即能结合单链核酸（寡核苷酸引物）的重组酶、单 链DNA结合蛋白（SSB)和链置换DNA聚合酶，在常温下也有活性，最佳反应温度在37°C左 右，整个过程一般可在十分钟之内获得可检出水平的扩增产物。RPA检测的灵敏度很高，能 够将痕量级（trace levels)的核酸（尤其是DNA)模板扩增到可以检出的水平，从单个模 板分子得到大约1〇12扩增产物。而且RPA还用不着复杂的样品处理，适用于无法提取核酸 的实地检测。目前，RPA反应可以通过琼脂糖凝胶电泳，荧光扩增曲线和LFD试纸条三种不 同方式检测结果，这三种方式的引物与探针反应原理是不同的。凝胶电泳和荧光扩增曲线 法仍然依赖实验室和特殊仪器设备，而LFD是一种无需特殊仪器可用于现场的方法。
[0005] 在RPA-nfo正反向引物的扩增革巴序列中设id条带FAM标记的特异探针，同时反 向引物用生物素标记，生物素标记的RPA产物与FAM标记的特异探针杂交、FAM标记的特异 探针与抗FAM抗体的金标物结合后，将该免疫复合物滴加到试纸条上，免疫复合物通过层 析膜扩散，扩散到检测线时，生物素标记的扩增产物被生物素配体捕获，形成具有颜色的检 测线，即检测条带。不被捕获的免疫复合物继续扩散到质控线被特异性抗体所捕获，形成具 有颜色的质控线，即对照条带。这样RPA技术与侧流层析技术结合，即RPA-LFD技术，可以 通过侧流层析试纸条（LFD)读取结果，本方法既不要求特殊仪器设备，也无需复杂的样品 处理，仅仅使用普通的加热装置如水浴锅和侧流层析试纸条就可以通过肉眼观察结果。因 此，RPA-LFD技术在布鲁氏菌病的现场诊断方面具有广阔的应用前景。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种特异、灵敏、简易、快速的现场检测布鲁氏菌的RPA-LFD 通用型引物与探针以及含有该引物与探针的试剂盒。
[0007] 为实现本发明目的，本发明用于快速检测布鲁氏菌的RPA-LFD通用型引物与探 针，包括：
[0008] 正向引物：Brucella-RPA-LFD-F :
[0009] 5'-CAAGGTGTTGCTCTTTCTCTTTGTCGTGGGC-3'
[0010] 反向引物：Brucella-RPA-LFD-R :
[0011] 5'-(Biotin)-CGGAACTGTGCTGGTCTGCACCATCGTCTTG-3'
[0012] 探针：BrucelIa-RPA-LFD-LF :
[0013] 5' FAM-CTTTGTCGTGGGCTTCATCGTCGTGCTGCTG (dSpacer)
[0014] TGCTGCTCGTGTTTC-C3-Spacer3'
[0015] 本发明还提供含有上述引物与探针组合的用于检测布鲁氏菌的试剂盒。该试剂 盒中还包括大肠杆菌来源的recA重组酶、链置换DNA聚合酶、单链DNA结合蛋白（SSB)、 rehydration缓冲液、280mM醋酸镁（MgAc)溶液、侧流层析试纸条（特异性检测生物素与 FAM标记基因扩增产物）、PBST试纸条检测缓冲液（I X PBS+0. 1 %吐温20)、灭菌去离子双 蒸水（ddH20)，TE缓冲液、10%(W/ V)SDS、2%(W/V)蛋白酶K、布鲁氏菌标准阳性模板等。
[0016] 本发明进一步提供了一种现场快速检测布鲁氏菌的方法，具体包括以下步骤：
[0017] (1)检测样本DNA的提取或检测样本裂解处理；
[0018] (2)以步骤⑴中处理的样本为模板，进行RPA扩增；
[0019] (3)用侧流层析试纸条检测上述RPA扩增产物，根据检测结果判定样本中是否含 有布鲁氏囷。
[0020] 其中，RPA反应体系为50 yL:
[0021]
[0022] 待测样本基因组DNA或粗裂解产物DNA和CldH2O共13. 2 μ L
[0023] 将上述47. 5 yL混合物加入Twi stAmp nf 〇反应管，充分混匀、溶解，再加入2. 5 yL 醋酸镁溶液，将反应管置于38°C水浴中，处理25min。
[0024] 反应结束后取2 μ L与98 μ L LFD检测缓冲液混合，将LFD浸入上述混合液，5分 钟内观察结果，若同时出现检测条带和对照条带，则该样品布鲁氏菌感染阳性，仅出现对照 条带则说明该样品中不含布鲁氏菌，仅出现检测条带或者无条带则说明RPA-LFD检测不成 立。
[0025] 与现有技术相比，本发明的优点在于：
[0026] (1)本发明提供的RPA-LFD引物与探针组合或试剂盒灵敏性高、特异性强。最低 可以检测6. OX 10°cfu的布鲁氏菌，与大肠杆菌0157:H7、小肠结肠炎耶尔森菌0:9、沙门氏 菌、金黄色葡萄球菌等细菌均无交叉反应。
[0027] (2)本发明提供的RPA-LFD引物与探针组合或试剂盒不仅可用于布鲁氏菌菌株检 测，还可用于临床样本的检测。临床样本主要包括血液、奶样、气溶胶样本、组织样本等。
[0028] (3)本发明提供的RPA-LFD检测方法使用方便，无需特殊仪器设备，仅仅在38°C 下，25min就能对待测样本的粗裂解产物进行布鲁氏菌的灵敏、特异、快速地检测，适合现场 或基层布病检疫工作。
【附图说明】
[0029] 图1布鲁氏菌RPA-LFD引物与探针的筛选结果，Control Primer/Probe Mix扩增 组为TwistAmp nfo kit提供的引物、探针与模板的RPA扩增结果对照；Brucella-RPA-LFD 组为本发明筛选出的特异性检测布鲁氏菌的通用型引物与探针的扩增结果；NTC是以CldH2O 代替模板的阴性对照。
[0030] 图2布鲁氏菌RPA-LFD灵敏性检测，模板分别为6 X 108cfu-6 X KT1Cfu牛种布鲁 氏菌A19疫苗株基因组DNA，NTC是以CldH2O代替模板的阴性对照组。
[0031] 图 3 布鲁氏菌 RPA-LFD 特异性检测，B. abortus、B. melitensis、B. suis、B. ovis、 B. canis、E. coli 0157:Η7、Υ· enterocolitica 0:9、Salmonella、S. aureus 的模板分别为牛 种布鲁氏菌疫苗株A19株、羊种布鲁氏菌疫苗株M5-90株、猪种布鲁氏菌株疫苗株S2株、绵 羊种布鲁氏菌63/290株、犬布鲁氏菌RM6/66株、大肠杆菌0157:H7、小肠结肠炎耶尔森菌 0:9、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌基因组DNA ;NTC是以CldH2O代替模板的阴性对照组。
[0032] 图4临床样本布鲁氏菌的RPA-LFD检测，+ :模板为牛种布鲁氏菌A19疫苗株基因 组DNA，一：以CldH2O代替模板的阴性对照组，1-12 :布鲁氏菌核酸阳性血液样本，13-22 :布 鲁氏菌核酸阳性奶样样本，23 :布鲁氏菌核酸阳性流产胎儿样本，24 :布鲁氏菌核酸阳性气 溶胶样本，25-26 :布鲁氏菌核酸阴性血液样本，27-28 :布鲁氏菌核酸阴性奶样样本。
【具体实施方式】
[0033] 下述实施例用于进一步说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0034] 以下实施例均按照常规试验条件与方法进行，或者按照制造厂商所建议的试验条 件。
[0035] 1.试验材料
[0036] 牛种布鲁氏菌疫苗株A19株（B. abortus A19)，羊种布鲁氏菌疫苗株M5-90株 (B.melitensis M5-90)，猪种布鲁氏菌株疫苗株S2株（B.suis S2)，绵羊种布鲁氏菌 63/290 株（B. ovis 63/290)，犬布鲁氏菌 RM6/66 株（B.canis RM6/66)，大肠杆菌 0157:H7、 小肠结肠炎耶尔森菌0:9、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌（CMCC26003)均由山东省农业科学院 奶牛研宄中心疾病研宄室保存。
[0037] 引物与探针由上海生工生物有限公司合成。TwistAmp DNA Amplif